Композиции для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной вирусом вич-1

Композиции для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной вирусом вич-1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к предупреждению и к лечению инфекции индивидуумов, вызванной вирусом ВИЧ-1 (вирус иммунодефицита человека).

Предшествующий уровень техники

Примерно 90% ВИЧ-инфекций человека вызвано вирусом ВИЧ-1. Вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) характеризуется сильной генетической изменчивостью, вызванной накоплением мутаций, возникающих в течение репликации вируса, и также вызванной явлениями рекомбинации. Отсутствие результата в течение длительного периода химиотерапевтических методов лечения ВИЧ в значительной степени объясняется высокой мутагенной активностью вирусных штаммов ВИЧ-1. Ранее было показано, что устойчивые разновидности вируса быстро возникали у пациентов после разных курсов антиретровирусной терапии и даже после терапии с использованием многих лекарственных средств (HAART-высокоактивная антиретровирусная терапия). Эти устойчивые вирусы несут определенные изменения в конформации и структуре своих белков. Обычно такие мутации, ответственные за уклонение ВИЧ-1 от современных способов лечения, сохраняются в последующих поколениях вируса и накапливаются как результат селекции в условиях лечения.

Лечение лекарственными средствами против ВИЧ-1 полностью не блокирует репликацию вируса, что делает возможным отбор и накопление заранее существующих мутаций, ассоциированных с устойчивостью, а также вновь возникающих мутаций, таким образом, давая возможность вирусу продолжать распространяться. Существующие антиретровирусные лекарственные средства (NRTI (нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы), NNRTI (ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы) ингибиторы протеаз, ингибиторы слияния и их смеси, подобно HAART) могут только замедлить репликацию ВИЧ-1 в течение более или менее продолжительного периода времени, до возникновения и репродукции устойчивых вирусных штаммов. Широкое распространение устойчивых разновидностей ВИЧ-1 вызывает серьезные опасения и требует наличия дополнительных терапевтических средств против ВИЧ-1.

Были рассмотрены разные терапевтические стратегии против ВИЧ, отличающиеся от терапевтических стратегий против ВИЧ с применением химических антиретровирусных веществ, которые включают (i) применение антител против ВИЧ, (ii) вакцины на основе частиц разрушенного вируса ВИЧ, (iii) вакцины на основе пептидов ВИЧ и (iv) вакцины на основе ДНК плазмиды или вирусного вектора, причем каждая имеет свои конкретные недостатки.

Так как пандемия ВИЧ продолжает инфицировать миллионы людей каждый год, возрастает потребность в эффективной вакцине. Развитие вакцин против ВИЧ было сильно замедлено вследствие сложности, возникающей при разработке иммуногенного продукта, способного вызывать образование нейтрализующих антител против ВИЧ широкого спектра действия.

Индуцирование образования нейтрализующих антител широкого спектра действия (bNAb) против первичных изолятов вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) остается главной и нереализованной задачей при исследовании вакцины против СПИДа (синдром приобретенного иммунодефицита). Ранние попытки использования вакцин на основе капсул приводили к образованию антител, которые являются эффективными только против изолятов, адаптированных для использования в лаборатории. В этих примерах защита коррелировала с высоким титром bNAb, направленных на гипервариабельную область V3 gp120. Однако образованное нейтрализующее действие является главным образом специфичным по отношению к изоляту и является минимально эффективным по отношению к большинству первичных изолятов ВИЧ-1. Неспособность вакцин на основе субъединицы gp120 защищать от инфицирования ВИЧ-1 на Фазе III клинических испытаний подчеркивает сложность задачи.

Тем не менее, bNAb может быть часто обнаружено у ВИЧ-инфицированных индивидуумов. Ответы, вызванные рано при инфицировании, обычно являются узкоспецифичными, нейтрализуя распространяющиеся в хозяине вирусы, но не совпадающими во времени. Такие ответы распространяются в течение инфицирования у некоторых долгожителей, которые способны контролировать свою инфекцию в отсутствие антивирусного лечения. Однако, природа ответа, заключающегося в образовании перекрестно-нейтрализующих антител, и механизмы, приводящие к его возникновению, не поняты.

В естественных условиях NAb против Env (ген белка оболочки) образуются в пределах недель после инфицирования, но данный ранний ответ является эффективным только против определенного вирусного подтипа; однако bNAb (перекрестно-реагирующие нейтрализующие антитела) могут вырабатываться в течение развития ВИЧ. Недавно в нескольких масштабных исследованиях было показано, что приблизительно 25% ВИЧ-инфицированных пациентов (инфицированных в течение по меньшей мере 1 года) имеют ответ в виде образования bNAb, и 1% «элитных нейтрализующих агентов» с очень высокой активностью против большинства клад. Важно отметить, данные результаты демонстрируют способность иммунной системы инфицированных индивидуумов к образованию Nab in vivo против ВИЧ-1, в течение развития заболевания. Они также наводят на мысль о том, что активность Nab, реагирующих в широкой области, по-видимому, развивается со временем, и ей благоприятствует продолжительная антигенная стимуляция, в отсутствие знания о титре bNAb, который был бы защитным.

