Вакцина против ehrlichia canis

Вакцина против ehrlichia canis

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

В настоящей заявке заявлен приоритет, согласно статье 35, § 119(e) свода законов США, по временной заявке США с серийным номером 61/360969, поданной 2 июля 2010 г., содержание которой в полном объеме включено в настоящее описание в виде ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям и к вакцинам против моноцитарного эрлихиоза собак (CME, Canine Monocytic Ehrlichiosis), вызываемого бактерией Ehrlichia canis, и ассоциированным способам.

Моноцитарный эрлихиоз собак (CME) является тяжелым риккетсиозным заболеванием у собак, вызываемым бактерией Ehrlichia canis (E. canis). E. canis передается от собаки к собаке через коричневый собачий клещ (Rhipicephalus sanguineus). По прошествии инкубационного периода в 2-3 недели после инфицирования у собак могут развиваться острая, субклиническая и хроническая фазы указанного заболевания. В острой фазе клинические признаки варьируют от слабой до тяжелой тромбоцитопении, лейкопении, анемии, вялости и потери веса. Через два месяца у большинства собак начинается субклиническая фаза, которая длится месяцы или годы, в течение которых могут стойко держаться низкие показатели крови, но при этом клинические признаки минимальны. У малого процента инфицированных собак может развиться тяжелая форма заболевания, известного как тропическая панцитопения собак (TCP, Tropical Canine Pancytopenia). Стойкая депрессия костного мозга, геморрагии, неврологические нарушения, периферическая эдема и сильная потеря веса являются характеристиками TCP. Может развиться гипотонический шок, приводящий к смерти. Несмотря на опубликованные ранее сообщения об иммуногенных композициях против E. canis [см., например, Mahan et al., Onderstepoort J. Vet. Res. 72(2): 119-128 (2005); заявку США 2006/0188524A1], демонстрации эффективности той или иной вакцины против E. canis представлено не было. Следовательно, есть потребность в вакцинах против CME и/или TCP.

Здесь цитирование какого бы то ни было источника не следует расценивать как допущение, что такой источник доступен в качестве "Предшествующего уровня техники" по отношению к настоящей заявке.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение связано с вакцинами и/или иммуногенными композициями для стимуляции защитного иммунного ответа против причины эрлихиоза. В некоторых вариантах изобретения вакцинная композиция и/или иммуногенная композиция содержит средство, которое при введении пациенту в качестве первичной вакцины вызывает у указанного пациента минимальный гуморальный иммунный ответ, если вообще его вызывает. В некоторых вариантах осуществления указанная иммуногенная композиция включает средство, которое при введении в качестве первичной вакцины вызывает минимальный, если вообще его вызывает, гуморальный иммунный ответ у указанного пациента, но при этом обеспечивает защитную иммунную реакцию. Одним из таких вариантов осуществления является вакцина, которая содержит инактивированную бактерию E. canis, выращенную на линии клеток костного мозга собаки. В некоторых таких вариантах осуществления указанная вакцина может дополнительно включать адъювант. В некоторых вариантах осуществления указанным адъювантом является фактор жгутообразования. В более частных вариантах осуществления адъювант-фактор жгутообразования растворен в системе хлороформных растворителей.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вакцинной композиции и/или иммуногенной композиции, которая содержит антиген из E. canis, который при первоначальном введении пациенту (например, в качестве первичной вакцины) не вызывает продуцирования значительного количества антител против указанного антигена. Соответственно, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают иммуногенные композиции и/или вакцинные композиции, которые содержат эффективное для иммунизации количество антигена из E. canis, где первоначальное введение первичной вакцинной композиции пациенту вызывает минимальный гуморальный ответ. В частных вариантах осуществления настоящее изобретение связано с иммуногенной композицией и/или вакциной, которая после первоначального введения/первичной вакцинации не вызывает поддающегося измерению гуморального ответа, в то же время обеспечивая защитную иммунную реакцию у пациента. В некоторых вариантах осуществления вакцина и/или иммуногенная композиция согласно настоящему изобретению при первичной вакцинации/первичном введении вызывает клеточную иммунную реакцию, вызывая при этом минимальный и/или не поддающийся измерению (например, не детектируемый) гуморальный ответ.

