Циклические пептиды с антинеопластической и антиангионенной активностью

Циклические пептиды с антинеопластической и антиангионенной активностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и фармацевтической промышленности, точнее к конструированию и получению циклических пептидов, предназначенных для диагностики и лечения онкологических заболеваний или любых других патологий, включающих нежелательную клеточную пролиферацию.

Предпосылки создания изобретения

Злокачественное новообразование является заболеванием, характеризуемым неконтролируемым клеточным делением и ростом. Злокачественные новообразования приобретают способность инвазировать орган, из которого они произошли, распространяться через кровоток и лимфу в дистальные органы и фиксироваться и расти на них. Это является высоко гетерогенным процессом, но общим для более чем 200 типов злокачественных новообразований с совершенно различной эволюцией. Для развития заболевания необходимо одновременное изменение нескольких генов. Все эти свойства усложняют изучение и раскрытие механизмов возникновения злокачественных новообразований, и, таким образом, изучение злокачественных новообразований является широкой и мультидисциплинарной областью и включает несколько направлений исследований. Важно отметить, что это заболевание занимает второе место в структуре смертности во всем мире и, как ожидается, займет первое место к 2020 году, опережая смертность от сердечно-сосудистых заболеваний (Forteza F (2004) Avances médicos de Cuba. 40:33).

Действительно, злокачественные новообразования уже занимают первое место в структуре смертности в развитых странах и второе место - в развивающихся странах (World Health Organization. The Global Burden of Disease: 2004 Update. Geneva: World Health Organization; 2008). Заболеваемость растет в последних из упомянутых странах в связи с ростом стареющего населения, и еще чаще из-за предрасположенного к возникновению злокачественных новообразований образа жизни - гиподинамии, курения и «западных» диет.

По данным GLOBOCAN 2008 зафиксировано 12,7 миллионов пациентов, имеющих злокачественные новообразования, и 7,6 миллионов смертельных исходов в 2008 году; из них 56% пациентов и 64% смертельных исходов наблюдается в развивающихся странах (Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers CD, Parkin D. GLOBOCAN 2008, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC Cancer Base No. 10. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; Available from: http://globocan.iarc.fr.2010. Accessed 8/17/2010).

Выживаемость при злокачественных новообразованиях, как правило, ниже в развивающихся странах, вероятно из-за сочетания поздней диагностики и ограниченного доступа к своевременному и подходящему лечению, невзирая на цитотоксические средства, уже имеющиеся в продаже и оптимизированные для лечения злокачественных новообразований. Новые биологические молекулы необходимы для создания лекарственных средств против злокачественных новообразований нового поколения, более эффективных и безопасных в ближайшем будущем и способных в значительной степени проникать на рынок терапевтических средств против злокачественных новообразований.

На сегодняшний день принято считать, что, для того чтобы быть эффективным, лечение злокачественных новообразований должно сочетать различные принципы действия, такие как прямое воздействие на опухолевые клетки и влияние на окружающие опухоль условия. Это может быть достигнуто сочетанием молекул, в отдельности обладающих каждым из этих свойств или одновременно демонстрирующих оба из них. Безусловно, этот последний тип молекул является преимущественным с фармакологической и экономической точки зрения. Доклинические исследования ингибиторов ангиогенеза, предназначенных для прекращения доставки кислорода и питательных веществ в опухоль, продемонстрировали многообещающие результаты, зачастую достигая полной или частичной регрессии опухоли в отсутствие резистентности к ингибитору. До настоящего времени главным достижением клинических испытаний была продолжительная компенсация заболевания в течение заданного периода времени. С этой целью, антиангиогенные средства используются в качестве вспомогательного лечения в сочетании с другими противоопухолевыми средствами.

Результаты клинических испытаний показали, что однонаправленного действия регуляторов ангиогенеза недостаточно для продолжительного ингибиторного ответа. Возрастает потребность в более эффективных антиангиогенных средствах, способных заблокировать и также реверсировать опухолевый рост, для достижения значительного увеличения продолжительности жизни и качества жизни пациента в сравнении с общепринятыми способами лечения.