Постоянная репликация вируса с низким уровнем помех приводит к постоянной эволюции Env для уклонения от NAb. Такая антигенная эволюция может сосредотачивать внимание на новой стратегии вакцинации на основе более консервативной области белка Env и наводит на мысль о том, что иммуногены вакцины могли бы быть предназначены для имитации ключевых, высококонсервативных эпитопов.

Одной из главных проблем разработки эффективных вакцин против ВИЧ было то, что мишенью bNAb является белок вирусной оболочки (Env), который является высоковариабельным, тогда как консервативные элементы, по-видимому, являются слабоиммунногенными. Это означает, что кинетические и пространственные ограничения затрудняют доступ bNAb к потенциально чувствительным сайтам во время связывания с рецептором и процессов слияния. На самом деле было описано небольшое количество NAb. Например, первым идентифицированным bNAb был b12, который закрывает сайт связывания CD4 на gp120 и предотвращает прикрепление CD4. Субъединица gp41 является гораздо более консервативной, чем gp120, включая конформационные перестройки, характерна для всех штаммов. Очень низкую bNAb активность выявляют по отношению к консервативным структурным элементам gp41, которые защищены, труднодоступны или являются неустойчивыми; данные bNAb, включая 2F5 и 4Е10, нацелены на ближайшую к мембране эктодоменную область (MPER) gp41. Однако иммунизация данными ключевыми эпитопами не приводила в результате к образованию активности bNAb. Данное раздвоение между антигенными и иммунологическими характеристиками все еще не понято.

В данной области все еще существует необходимость в терапевтических средствах, нацеленных на предупреждение или лечение инфекции, вызванной вирусом ВИЧ-1.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей антигенный пептид нижеприведенной формулы (I):

N t − S − X 1 − X 2 − X 3 − K − X 4 − C t    (I) [Nt-SEQ ID №1-Ct], где

- Nt состоит из пептида, имеющего от 0 до 100 аминокислот в длину,

- Ct состоит из пептида, имеющего от 0 до 100 аминокислот в длину,

- каждый из Х1-Х4 состоит из аминокислотного остатка, где:

- (i) X1 обозначает конкретную аминокислоту W, или (ii) X1 обозначает любой аминокислотный остаток, за исключением W,

- (i) X2 обозначает конкретную аминокислоту S, или (ii) X2 обозначает любой аминокислотный остаток, за исключением S,

- (i) Х3 обозначает конкретную аминокислоту N, или (ii) X3 обозначает любой аминокислотный остаток, за исключением N,

- (i) X4 обозначает конкретную аминокислоту S, или (ii) X4 обозначает любой аминокислотный остаток, за исключением S,

при условии, что

- три из четырех аминокислотных остатков X1, X2, Х3 и X4 обозначают конкретную аминокислоту, определенную выше в их соответствующем значении (i), и

- оставшийся аминокислотный остаток среди Х1-Х4 обозначает любой аминокислотный остаток, за исключением конкретного аминокислотного остатка, определенного в своем значении (i),

при условии, что пептид формулы (I) не обозначает пептид SEQ ID №18, раскрытый в заявке РСТ, поданной 22 июня 2010 года под №PCT/US2010/001784 и опубликованной 13 января 2011 года под № WO 2011/005289 от имени Президента и Членов совета Гарвардского колледжа.

Данное изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей антигенный пептид формулы (I), как описано выше, для применения в качестве лекарственного средства.

Настоящее изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей антигенный пептид формулы (I), как описано выше, для применения в способе предупреждения и/или лечения инфекции индивидуума, вызванной вирусом ВИЧ-1.

Данное изобретение также относится к применению иммуногенной композиции, содержащей антигенный пептид формулы (I), как описано выше, для изготовления лекарственного средства для предупреждения и/или лечения инфекции индивидуума, вызванной вирусом ВИЧ-1.

В определенных воплощениях значение (ii) одного или более чем одного из Х1, Х2, Х3 и Х4 независимо друг от друга выбрано из группы аминокислотных остатков, состоящей из цистеина (Cys или С), аланина (Ala или А), глицина (Gly или G) и валина (Val или V), пролина (Pro или Р) и, наиболее предпочтительно, аланина.

В определенных воплощениях только один из Х1-Х4 обозначает аминокислотный остаток, отличающийся от W (для Х1), S (для Х2), N (для Х3) и S (для Х4) соответственно.