Следовательно, в сходном аспекте настоящее изобретение связано с композицией вакцины, которая содержит эффективное для иммунизации количество антигена из E. canis. В некоторых таких вариантах осуществления указанный антиген вызывает защитную иммунную реакцию, но при этом вызывает минимальный гуморальный ответ у пациента, когда указанную вакцину вводят в качестве первичной вакцины. Вакцины и/или иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению могут включать антиген, который получают из E. canis, выращиваемой и/или пассируемой на клетках, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления E. canis выращивают и/или пассируют на линии собачьих клеток. В более частных вариантах осуществления указанной линией собачьих клеток может быть линия клеток костного мозга собаки. В более частных вариантах осуществления такая клетка имеет в ATCC номер доступа No. PTA-10545, и/или такой клеткой является клетка, имеющая одну или более, и/или все из идентификационных характеристик клетки, которая имеет в ATCC номер доступа No. PTA-10545. В частном варианте осуществления указанный антиген E. canis представляет собой клеточно-ассоциированную E. canis, которая имеет одну или более, и/или все из идентификационных характеристик клеточно-ассоциированной E. canis, которая имеет в ATCC номер доступа No. PTA-10546.

Кроме того, настоящее изобретение относится к клеточно-ассоциированной E. canis, которая имеет в ATCC номер доступа No. PTA-10546. Настоящее изобретение относится также к клеточно-ассоциированной E. canis, которая имеет одну или более, и/или все из идентификационных характеристик клеточно-ассоциированной E. canis, которая имеет в ATCC номер доступа No. PTA-10546. Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке, которая имеет в ATCC номер доступа No. PTA-10545, Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке, которая имеет одну или более, и/или все из идентификационных характеристик клетки, которая имеет в ATCC номер доступа No. PTA-10545.

Кроме того, антигены E. canis указанных вакцин и/или иммуногенных композиций согласно настоящему изобретению могут быть инактивированы. В некоторых вариантах осуществления указанный инактивированный антиген E. canis инактивирован формалином.

В другом аспекте настоящее изобретение связано с вакцинами и/или с иммуногенными композициями, которые содержат адъювант. В некоторых вариантах осуществления такого типа, указанным адъювантом является липофильный адъювант. В некоторых вариантах осуществления указанный липофильный адъювант находится внутри неполярного растворителя. В частных вариантах осуществления иммуногенная композиция и/или вакцина согласно настоящему изобретению содержит антиген, который может быть скомбинирован с гидрофобным адъювантом и который способен смешиваться с системой полярных растворителей, составленных вакциной и/или иммуногенной композицией. В более частных вариантах осуществления указанный адъювант содержит фактор жгутообразования, такой как 6,6'-димиколят трегалозы. В частных вариантах осуществления 6,6'-димиколят трегалозы находится внутри неполярного растворителя. В более частных вариантах осуществления указанный адъювант содержит 6,6'-димиколят трегалозы, растворенный в системе хлороформных растворителей, в частных вариантах осуществления указанная система хлороформных растворителей содержит приблизительно 65-95% хлороформа, объем/объем. В более частных вариантах осуществления указанная система хлороформных растворителей содержит приблизительно 80-95% хлороформа, объем/объем. В некоторых вариантах осуществления система хлороформных растворителей содержит приблизительно 5,0-30% метанола, объем/объем. В более частных вариантах осуществления система хлороформных растворителей содержит приблизительно 7,5-15% метанола объем/объем. В некоторых вариантах осуществления система хлороформных растворителей содержит приблизительно 0,5-5,0% воды, объем/объем. В более частных вариантах осуществления система хлороформных растворителей содержит приблизительно 0,75-2,5% воды, объем/объем. В некоторых вариантах осуществления, система хлороформных растворителей содержит приблизительно 90% хлороформа: 10% метанола: 1,0% воды, объем/объем, соответственно. В некоторых вариантах осуществления указанная вакцина и/или иммуногенная композиция содержит инактивированную формалином клеточно-ассоциированную E. canis, выращиваемую в депонированных клетках, имеющих в ATCC номер доступа No. PTA-10545, и адъювант, содержащий 6,6'-димиколят трегалозы, растворенный в соотношении 90:10:1 растворителей хлороформ: метанол: вода. Композиция, содержащая фактор жгутообразования, такая как 6,6'-димиколят трегалозы, растворенная в системе хлороформных растворителей, также составляет часть настоящего изобретения, так как она используется в качестве адъюванта.