Имеющиеся в настоящее время пептиды представляют небольшую фракцию среди бесчисленного множества средств, используемых в терапевтических целях. Фактически, потенциал пептидов совершенствуется с помощью новых технологий для модификации их структуры, фармакокинетики, биораспределения, стабильности и доклинического применения. В частности, они приобрели актуальность в лечении злокачественных новообразований благодаря новым методологиям, имеющимся для их модификации и повышения их противораковой эффективности (Li, Zhi J.; Cho, Chi H. Current Pharmaceutical Design, 16 (10), April 2010, pp. 1180-1189).

Несколько исследований продемонстрировали возможность использования пептидов в диагностике и лечении злокачественных новообразований. Некоторые из них находятся на этапе близкой к завершению фазы клинических испытаний, и другие средства нового поколения уже появляются в последние годы с весьма перспективными результатами доклинических исследований.

Цитотоксическая активность литического пептида, сконструированного для связывания рецептора эпидермального ростового фактора, была продемонстрирована на некоторых раковых клеточных линиях человека. Было доказано, что конформационные изменения, возникающие при связывании литического пептида, увеличивали селективность его ассоциации с мембраной раковых клеток, и результатом этого приобретенного синергетического действия была селективная деструкция опухолевых клеток. Обработка литическим пептидом, связывающим рецептор эпидермального ростового фактора, обладала цитотоксической активностью in vitro против раковых клеток, устойчивых к ингибиторам тирозинкиназы, с мутациями K-ras (Kohno, Masayuki. European Journal of Cancer 47(5), p.773, Mar 2011).

Пенетрирующие клетку пептиды, как правило, соединены с олигонуклеотидами для повышения их эффективности в лечении злокачественных новообразований. С этой целью, пенетрирующие клетку пептиды конструируют с тем, чтобы глутаматный пептид был соединен с N-концом Oct6 NLS, который демонстрирует совместную локализацию в ядре клетки и также захват клеточными линиями рака поджелудочной железы и простаты (Lewis, H Dan. BMC Biotechnology, 10(1), p.79, Oct 2010).

Пептидный фрагмент из ингибитора сигнального пути тканевого фактора (TFPI), который является естественным антикоагулирующим белком, был способен блокировать опухолевый рост и ангиогенез в моделях in vivo. Более того, он ингибировал метастазирование опухоли и рост новых кровеносных сосудов без явного воздействия на нормальные сосуды (HEMBROUGH Todd A.; RUIZ Jose F.; SWERDLOW Bonnie M.; SWARTZ Glenn M.; HAMMERS Hans J.; ZHANG Li; PLUM Stacy M.; WILLIAMS Mark S.; STRICKLAND Dudley K.; PRIBLUDA Victor S. Blood A. 2004, vol. 103, n° 9, pp. 3374-3380).

Разработка более селективных веществ для визуализации и лечения различных опухолей является современной тенденцией в лечении и диагностике злокачественных новообразований. В этом смысле пептиды являются небольшими аминокислотными последовательностями, которые могут быть получены или сконструированы для связывания с заданной молекулой-мишенью, и они потенциально способны препятствовать ее функции. Эти специфические пептиды могут ингибировать компоненты специфических сигналов, необходимых для развития и прогрессирования злокачественных новообразований.