В определенных воплощениях антигенный пептид формулы (I) выбран из группы, состоящей из:

- PWNASASNKSLDDIW (SEQ ID №12),

- PWNASWANKSLDDIW (SEQ ID №13),

- PWNASWSAKSLDDIW (SEQ ID №14), и

- PWNASWSNKALDDIW (SEQ ID №15).

Данное изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей антигенный пептид формулы (I).

В определенных воплощениях антигенный пептид формулы (I) ковалентно связан с молекулой-носителем.

В определенных воплощениях указанной иммуногенной композиции антигенный пептид формулы (I), возможно связанный с молекулой-носителем, объединен с одним или более чем одним иммуноадъювантом.

Настоящее изобретение также относится к пептиду формулы (I), как описано в настоящем описании.

Изобретение также относится к применению антител, действие которых направлено против пептида формулы (I), при изготовлении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения индивидуума, инфицированного вирусом ВИЧ-1.

Данное изобретение также относится к антителам, действие которых направлено против пептида вышеуказанной формулы (I).

Данное изобретение также относится к способам диагностики ВИЧ-1, а также наборам для диагностики ВИЧ-1, в которых применяется пептид формулы (I).

Данное изобретение также относится к способам прогнозирования ВИЧ-1, а также наборам для прогнозирования ВИЧ-1, в которых применяется пептид формулы (I).

Оно также относится к способам мониторинга состояния ВИЧ-1 инфекции, при которых применяется пептид формулы (I), особенно у пациентов, которые находятся на терапевтическом лечении ВИЧ-1 инфекции, а также наборам для осуществления таких способов мониторинга.

Описание графических материалов

Фиг.1. Выравнивание аминокислотных последовательностей нескольких пептидов формулы (I).

Дикий тип: аминокислотная последовательность, содержащаяся в белке gp41 штамма НХВ2 ВИЧ-1, которая может также называться «3S».

S613A (М1) и K617A (М5): аминокислотные последовательности, имеющие высокую аминокислотную идентичность с указанным выше «Диким типом».

W614A, S615A, N616A и S618A: конкретные воплощения пептида формулы (I).

Фиг.2. Инфицирующая способность ВИЧ-1 вируса NL4.3, содержащего аланиновую замену в мотиве 3S/gp41.

Клетки МТ-2 инфицировали 100 нг/мл р24 эквивалентного антигена из дикого типа (WT, белые столбики на диаграмме) или мутированных по аланину 3S/gp41 (черные столбики на диаграмме) вирусов NL4.3.

(A) р24 антиген количественно определяли на день-6 после инфицирования. Результаты, выраженные в относительных единицах по отношению к дикому типу, представляют среднее ±SD (стандартное отклонение) от трех до семи независимых препаратов клона плазмиды, в зависимости от мутантов.

(Б) Образование синцития количественно определяли на день-4 после инфицирования посредством стандартной фазово-контрастной микроскопии. Результаты, выраженные в относительных единицах по отношению к дикому типу, представляют среднее ±SD (стандартное отклонение) от двух до четырех отдельных препаратов клона плазмиды, в зависимости от мутантов.

(B) Изучение кинетики продукции р24 антигена в клеточном супернатанте первичных CD4⁺ Т клеток, инфицированных диким типом (WT, ×), или мутированным по аланину 3S/gp41 NL4.3 вирусом, включая S613A (■), W614A (Δ), S615A (◇), N616A (Ο), K617A (•) и S618A (□). Данный эксперимент соответствует 2 независимым экспериментам, проведенным с отдельными препаратами клона плазмиды на очищенных клетках CD4⁺ Т от двух независимых здоровых доноров.

(Г) Инфицирующая способность Hela клеток Р4С5 диким типом (WT, белые столбики на диаграмме) или мутированным по аланину 3S/gp41 (черные столбики на диаграмме) NL4.3 вирусом. Клетки инфицировали в трех параллельных повторностях 4 нг/15000 клеток эквивалентного антигена р24 в течение 48 ч, а активность β-галактозидазы определяли в клеточных экстрактах. Результаты, выраженные в относительных единицах относительно дикого типа, представляют среднее ±SD от трех до четырех независимых препаратов клона плазмиды. Мутированные по аланину вирусы NL4.3 называются: S613A, W614A, S615A, N616A, K617A и S618A.

Фиг.3. Экспрессия NKp44L в CD4⁺ Т клетках и дегрануляция NK (естественный киллер) клеток, опосредованная 3S/gp41 мутантами по аланину.