Кроме того, настоящее изобретение связано с бактерией E. canis, выращиваемой на клетках и/или клеточных линиях, которые являются особенно подходящими для их роста. Кроме того, настоящее изобретение связано со способами продуцирования антигена для вакцины и/или иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение связано со способами продуцирования антигенов E. canis. В некоторых вариантах осуществления бактерию E. canis выращивают на макрофаге. В некоторых вариантах осуществления бактерию E. canis выращивают на макрофагоподобных линиях клеток. В некоторых вариантах осуществления E. canis выращивают на клеточной линии костного мозга собаки (DBM, Dog Bone Marrow) с целью продуцирования клеточно-ассоциированного антигена E. canis. В некоторых вариантах осуществления бактерию E. canis выращивают на линии клеток DBM. В некоторых вариантах осуществления указанная линия клеток DBM представляет собой DBM (WCS) MCS+12, с номером доступа в ATCC No. PTA-10545. В частных вариантах осуществления E. canis является клеточно-ассоциированной, WS MS+3, 19517-001, с номером доступа в ATCC No. PTA 10546. В альтернативных вариантах осуществления E. canis выращивают на клеточной линии DH-82.

Антиген E. canis согласно настоящему изобретению может представлять собой инактивированную E. canis. В частных вариантах осуществления указанным антигеном E. canis является бактерин. В некоторых вариантах осуществления указанный инактивированный антиген E. canis является клеточно-ассоциированным.

Настоящее изобретение относится также к способам иммунизации пациента против E. canis. Такие способы могут включать введение пациенту вакцинной композиции и/или иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению. Некоторые варианты осуществления включают внутрикожное введение пациенту вакцины и/или иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению. Другой такой способ включает подкожное введение пациенту вакцины и/или иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению. Еще один из таких способов включает пероральное введение пациенту вакцины и/или иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению. В таких частных вариантах осуществления животным пациентом является собака. В другом варианте осуществления животным пациентом является кошка (например, домашняя кошка). В частных вариантах осуществления вторую дозу вакцинной композиции и/или иммуногенной композиции вводят в качестве бустера. В некоторых вариантах осуществления указанный бустер вводят приблизительно через 21 день после первоначальной дозы вакцинной композиции.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу изготовления вакцинной композиции и/или иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение связано со способом продуцирования антигена E. canis, как описано в настоящей заявке. Вакцинные композиции и/или иммуногенные композиции получают путем смешивания антигена согласно настоящему изобретению с ветеринарно приемлемым эксципиентом. В таких частных вариантах осуществления указанный антиген является клеточно-ассоциированным бактерином E. canis. В частных вариантах осуществления указанным ветеринарно приемлемым эксципиентом является адъювантный фактор жгутообразования, растворенный в системе хлороформных растворителей.

Указанные выше и другие аспекты настоящего изобретения станут более понятными в совокупности с представленными графическими материалами, подробным описанием и примерами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

На ФИГ. 1 представлено графическое изображение среднего количества лейкоцитов крови, в зависимости от времени после контрольного заражения, у контрольных животных (треугольники) и у вакцинированных животных (квадраты). Жирная линия соответствует минимальному уровню лейкоцитов крови, считающемуся нормальным в соответствии с Руководством Merck.

На ФИГ. 2 представлено графическое изображение среднего количества эритроцитов крови, в зависимости от времени после контрольного заражения, у контрольных животных (треугольники) и у вакцинированных животных (квадраты). Жирная линия соответствует минимальному уровню эритроцитов крови, считающемуся нормальным в соответствии с Руководством Merck.

На ФИГ. 3 представлено графическое изображение средних значений гемоглобина, в зависимости от времени после контрольного заражения, у контрольных животных (треугольники) и у вакцинированных животных (квадраты). Жирная линия соответствует минимальному уровню гемоглобина, считающемуся нормальным в соответствии с Руководством Merck.

На ФИГ. 4 представлено графическое изображение средних значений гематокрита, в зависимости от времени после контрольного заражения, у контрольных животных (треугольники) и у вакцинированных животных (квадраты). Жирная линия соответствует минимальному уровню гематокрита, считающемуся нормальным в соответствии с Руководством Merck.