Серрализин является основным внеклеточным белком бактерии Serratia marcescens CMIB4202 и связан с патогенностью данного микроорганизма у людей с приписываемыми противоопухолевыми свойствами, зависящими от его каталитической активности (Wu Jun, Akaike T, Hayashida K, et al., (2001) Japanese J. Cancer Res. 92:439-451). В этом штамме (S. marcescens CMIB4202) наиболее высоко представленным белком является белок р50, который принадлежит семейству Serralysins (SERMA). Известно, что полипептид, содержащий С-концевой некаталитический домен серрализина (обозначаемый р25), является мощным ингибитором эндотелиальной пролиферации и роста первичных опухолей и метастазирования in vivo (Abrahantes-Pérez MC et al., «Pharmaceutical composition containing polypeptide fragments of serralysins». Международная патентная заявка № WO 2006/005268). Этот полипептид был назван CIGB370r в экспериментах по экспрессии в виде рекомбинантного белка в Escherichia coli.

Существует огромная потребность в идентификации и получении более эффективных противоопухолевых веществ в связи с увеличением числа вновь регистрируемых случаев этого заболевания с целью замены или дополнения современного лечения злокачественных новообразований для нуждающихся в нем пациентов, несмотря на наличие огромного числа лекарственных средств, предназначенных для этой цели.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение вносит вклад в решение вышеупомянутых проблем путем предоставления циклических пептидов с противоопухолевым и антиангиогенным свойством. В настоящем документе рассмотрено конструирование и получение этих пептидных соединений, при этом демонстрируя их эффективность на некоторых животных моделях рака.

Поразительно, что противоопухолевая активность полипептида р25 S. Marcescens воспроизводилась структурно ограниченным пептидным фрагментом, который был едва доступен внутри области взаимодействия N- и C-концевых доменов Serralisine. Это дало основание предположить, что структурная конформация в этой области полипептида являлась минимальной функционально активной структурной единицей полипептида р25, погруженной вовнутрь Serralysin и, вероятно, становясь доступной во время белкового аутокатализа или оказавшись в протеолитическом окружении опухоли. Данные, представленные в настоящем документе, демонстрируют, что структурно ограниченные пептиды по настоящему изобретению обладают прямой цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток и антиангиогенной активностью, и предполагают возможный механизм и новую парадигму об опухолевой регрессии, опосредованной инфекцией.

Пептиды являются очень пластичными молекулами и, соответственно, могут принимать различные структуры. Одна или несколько таких возможных структур могут иметь специфическую биологическую значимость. Для определения возможных значимых конформаций необходимо заключить пептиды в один-единственный участок конформационного пространства для дальнейшего определения значимой формы. В конечном итоге, путем скрининга некоторых из этих конформаций возможно найти биологически значимую конформацию.

Существуют новые методологии создания более точных синтетических структур. Необходимо принимать во внимание определенную гибкость в подходе. То есть, если конструируемая структура является слишком жесткой, другой структуре нельзя присвоить свойства, заданные для ее биологической активности in vivo, в виду того, что слегка пластичная структура способна к такому виду корректировки. Такое важное понимание требований, подлежащих применению в отношении рецепторов пептидов, активных сайтов ферментов и большого разнообразия других биологических процессов, обеспечивается использованием адекватных методик и методологий конструирования синтетических пептидов.

Свойства, проявляемые пептидом в биологических системах, зависят от структуры пептида. Следовательно, способность использовать рациональную конструкцию для получения пригодных пептидов зависит от соответствующих профессиональных знаний по установлению взаимосвязи между молекулярной структурой и ее биологической активностью. Профессиональные знания по признанию таких взаимоотношений основаны на некоторых неопределенностях, обусловленных не только системами биологического анализа, но также интерпретацией данных. Более сложным фактором, вовлеченным в данную проблему, является трудность определения трехмерной структуры самого пептида. Многие пептиды от природы являются пластичными и принимают широкий спектр конформаций в растворе. Проблема заключается в определении того, какая среди всех возможных конформаций ответственна за наблюдаемую активность пептида, рассматривая многие пептиды, активные в более чем одной конформации. Использование конформационных ограничений показало пригодность в выявлении таких взаимоотношений структура-функция. Если пептид ограничивается именно определенной конформацией или таковой, полностью похожей на семейство активных конформаций, тогда измеряемая активность непосредственно отражает эффект данной структуры. Даже когда невозможно получить молекулу с абсолютно жесткой структурой, можно начать с приписывания определенных биологических активностей вызывающим их структурам путем конструирования аналогов с заданными структурными мотивами.