(А) Очищенные клетки CD4⁺ Т не инфицировали (пунктирные линии), инфицировали на протяжении ночи диким типом (WT) (черные линии) или разным мутированным по аланину вирусом NL4.3. Клетки окрашивали лигандами для NCR (естественный рецептор цитотоксичности) (NKp30-Ig, NKp44-Ig или NKp46-Ig белки слияния). Пороговое значение на гистограммах устанавливали по CD4⁺ Т-клеткам. Наложение показывает экспрессию лигандов NCR на ВИЧ-инфицированных клетках по сравнению с неинфицированными клетками. Числа соответствуют доле CD4⁺ Т-клеток, экспрессирующих лиганды NCR.

(Б) Экспрессия NKp44L на очищенных CD4⁺ Т клетках, которых не обрабатывали (UT) или обрабатывали пептидами из дикого типа (WT) или с мутированными по аланину синтетическими пептидами 3S/gp41 мотива 3S/gp41. Клетки или окрашивали или mAb (моноклональное антитело) против NKp44L или изотипическим контролем IgM (иммуноглобулин) (пунктирные линии). Пороговое значение на гистограммах устанавливали по подгруппе CD4⁺. Наложение показывает экспрессию NKp44L по сравнению с изотипическим контролем. Числа соответствуют доле CD4⁺ Т-клеток, экспрессирующих NKp44L.

(В) Активность дегрануляции оценивали на активированных IL (интерлейкин 2) клетках NK (естественная клетка-киллер) против аутологических клеток CD4⁺ Т, при Е/Т соотношении: 1/1, в присутствии mAb против CD107a. Очищенные клетки CD4⁺ Т не инфицировали (NI) или инфицировали ночью диким типом (WT) или мутированными по аланину 3S/gp41 вирусами NL4.3. На точечном графике откладывали число NK клеток CD3^-CD56⁺ в зависимости от экспрессии NKp44 и CD107a. Число на каждой панели соответствует доле позитивных NK клеток.

(Г) Эффективность дегрануляции NK клеток против аутологических очищенных CD4⁺ Т клеток при соотношении Е/Т: 1/1, в присутствии mAb против CD107a. CD4⁺ Т клетки не обрабатывали (UT) или обрабатывали пептидами от дикого типа (WT) или мутированными по аланину синтетическими пептидами мотива 3S/gp41. CD4⁺ Т клетки инкубировали с аутологическими NK клетками, активированными IL2. Пороговое значение на гистограммах устанавливали по клеткам NK CD3^-CD56⁺, экспрессирующим NKp44. Наложение показывает экспрессию CD107a клетками NK, анализируемыми в присутствии аутологических клеток CD4⁺ Т, обработанных либо диким типом (WT), либо синтетическими пептидами 3S/gp41 с мутацией по аланину, по сравнению с необработанными клетками. Числа соответствуют доле клеток NK, экспрессирующих CD107a. Мутированные по аланину вирусы NL4.3 вирусы или пептиды 3S/gp41 называются S613A, W614A, S615A, N616A, K617A и S618A.

Фиг.4. Нейтрализация вирусной инфекции и ингибирование NKp44L на CD4⁺ Т клетках и дегрануляции клеток NK с помощью мышиных Ig, образующихся в определенных мутантах 3S/gp41 по аланину.

Очищенные клетки CD4⁺ Т инфицировали NL4.3 (левая панель) или NDK (правая панель) компетентными вирусами, предварительно инкубированными в течение 30 мин с очищенным Ig, полученным из мышей, иммунизированных только адъювантом (Ig-Adj, ), диким типом (WT, ×) или мутированным по аланину 3S/gp41 вирусом NL4.3, включая S613A (■), W614A (∆), S615A (◇), N616A (Ο), K617A (•) и S618A (□).

(A) Компетентные вирусы (200TCID₅₀) инкубировали с очищенным Ig в разной концентрации, находящейся в интервале от 0 до 20 мкг/мл, в течение 30 мин с последующим добавлением РНА (фитогемагглютинин)-активированных очищенных CD4⁺ Т клеток. На 6 день после инфицирования р24 антиген определяли количественно в клеточном супернатанте.

(Б) Воздействие, зависящее от времени. Компетентные вирусы (200TCID₅₀) инкубировали с 10 мкг/мл Ig в течение 30 мин с последующим добавлением РНА-активированных очищенных CD4⁺ Т клеток. Уровень р24 анализировали в клеточном супернатанте каждые 2 дня в течение 10 дней после инфицирования.

(B) Экспрессию NKp44L на CD4⁺ Т определяли через 17 ч после инфицирования. На гистограммах откладывали подгруппу клеток CD4⁺. Показанная методом наложения экспрессия NKp44L по сравнению с изотипическим контролем IgM. Числа соответствуют доле позитивных клеток.