На ФИГ. 5 представлено графическое изображение среднего количества тромбоцитов, в зависимости от времени после контрольного заражения, у контрольных животных (треугольники) и у вакцинированных животных (квадраты). Жирная линия соответствует минимальному уровню тромбоцитов, считающемуся нормальным в соответствии с Руководством Merck.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение связано с иммуногенными композициями и вакцинами, которые могут уменьшить частоту возникновения тромбоцитопении, лейкопении, анемии и потери веса после контрольного заражения вирулентным штаммом E. canis. Представленные здесь результаты не соответствуют опубликованным ранее результатам относительно инфицированных собак, которых лечили антибиотиками, но которые были подвержены последующему заболеванию [см., например, Breitschwerdt et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 42(2) 362-368 (1998)]. В указанных более ранних сообщениях предполагается, что после воздействия указанного организма защитный иммунитет не развивается, в отличие от настоящего изобретения, которое связано со способами облегчения и/или предотвращения моноцитарного эрлихиоза собак (CME) и/или тропической панцитопении собак (TCP) у пациента путем введения указанному пациенту иммуногенной композиции и/или вакцинной композиции согласно настоящему изобретению. Таким образом, в одном из аспектов настоящее изобретение связано с эффективной вакциной против E. canis.

Как описано в настоящей заявке, в процессе развития модели контрольного заражения E. canis, у собак быстро развивался гуморальный антительный ответ на E. canis. Появление анти-E. canis-антитела коррелирует с быстрым падением числа тромбоцитов, или тромбоцитопенией, а также с инициацией нескольких других клинических явлений. Однако вакцины, которые индуцируют сильный гуморальный антительный ответ у собак, не способны защитить их от клинических признаков заболевания. Действительно, у вакцинированных собак, у которых провоцируется сильный антительный ответ на E. canis, могут иметь место худшие клинические последствия, чем у невакцинированных особей после контрольного заражения. Не связывая себя какой бы то ни было конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что описанные здесь результаты, по всей видимости, согласуются с таковыми, полученными с использованием антител, продуцируемых против E. canis при получении доступа к внутреннему пространству клеток через процесс опсонизации.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способам продуцирования антигена для иммуногенной композиции и/или вакцины как таковых. В частных вариантах осуществления указанные способы включают в себя выращивание E. canis на конкретной клеточной линии, с получением указанного антигена. В некоторых вариантах осуществления указанный антиген смешивают с ветеринарно приемлемым эксципиентом. В более частных вариантах осуществления настоящее изобретение включает в себя композицию, которая содержит инактивированную бактерию E. canis, выращенную на линии клеток костного мозга собак. Иммуногенные композиции и/или вакцины согласно настоящему изобретению могут дополнительно включать в себя адъювант.

Несмотря на то, что механизм селекции, используемый для выбора клеток, которые будут инфицированы бактерией E. canis, недостаточно известен, клетки, подходящие для инфицирования, обычно экспрессируют рецепторы антигенов класса II Главного Комплекса Гистосовместимости (MHC, Major Histocompatibility Complex). Harris et al. [Vet. Immunol Immunopathol., 96: 239-243 (2003)] продемонстрировали, что организм E. canis располагает механизмом снижения экспрессии рецепторов MHC класса II на поверхности клеток, которые он инфицирует, что можно расценивать как возможный механизм, позволяющий обойти систему иммунного надзора. Хотя и понятно, что клеточные линии, полученные из рода клещей, не экспрессируют рецепторы MHC класса II млекопитающих, Singu et al. [Cellular Microbiology, 8(9), 1475-1487 (2006)] продемонстрировали, что E. canis способствует изменению экспрессии их поверхностных белков, в зависимости от того, инфицируют ли они позвоночного или беспозвоночного хозяина. Соответственно, в другом аспекте, настоящее изобретение связано с клетками и/или клеточными линиями, которые обеспечивают рост E. canis, обеспечивая в то же время выход антигена E. canis, который оптимизирован для применения вакцины.

Здесь термин "пациент" относится к представителю любого вида, который может быть инфицирован бактерией E. canis. В некоторых вариантах осуществления указанным пациентом является животное, не являющееся человеком. В частных вариантах осуществления указанным пациентом является либо собака, либо кошка. В некоторых вариантах осуществления указанным животным-пациентом является собака. В других вариантах осуществления указанным животным-пациентом является кошка.