В настоящем изобретении физическое картирование функциональных сайтов внутри последовательности белка р50/р25 путем использования синтетических пептидов длиной 20 а/к, перекрывающихся на участке длиной 10, и дальнейшего поиска цитотоксической активности in vitro на опухолевых клетках (см. пример 2) указывало на то, что пептид Gly255-Ser274 (N06P87) является активным. Однако активность этого пептида in vivo была ниже таковой, проявляемой белком р25. Кроме того, замена сегмента Gly266-Asp268 трипептидом Ala-Ala-Ala как в р25-подобном рекомбинантном полипептиде CIGB370r, так и в синтетическом пептиде N06P87 устраняла биологическую активность обеих молекул, указывая на то, что этот сегмент необходим для противораковой активности. Более того, исходя из данного результата, полагают, что требуется одна или несколько боковых цепей на остатках Arg267 и Asp268 для взаимодействия с рецептором(ами), еще не идентифицированных, несмотря на вероятный негативный эффект тройной мутации на соответствующий пептид и биологически активные белковые конформации. В этом смысле, если допускать, что локальная, биологически значимая структура трипептида подобна таковой в кристаллографической структуре р50, тогда замена Gly266 на Ala весьма невыгодна, поскольку основная цепь на этом остатке образует положительные торсионные углы, недопустимые для аланиновой аминокислоты (фиг.14). Кроме того, результаты, показанные в примере 2, доказывают то, что наличие самого по себе фрагмента Gly266-Asp268 недостаточно для достижения биологического эффекта и необходимы также другие остатки. Как показано в таблице 2, синтетический пептид F07P16, содержащий последовательность Thr265-Trp284 и перекрывающийся по 10 остаткам с линейным пептидом N06P87 (Gly255-Ser274), является неактивным, несмотря на имеющуюся в своем составе последовательность Gly266-Asp268.

В настоящем изобретении вызывает удивление идентификация Gly255-Ser274 как часть функционального сайта, ответственного за противораковую активность р50/р25, из-за криптической природы этого сегмента внутри 3D-структуры белка р50. Большинство аминокислот сегмента Gly255-Ser274 полностью или частично маскировано внутри 3D-структуры белка р50, включая остатки Thr257, Tyr258, Gly259, Phe260, Thr265, Arg267, Phe269, Leu270 и Thr272. Изгиб Arg267-Leu270 является частью поверхности стыка N- и C-концевых доменов белка. Остатки Arg267 и Asp268 образуют соляные мостики (каждый двойные водородные мостики) с остатками Asp98 и Arg171 N-концевого домена, соответственно. Поверхность стыка также содержит гидрофобные междоменные взаимодействия с участием остатка Phe269 в С-концевом домене и остатков Ala232 и Ala233 в N-концевом домене. Кроме того, криптическая природа данного сайта соответствует высокой эффективностью белка р25 по сравнению с таковой р50, поскольку у р25 отсутствует N-концевой домен и сегмент Gly255-Ser274 более доступен (см. пример 3, фиг.5 и таблицу 3).