(Г) Дегрануляция аутологических NK клеток. CD4⁺ Т клетки инкубировали с аутологическими NK клетками при соотношении Е/T: 1/1 в присутствии mAb против CD107a. На точечном графике откладывали число клеток NK CD3^-CD56⁺ в зависимости от экспрессии NKp44 и CD107a. Число на каждой панели соответствует доли позитивных клеток. Мутированные по аланину вирусы NL4.3 или пептиды 3S/gp41 называют S613A, W614A, S615A, N616A, K617A и S618A.

Фиг.5. Нейтрализация вирусной инфекции и ингибирование NKp44L на CD4+ клетках и дегрануляции клеток NK посредством иммунопреципитированного антитела к W614A, выделенного из ВИЧ-инфицированных пациентов.

РНА-активированные CD4⁺ Т клетки инфицировали NL4.3 (левая панель) или NDK (правая панель) компетентными вирусами, предварительно инкубированными в течение 30 мин с моноклональным антителом к 3-S-WT (Anti-3S, Ο), с очищенным иммуносорбционным методом антителом к 3S-WT, полученным от 1 ВИЧ-инфицированного пациента (#117, □) или с очищенным иммуносорбционным методом антителом к 3S-W614A, полученным от 5 ВИЧ-инфицированных пациентов: #24 (•), #44 (■), #65 (▲), #71 (▼) и #109 (♦).

(A) Компетентные вирусы (200TCID₅₀) инкубировали с очищенным иммуносорбционным методом антителом в разной концентрации, находящейся в интервале от 0 до 2 мкг/мл, в течение 30 мин с последующим добавлением CD4⁺ Т клеток. На День 6 после инфицирования антиген р24 определяли количественно в клеточном супернатанте.

(Б) Воздействие, зависящее от времени. Компетентные вирусы (200TCID₅₀) инкубировали с 1 мкг/мл очищенного иммуносорбционным методом Ab в течение 30 мин с последующим добавлением РНА-активированных очищенных CD4⁺ Т клеток. Уровень р24 анализировали в клеточном супернатанте каждые 2 дня в течение 10 дней после инфицирования.

(B) Экспрессию NKp44L на клетках CD4⁺ Т определяли через 17 ч после инфицирования. На гистограммах откладывали подгруппу клеток CD4⁺ Т. Показанная методом наложения экспрессия NKp44L по сравнению с изотипическим контролем IgM. Числа соответствуют доле позитивных клеток.

(Г) Дегрануляция аутологических NK клеток. CD4⁺ Т клетки инкубировали с аутологическими NK клетками при соотношении Е/Т: 1/1 в присутствии mAb против CD107a. На точечном графике отложено число клеток NK CD3^-CD56⁺ в зависимости от экспрессии NKp44 и CD107a. Число на каждой панели соответствует доле позитивных клеток NK. Мутированные по аланину вирусы NL4.3 или пептиды 3S/gp41 называют S613A, W614A, S615A, N616A, K617A и S618A.

Фиг.6. Экспрессия NKp44L и дегрануляция аутологических клеток NK, опосредованная инактивированными нагреванием мутантами по аланину 3S/gp41 на клетках CD4⁺ Т.

Очищенные клетки CD4⁺ Т не обрабатывали или обрабатывали на протяжении ночи 100 нг р24 эквивалентного антигена на 1 мл инактивированного нагреванием вируса дикого типа (WT) NL4.3 или с разными мутантами по аланину вирусов 3S/gp41.

(А) Экспрессию NKp44L на CD4⁺ Т определяли через 17 ч после инфицирования. Пороговое значение на гистограммах устанавливали по подгруппе клеток CD4⁺ Т. Наложение показывает экспрессию NKp44L по сравнению с изотипическим контролем IgM. Числа соответствуют доле позитивных клеток.

(Б) Дегрануляция аутологических NK клеток. CD4⁺ Т клетки инкубировали с аутологическими NK клетками при соотношении Е/T: 1/1 в присутствии mAb против CD107a. На точечном графике отложено число клеток NK CD3^-CD56⁺ в зависимости от экспрессии NKp44 и CD107a. Число на каждой панели соответствует доле позитивных клеток NK. Мутированные по аланину вирусы NL4.3 или пептиды 3S/gp41 называют S613A, W614A, S615A, N616A, K617A и S618A.

Подробное описание изобретения

Согласно настоящему изобретению главным образом предложены иммуногенные композиции или вакцинные композиции против ВИЧ-1, где иммуногенные композиции или композиции вакцины содержат конкретные антигенные пептиды, делающие, в частности, возможной индукцию образования нейтрализующих антител против ВИЧ-1 широкого спектра действия.