Здесь термин "собака" включает в себя, если специально не оговорено иное, всех домашних собак, Canis lupus familiaris или Canis familiaris.

Здесь термин "эффективное для иммунизации количество" может варьировать, в зависимости от штамма или штаммов E. canis, используемых для получения вакцины, и может быть любым количеством, достаточным для индукции защитного иммунного ответа.

Хотя используемый здесь термин "защитный иммунный ответ" может быть у пациента иммунным ответом, который приводит к тому, что обеспечивается защита против одного или нескольких признаков инфекции, тем не менее "защитный иммунный ответ" необязательно должен обеспечивать полную защиту от любого признака инфекции. Скорее "защитный иммунный ответ" может быть иммунным ответом, которого достаточно для того, чтобы после контрольного заражения симптомы исходной инфекции были по меньшей мере ослаблены, и/или чтобы одна или несколько из исходных клеточных, физиологических или биохимических причин или механизмов, вызывающих симптомы, были ослаблены и/или устранены. Следует понимать, что в данном контексте термин "ослаблены" означает сравнительную степень по отношению к статусу инфекции, включая молекулярный статус инфекции, а не только физиологический статус инфекции. Подразумевается, что вакцины согласно настоящему изобретению обеспечивают защитный иммунный ответ.

Здесь термин "достижение минимального гуморального ответа" означает, что введение вакцинной композиции, содержащей E. canis, при первичной вакцинации пациенту (например, собаке) не приводит к обнаружению антител против E. canis при тестировании сыворотки, полученной от указанного пациента через 21 день после первичного воздействия вакцинной композицией, когда указанное детектирование предпринимают, выполняя следующую процедуру: разведенную 1:40 тестируемую сыворотку приводят в контакт с фиксированной E. canis, в достаточной степени промывают, чтобы удалить весь не связавшийся материал, добавляют флуоресцентно меченное анти-IgG-антитело, соответствующее видовой принадлежности указанного пациента, промывают в достаточной степени, чтобы удалить весь не связавшийся материал, а затем проводят визуальное обследование флуоресценции за счет флуоресцентно меченных анти-IgG-антител, связавшихся с фиксированной E. canis посредством антител, специфичных в отношении E. canis. В частных вариантах осуществления проведение указанному пациенту единственной последующей бустер-вакцинации указанной вакциной все еще не вызывает значительного гуморального ответа против E. canis и требует разведения 1:160 или менее при тестировании сыворотки, полученной от указанного животного пациента после введения указанной бустерной вакцинной композиции, для детектирования антител против E. canis в тестируемой сыворотке, если они вообще поддаются детектированию, при определении способом, предпринимаемым, как описано выше, при первичной вакцинации.

Здесь термин "стабильно инфицированная" клеточная линия относится к линии клеток, которые остаются инфицированными по меньшей мере на протяжении 10 пассажей клеточной культуры.

Антигены

Антигены E. canis согласно настоящему изобретению могут быть выделены из любого количества источников или штаммов E. canis. Примеры таких штаммов E. canis включают в себя, но не ограничены штаммами Ebony, Broadfoot, Florida, Israel 611, Kogashima 1, Louisiana, Oklahoma, Venzuela, штаммом Jake университета штата Северная Каролина (NCSU), а также изолятами NCSU, такими как Demon, D J и Fuzzy. В некоторых вариантах осуществления указанным антигеном может быть бактерин E. canis. В дополнительных вариантах осуществления указанный антиген может быть выделен или получен из бактерий E. canis, инактивированных любым из подходящих доступных способов. Примеры таких способов включают в себя, но не ограничены воздействием тепла, формальдегида, формалина, би-этиленамина, радиации и бета-пропиолактона. В частных вариантах осуществления бактерии E. canis могут быть инактивированы путем обработки формалином.

В частных вариантах осуществления антиген E. canis может включать в себя один или несколько антигенов, которые не будут распознаваться пациентом как чужеродные, когда указанные один или несколько антигенов будут представлены пациенту, то есть либо у указанного пациента не будет развиваться гуморальный ответ, либо это будет минимальный гуморальный ответ на указанные один или несколько антигенов. В некоторых вариантах осуществления указанные один или несколько антигенов E. canis не будут вызывать продукцию антител или, альтернативно, будут вызывать минимальную продукцию антител против указанных одного или нескольких антигенов E. canis. Кроме того, такие антигены E. canis будут вызывать защитный иммунный ответ против указанных одного или нескольких антигенов E. canis. Настоящее изобретение включает в себя иммунную композицию для вакцинации собак против эрлихиоза, при этом указанная иммунная композиция является такого типа композицией, которая включает в себя средство, в ответ на которое у собаки вырабатывается иммунный ответ, и которое используется в качестве агента, который вызывает у собак от слабого гуморального иммунного ответа до отсутствия такового, но при этом вызывает у собаки защитный иммунный ответ. В частных вариантах осуществления указанный защитный иммунный ответ обусловлен, по меньшей мере отчасти, клеточно-опосредованным иммунным ответом.

Клетки

Бактерии E. canis согласно настоящему изобретению могут быть выращены на соответствующих клетках и/или на клеточной линии. Соответственно, антиген из E. canis может быть получен из бактерии E. canis, выращенной или размноженной на клеточной линии. Примеры таких клеток и клеточных линий включают в себя первичные клетки (например, макрофаги) и/или клеточные линии/стабильные клеточные линии, например, перечисленные ниже:

Первичные линии клеток:

· Макрофаги крови собаки, см., например, [Nyindo, et. al. Am. J. Vet. Res. 32: 1651-1658 (1971)].

· Перитонеальные макрофаги, см., например, [Stephenson and Osterman, Am. J. Vet. Res. 38: 1815-1819 (1977)].

Стабильные клеточные линии:

· Гибридная линия клеток человека/собаки, [см., например, Stephenson and Osterman, Am. J. Vet. Res. 41: 234-240 (1980)].

· Макрофагальная линия клеток собаки (DH-82), [см., например, Dawson, et. al., J. Infect. Dis. 163: 564-567 (1991)].

· Мышиные перитонеальные макрофаги; гибридная линия клеток мыши/собаки (MDH-SP), [см., например, Holland and Ristic, Abstr 55, p. 89, in Program and Abstracts of the IVth International Symposium on Rickettsiae and Rickettsial Diseases, Piestany Spa, Czech and Slovak Federal Republics].

· Линия клеток мышиных макрофагов, [см., например, Keysary, et. Al., J VEt Diagn Invest 13: 521-523 (2001)].

· Линия клеток костного мозга собаки (клетки DBM), [см., например, Gaunt et. al. J. Clin Micro. 34 (6): 1429-1432 (1996)].

· Линия клеток кошачьих эмбриональных фибробластов (FEF), [см., например, Battles et. Al., WO 2009/036177 A 1].

· Линии клеток клеща (IDE8 и ISE6), [см., например, Munderloh, et. al. U.S. 5869335].

В одном из аспектов настоящего изобретения клеточной линией является макрофагоподобная клеточная линия, которая экспрессирует поверхностные рецепторы, сходные с таковыми, экспрессируемыми макрофагами собаки. В сходных вариантах осуществления указанной клеточной линией является макрофагальная линия клеток, в таких частных вариантах осуществления используемой клеточной линией является линия клеток DH-82, которая в ATCC имеет номер доступа No. CRL-10389.

Настоящее изобретение включает в себя E. canis, которую выращивают на моноцитарной или макрофагоподобной клеточной линии, в определенных случаях указанные линии клеток иммортализованы таким образом, чтобы обеспечить стабильный и надежный ростовой субстрат для производства вакцин. Иммортализованные клетки могут быть получены из неопластических клеток-предшественников, таких как линия клеток DH-82, описанная Wellman с соавт. [In Vitro Cell Develop Biol. 24: 223-228, (3988)]. Клетки могут быть иммортализованы с помощью вирусных генов. Было показано, что T-антиген обезьяньего вируса 40 (SV40) очень надежным образом способствует созданию иммортализованных клеток, и гибриды соматических клеток перитонеальных макрофагов собаки, гибридизованных с SV40-трансформированными человеческими клетками, были использованы Stephenson et al. [Am J Vet Res 41(2): 234-40, (1980)] для выращивания E. canis в стабильном режиме. Для иммортализации клеток может быть использовано множество средств, включая различные вирусы, рентгеновские лучи, органические растворители, соединения металлов и нуклеиновые кислоты. Указанные способы широко представлены в обзорах Rhim [Annals NY Acad of Sci. 919: 16-25 (2000)]. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения E. canis выращены именно в таких клеточных линиях, а затем инактивированы с образованием бактеринового антигена E. canis.