В идеальном случае эффективная ВИЧ-1 вакцина полностью блокирует инфекцию. В действительности может быть более реалистичным разработать близкую к оптимальной безопасную и эффективную вакцину, которая как значительно снижает инфицирование, так и предотвращает элиминацию CD4⁺ Т клеток. Главная цель данной стратегии связана со способностью генерировать образование нейтрализующих антител широкого спектра действия (bNAb), обладающих также способностью действовать на элиминацию CD4⁺ Т клеток, что казалось непреодолимым на предшествующем уровне техники.

Таким образом, согласно настоящему изобретению предложены новые вещества и композиции для предупреждения и/или лечения инфекции организма млекопитающего, предпочтительно человека, вызванной вирусом ВИЧ-1.

Согласно изобретению обнаружили, что семейство конкретных пептидов, которые разделяют высокую идентичность последовательности с известным gp41-производным пептидом под названием «3S», вызывают in vivo продукцию bNAb против ВИЧ-1.

В данном документе показано, что данные конкретные пептиды вызывают высокую нейтрализующую активность и нейтрализующую активность широкого спектра действия против разных клинических изолятов вируса ВИЧ-1 по сравнению с известными пептидами, происходящими от gp41 белка ВИЧ-1, включая известный пептид «3S», приведенный выше.

Очень важным является то, что согласно изобретению было также обнаружено, что данные конкретные пептиды не инициируют чувствительность CD4⁺ Т клеток к лизису, осуществляемому клетками NK, несмотря на то, что полная функциональность клеток NK, включая дегрануляцию, остается неизменной.

Кроме того, показали, что антитела к данным конкретным пептидам блокируют чувствительность CD4⁺ Т клеток к лизису, осуществляемому NK клетками, который стимулируется при развитии инфекции, вызванной вирусом ВИЧ-1.

Настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей антигенный пептид нижеприведенной формулы (I):

N t − S − X 1 − X 2 − X 3 − K − X 4 − C t    (I) [Nt-SEQ ID №1-Ct], где

- Nt состоит из пептида, имеющего от 0 до 100 аминокислот в длину,

- Ct состоит из пептида, имеющего от 0 до 100 аминокислот в длину,

- каждый из Х1-Х4 состоит из аминокислотного остатка, где:

- (i) X1 обозначает конкретную аминокислоту W, или (ii) X1 обозначает любой аминокислотный остаток, за исключением W,

- (i) X2 обозначает конкретную аминокислоту S, или (ii) X2 обозначает любой аминокислотный остаток, за исключением S,

- (i) Х3 обозначает конкретную аминокислоту N, или (ii) X3 обозначает любой аминокислотный остаток, за исключением N,

- (i) X4 обозначает конкретную аминокислоту S, или (ii) X4 обозначает любой аминокислотный остаток, за исключением S,

при условии, что

- три из четырех аминокислотных остатков Х1, Х2, Х3 и Х4 обозначают конкретную аминокислоту, определенную в их соответствующем значении (i) выше, и

- оставшийся аминокислотный остаток среди Х1-Х4 обозначает любой аминокислотный остаток, за исключением конкретного аминокислотного остатка, определенного в своем значении (i),

при условии, что пептид формулы (I) не обозначает пептид SEQ ID №18, раскрытый в заявке РСТ, опубликованной как WO 2011/005289.

Пептид SEQ ID №18, описанный в заявке РСТ, опубликованной как WO 2011/005289, имеет следующую аминокислотную последовательность: "Ас-NHNHRIRTNPAIVK(Ac)TENSWSNKAKSICQQQ-NH₂" (SEQ ID №16 настоящей заявки на патент).

Nt пептид, имеющий от 0 до 100 аминокислотных остатков в длину, охватывает пептиды, имеющие 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 и 100 аминокислотных остатков в длину.

Ct пептид, имеющий от 0 до 100 аминокислотных остатков в длину, охватывает пептиды, имеющие 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 и 100 аминокислотных остатков в длину.

Как уже упоминалось выше, пептид формулы (I) при применении в иммуногенной композиции, предпочтительно в комбинации с одним или более чем одним иммуноадъювантом, вызывает продукцию антител, которые блокируют инфицирование CD4⁺ Т клеток вирусами ВИЧ-1 и/или блокируют распространение вируса ВИЧ-1 на неинфицированные CD4⁺ Т клетки, как показано, почти необнаруживаемой продукцией р24 CD4⁺ Т клетками, приведенными в контакт как с вирусами ВИЧ-1, так и антителами, направленными против пептида формулы (I).

Дополнительно, в отличие от других ВИЧ-производных пептидов, которые применяли в данной области в качестве ВИЧ антигенов, включая «3S» пептид (показано на фиг.1), пептид формулы (I) не инициирует экспрессию NKp44L на поверхности CD4⁺ Т клеток и таким образом не инициирует разрушение CD4⁺ Т клеток клетками NK.