В некоторых вариантах осуществления указанной линией клеток является линия клеток костного мозга собаки (DBM). В частных вариантах осуществления линией клеток DBM является линия, описанная Gaunt с соавт. [J. Clin. Microbiol., 34 (6): 1429-1432, (1996)]. В частных вариантах осуществления линией клеток DBM является депонированный в ATCC штамм с номером доступа No. PTA-10545. В некоторых вариантах осуществления такой клеточной линией является линия клеток DBM, которая стабильно инфицирована бактерией E. canis. В таком частном варианте осуществления клеточно-ассоциированная E. canis депонирована и имеет в ATCC номер доступа No. PTA-10546. В альтернативных вариантах осуществления указанной клеточной линией является линия клеток насекомых. В таких частных вариантах осуществления клеточной линией насекомых является линия клеток клеща. В одном из конкретных вариантов осуществления указанной клеточной линией является линия клеток клеща IDE8, выделенная из Ixodes scapularis, которая депонирована в ATCC и имеет в ATCC номер доступа No. CRL-11973.

Размножение E. canis

Клеточную культуру, инфицированную E. canis, можно выращивать в культуральных матрасах, а затем переносить в более крупные матрасы для получения больших объемов материала, необходимого для изготовления иммуногенных композиций и/или вакцин. Альтернативно, инфицированную клеточную культуру можно в последующем переносить из матрасов в роллерные бутыли, вращающиеся колбы, клеточные кубы, биореакторы или в любую аппаратуру, пригодную для крупномасштабного выращивания клеточной культуры с целью получения соответствующих количеств материала, необходимых для изготовления смеси иммуногенной композиции и/или вакцины. Инфицированные культуры могут быть заморожены в соответствующей среде и использованы и использованы для инфицирования клеточной культуры в дальнейшем.

Клетки могут быть прилипающими и прикрепленными к культуральному матрасу или аппарату, включая варианты прикрепления к микроносителям, или, альтернативно, плавающими в суспензии. Способы изъятия прилипающих, или адгерентных, клеток включают в себя, но не ограничены соскабливанием их с матрасов с помощью механических скребков для клеток или обработкой раствором трипсина для удаления их из матраса, с дальнейшей нейтрализацией неизрасходованного трипсина белковым раствором. Затем клетки могут быть отцентрифугированы с целью их концентрирования, а потом ресуспендированы в соответствующей замораживающей среде. Замораживающие среды включают в себя, но не ограничены средами, содержащими 10-90% эмбриональной бычьей сыворотки и 1-20% диметилсульфоксида (DMSO). Могут быть использованы и другие подходящие криоконсерванты, которые могут оказаться более соответствующими тем или иным клеточным линиям, и в результате этого может повышаться уровень жизнеспособности клеток при их оттаивании и повторном запуске культуры.

Для запуска инфицированной культуры, неинфицированные клетки могут быть вытащены из морозильной камеры и культивированы в соответствующей среде. Например, 1-мл флакон, содержащий 1×10⁵ клеток DBM, подвергают быстрому оттаиванию и помещают в матрас T-75 для культивирования тканей (с площадью поверхности 75 см²), содержащий среду, подходящую для роста клеток DBM. В одном из конкретных вариантов осуществления такой средой является полная ростовая среда Фишера. Например, один литр полной ростовой среды Фишера для клеток DBM изготавливают путем добавления 200 мл лошадиной сыворотки к 770 мл среды Фишера. Среду доводят до кондиции путем добавления 10 мл раствора гидрокортизона с концентрацией 2 мг/мл, 10 мл 200 мМ раствора глутамина и 10 мл 1 M раствора HEPES.

Как только культура DBM достигает требуемого уровня конфлуэнтности (0-90%), такая культура готова для инфицирования. Пузырек инфицированной культуры достают из морозильной камеры, подвергают быстрому оттаиванию и распределяют поверх растущей культуры. Культуру растят при 36±2°C в закрытых пробками или вентилируемых матрасах с обогащением или без обогащения CO₂. Культуру поддерживают в соответствии с общепринятыми способами, известными специалистам в данной области, путем переноса клеток, по необходимости, в свежую среду. Через несколько недель указанную культуру можно проверить на предмет определения уровня инфицирования путем непрямой флуоресцентной микроскопии с использованием анти-Е. canis-антител или других подходящих методов. Культуры могут достигать уровня инфицирования, составляющего 90% или выше. Более высокий уровень инфицирования является более желательным, поскольку он дает возможность получить более высокий выход антигенного материала на объем культуры. Инфицированную культуру можно переносить в более крупные культуральные объемы путем переноса культуры в более емкие матрасы, роллерные бутыли или другие подходящие культуральные сосуды.

Инфицирование клеточной культуры бактерией E. canis может быть определено несколькими способами, включая, но не ограничиваясь перечисленным, микроскопический анализ клеток, окрашенных красителями, такими как краситель Гимза, краситель Cameo Difquick или акридиновый оранжевый. Кроме того, антитела, специфичные в отношении E. canis, могут быть либо напрямую, либо опосредованно мечены флуоресцентными маркерами, и их изучают во флуоресцентном световом микроскопе и при определенной длине волны в соответствии с конкретным флуоресцентным маркером. Для определения уровня инфицирования культуры могут быть использованы также и другие технологии, включая, но не ограничиваясь перечисленным, количественную полимеразную цепную реакцию (qPCR), или ПЦР.

При необходимости к культуре могут быть добавлены неинфицированные клетки, чтобы поддержать определенный уровень инфекции в культуре. Когда соответствующий объем инфицированной культуры достигнут, такая культура может быть инактивирована различными способами, включая нагревание или химические способы, но не ограничиваясь перечисленным. Перед инактивацией культура может быть оттитрована с целью определения количества инфекционных частиц в культуре в качестве способа определения того, какое количество пост-инактивированной культуры добавлять к смеси. Способ титрования инфицированной культуры представлен в примере ниже. В некоторых вариантах осуществления к культуре добавляют формалин до конечной концентрации 0,05%, и такую культуру перемешивают в течение трех дней при 36±2°C. Другие такого рода инактиванты, которые могут быть использованы, включают в себя, но не ограничены этилениминами (EI, BEI), бета-пропиолактоном и фенолом. Для инактивации такой культуры могут быть использованы также антибиотики, такие как дезоксициклин или любой другой антибиотик, к которому чувствительна бактерия E. canis.

Для определения жизнеспособности культура может быть тестирована любым количеством способов. Такие способы включают в себя, но не ограничены обратным титрованием клеточной культуры, способом определения мембранной целостности по противостоянию проникновению красителя, а также инъекцией собакам и мониторингом на предмет определения типичных признаков инфекции.

Сразу после инактивации культуру можно сконцентрировать любым из множества известных способов. Например, концентрирование нежизнеспособной E. canis может быть достигнуто путем центрифугирования, ультрацентрифугирования или выпаривания. В одном из конкретных вариантов осуществления клетки DBM, которые инфицированы бактерией E. canis, инактивируют, а затем центрифугируют при 1400×g в течение 15 минут для осаждения цельных клеток. Супернатант отбрасывают, а осадок ресуспендируют в среде Фишера, не содержащей сыворотки. После инактивации может быть добавлен гентамицин или сходный с ним антисептик, во избежание контаминирования. Культуру ресуспендируют в бессывороточной среде Фишера в одной десятой первоначального объема, чтобы сконцентрировать инактивированную культуру и облегчить манипуляции с нею. Количество антигена, доступное в инактивированном концентрате, может быть определено любым из многочисленных способов, включая хроматографию, спектроскопию или специфические иммуноанализы разных типов. Массу антигенного материала можно смешать с разбавителями и адъювантом с получением приемлемой вакцины.

Иммуногенные композиции и вакцины

Как указано выше, иммуногенные композиции и/или вакцины, содержащие антиген согласно настоящему изобретению (например, бактерин E. canis), может, но необязательно, дополнительно включать в себя один или несколько фармацевтически приемлемых адъювантов. Примеры фармацевтически приемлемых адъювантов хорошо известны в данной области, см., например, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Ed. (1990, Ma