Более того, антитела, образованные у индивидуума, иммунизированного пептидом формулы (I), способны блокировать опосредованный NKp44L лизис CD4⁺ Т клеток, осуществляемый NK клетками, без нарушения любой другой функции NK клеток, которая включает дегрануляцию.

Таким образом, согласно настоящему изобретению предложено высокоэффективное терапевтическое средство, которое можно применять для профилактики и для лечения инфекции, вызванной вирусом ВИЧ-1.

Иммуногенная композиция, которую применяют согласно изобретению, содержит антигенный пептид формулы (I), который при введении указанной иммуногенной композиции индивидууму увеличивает продукцию антител, направленных против указанного пептида формулы (I), которые наделены нейтрализующими свойствами по отношению к множеству клинических изолятов ВИЧ-1, как показано в примерах в данном документе. Как проиллюстрировано дополнительно в настоящем описании, антигенный пептид формулы (I) может быть переведен в иммуногенное состояние посредством соединения с молекулой-носителем и/или посредством комбинации с одним или более чем одним иммунным адъювантом.

Иммуногенную композицию, содержащую полипептид формулы (I), можно применять профилактически против инфекции, вызванной вирусом ВИЧ-1, вызывая образование антител, которые сильно снижают или даже блокируют инфицирование CD4 клеток указанным вирусом ВИЧ-1.

Иммуногенную композицию, содержащую полипептид формулы (I), можно применять в целях лечения инфицированного ВИЧ-1 индивидуума, вызывая образование антител, которые сильно снижают или даже блокируют инфицирование CD4+ Т клеток вирусами ВИЧ-1, которые уже реплицировались в инфицированном индивидууме.

Как показано в примерах в данном документе, антитела против ВИЧ-1, которые получают после иммунизации млекопитающего иммуногенной композицией, содержащей антигенный пептид формулы (I), состоят из нейтрализующих антител, которые могут обладать IC₅₀ (полумаксимальная ингибирующая концентрация) менее чем 20 мкг/мл, в анализе CD4+ Т клеток-р24.

Обычно анализ CD4+ Т клеток-р24 включает стадии:

а) получения тестируемой смеси посредством приведения компетентного по отношению к репликации вируса ВИЧ-1 в контакт с известным количеством антител, подлежащих тестированию,

б) инкубирования РНА-активированных CD4+ Т клеток с тестируемой смесью, полученной в конце стадии а), в присутствии IL-2 и

в) определения активности р24 в клеточных культурах CD4+ Т, полученных в конце стадии б), и

г) определения значения IC₅₀ тестируемых антител посредством сравнения активности р24, определенной на стадии в), для известного количества антител, добавленных на стадии а), с активностью р24, обнаруженной в том же самом тесте, где стадию а) проводят в отсутствие антител против ВИЧ.

Как правило, для выполнения анализа нейтрализации, описанного выше, проводят серию испытаний, когда на стадии а) применяют возрастающее известное количество тестируемых антител. Полностью подробное описание анализа нейтрализации дано в примерах в данном документе.

Полученные авторами изобретения результаты показывают, что иммуногенную композицию, содержащую антигенный пептид формулы (I), можно применять с высокой степенью безопасности для индивидуума, нуждающегося в ней, так как указанная иммуногенная композиция не вызывает нежелательных побочных эффектов, а именно не влияет на функциональность клеток CD4+ Т, по сравнению с известными антигенными пептидами против ВИЧ (например, «3S» пептид, показанный на фиг.1).

Дополнительно, иммуногенная композиция, содержащая антигенный пептид формулы (I), является очень мощным терапевтическим средством против ВИЧ благодаря своему плейотропному действию против ВИЧ-1 инфекции, включая (i) образование антител, наделенных нейтрализующей активностью широкого спектра действия против целого ряда клинических изолятов ВИЧ-1, и (ii) блокирование лизиса CD4+ Т клеток, осуществляемого клетками NK.

Более того, иммуногенная композиция, содержащая антигенный пептид формулы (I), наделена высокой селективностью действия, так как для иллюстрации она нарушает исключительно активность NK клеток, направленную против CD4, в то же самое время не оказывая воздействия на важную функцию антимикробного иммунитета клеток NK, подобно дегрануляции.

Таким образом, иммуногенная композиция, содержащая антигенный пептид формулы (I), (i) имеет активность, направленную против ВИЧ-1, посредством индукции образования нейтрализующих антител против ВИЧ-1 широкого спектра действия, и (ii) защищает функциональность иммунной системы ВИЧ-1-инфицированного индивидуума, (а) защищая CD4+ Т клетки от разрушения и (б) следя за тем, чтобы неспецифичные антимикробные функции иммунной системы оставались полностью функциональными.

Иллюстративные воплощения пептидов формулы (I) раскрыты на фиг.1, которые включают "W614A" или "М2" (SEQ ID №12 в данном документе), (ii) "S615A" или "М3" (SEQ ID №13 в данном документе), (iii) "N616A" или "М4" (SEQ ID №14 в данном документе) и (iv) "S618A" или "М6" (SEQ ID №15 в данном документе).

Важным является то, что, как показано в примерах данного документа, другие конкретные пептиды, имеющие высокую уровень аминокислотной идентичности с пептидами формулы (I), подобно конкретным пептидам, названным S613A (или "М1") и K617A (или "М5"), представленным на фиг.1, не наделены каким-либо свойством против ВИЧ пептидов формулы (I). Для иллюстрации пептиды S613A и K617A (i) не вызывают образования нейтрализующих антител против ВИЧ, (ii) инициируют экспрессию NKp44L клетками CD4 и таким образом также чувствительность CD4+ Т клеток к лизису, осуществляемому NK клетками, и (iii) не вызывают продукции антител, способных снижать или блокировать чувствительность CD4+ Т клеток к лизису, осуществляемому NK клетками.

Очень неожиданно, как показали авторы изобретения, что пептиды S613A и K617A, обсуждаемые выше, вызывают образование антител, которые хорошо распознают последовательности дикого типа, экспрессируемые вирусами ВИЧ-1, несмотря на то, что данные пептиды не способны вызывать образование нейтрализующих антител против ВИЧ-1 вирусов.

Также очень неожиданно, как показано в примерах данного документа, что пептиды формулы (I) вызывают образование антител, которые не взаимодействуют с последовательностями дикого типа, экспрессируемыми ВИЧ-1 вирусами, как показано в Таблице 4. Эти неожиданные результаты говорят о том, что пептиды формулы (I) структурно отличаются от соответствующих последовательностей ВИЧ-1 дикого типа, хотя они вызывают образование нейтрализующих антител против ВИЧ-1 широкого спектра действия. Данные результаты явно противоречат тому, что ожидал бы специалист в данной области при поиске антигенных соединений для индукции эффективного иммунного ответа на инфекцию, вызванную вирусами ВИЧ-1.

С другой стороны, пептиды, имеющие последовательности, близкие к пептиду формулы (I), подобно приведенным выше S613A и K617A пептидам, по-видимому, структурно тесно связаны с последовательностями ВИЧ-1 дикого типа и способны вызывать образование антител, распознающих данные последовательности дикого типа, хотя данные антитела не обладают каким-либо свойством антител против ВИЧ-1.

Результаты, изложенные в данном документе, показывают, что специалист в данной области не мог ожидать (i) ни безопасности пептида формулы (I), ни (ii) разных, направленных против ВИЧ свойств антител к пептиду формулы (I).

Дополнительно ожидают, что пептид формулы (I) обладает линейной пространственной структурой.

Авторы изобретения также показали, что антитела, направленные против пептида формулы (I), могут быть обнаружены у небольшого числа индивидуумов, инфицированных ВИЧ-1 вирусом. Обнаружили сильную корреляцию между (i) наличием антител, направленных против пептида формулы (I) у данных ВИЧ-1-инфицированных индивидуумов, и (ii) низкой ВИЧ-1 вирусной нагрузкой, а также большим количеством CD4+ Т клеток. Данные результаты явно показывают высокую эффективность in vivo антител, направленных против пептида формулы (I), для предупреждения и/или лечения инфекции индивидуума, вызванной вирусом ВИЧ-1.

Примеры данного документа также иллюстрируют, что мутировавшие вирусы ВИЧ-1, кодирующие мутантный белок gp41, несущий одну из мутаций W614A и S618A, которые представлены в воплощениях пептидов формулы (I), имеют сильно сниженную способность инфицировать человеческую лимфобластную клеточную линию и не инициируют экспрессию NKp44L CD4+ Т клетками. Данные результаты говорят о том, что неспособность пептида формулы (I) инициировать экспрессию NKp44L CD4+ Т клетками также обнаруживают в цельных вирусах, экспрессирующих конкретные варианты gp41 белков.

В данном контексте предупреждение или лечение инфекции индивидуума, вызванной ВИЧ-1 вирусом, охватывает (I) предупреждение или лечение заболевания, связанного с инфекцией указанного индивидуума, вызванной вирусом ВИЧ-1, включая СПИД, и (ii) предупреждение развития ВИЧ-1 заболевания.

В данном контексте термин «ВИЧ инфекция» главным образом охватывает инфицирование животного-хозяина, в частности человека, вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-1) типа 1. «ВИЧ-1» можно использовать в данном документе для того, чтобы ссылаться на любые штаммы, формы, подтипы, клады и разновидности в семействе ВИЧ-1. Таки