В настоящем изобретении было доказано, что конформация пептида N06P87 существенно важна для его биологической активности. Значимость конформации пептида N06P87 для его биологической активности подтверждается результатами примера 4, демонстрирующего, что его активность зависит от фланкирующих областей, которые обеспечивают правильную укладку молекулы. С другой стороны, полипептид р25 не проявлял никакой активности при экспрессии в виде рекомбинантной молекулы и после ренатурации в отсутствие кальция. Следовательно, неструктурированные препараты, соответствующие полипептидам в отсутствие атомов кальция, не обладают активностью (связывание кальция необходимо для правильной укладки белка и стабилизации). Дополнительно в примере 4 показано, что введение дисульфидного мостика в пептид N06P87 - путем добавления цистеинового остатка на N-конце и другого на С-конце - обусловливает потерю биологической активности пептида (пептид N06P87 в таблице 4, фиг.7). Циклизация, обеспечиваемая этими способами, уменьшает конформационное пространство, доступное для пептида в растворе; тем не менее, циклизация несовместима с конформацией, принимаемой сегментом Gly255-Ser274 в уложенной структуре р50. Расстояние между аминоконцом и карбоксильным концом сегмента Gly255-Ser274 в кристаллографической структуре белка составляет 24,4 Å (фиг.10Е), что несовместимо со стереохимией дисульфидного мостика (расстояние между альфа углеродами соединяемых цистеинов никогда не бывает более 7 Å). Эта модификация, таким образом, предполагает значительное изменение структурных свойств пептидной цепи в N06P87. Эти результаты и их соответствующий анализ дают основание предполагать, что активная конформация N06P87 могла бы быть подобной таковой сегмента Gly255-Ser274 в нативном полипептиде р25.

Как показано в примерах 2, 4 и 6, практически возможно сконструировать пептидные аналоги со сходной биологической активностью полипептида р25. В данном изобретении представлено создание семейства потенциально активных пептидов короткого и среднего размера (длиной от 9 до 25 остатков), в основе которых лежит структура пептида N06P87 и модифицированные посредством введения/замены определенных химических групп и/или структурных ограничений (таблица 5), что позволяет этим пептидам проявлять значения эффективности и потенциальной активности, подобные или даже лучшие таковых полипептида р25.

Помимо эффективности и потенциальной активности, пептиды короткого и среднего размера по настоящему изобретению имеют ряд преимуществ в качестве противораковых средств по сравнению с нативными полноразмерными белками. Как правило, размер молекулы влияет на фармакокинетические свойства противораковых веществ (такие как биораспределение). Документально доказанными примерами являются рекомбинантные одноцепочечные антитела (r-sc-Fv) при сравнении с их соответствующими антителами, где первые из упомянутых демонстрируют лучшую доступность к тканям и опухолям, которые являются едва доступными для полноразмерных антител (Cortez-Retamozo V, Backmann N, Senter PD, Wernery U, De Baetselier P, Muyldermans S, Revets H; (2004). Cancer Res. 64(8):2853-7).

Терапия антителами оказала особенно ограниченное влияние на лечение солидных опухолей (Stern M, Herrmann R; (2005). Crit Rev Oncol Hematol. 54(1):11-29). В целом, экспериментальные данные указывают на то, что фармакокинетические свойства лиганда улучшаются при уменьшении его размера (Reilly R. M., Sandhu J., Alvarez-Diez T. M., et al. (1995). Clin. Pharmacokinet. 28: 126142). Пептиды короткого и среднего размера (обычно от 1 до 3 кДа) могут преодолеть, по крайней мере, частично эти трудности, с которыми сталкиваются при проведении лечения злокачественных новообразований с использованием антител (Ladner R. C., Sato A. K., Gorzelany J., de Souza M. (2004). Drug Discov. Today 9: 525529). В частности, пептиды могут обладать лучшей способностью проникать внутрь опухоли, более низким неспецифическим захватом и вызывать более низкий иммунный ответ.

Таким образом, пептиды по настоящему изобретению конструируют для оптимизации взаимодействия с их рецептором и, что особенно важно, для обеспечения эффективного биораспределения.

Как правило, пептиды короткого и среднего размера длиной до 20-25 остатков являются слабо иммуногенными, что не относится к гетерологичным белкам и особенно антигенам микроорганизмов, как р25. Использование таких белков в качестве терапевтических средств может вызвать иммунный ответ у пациентов с последующей индукцией синтеза антител, которые могут нейтрализовать терапевтический эффект белка. Этот эффект особенно значим при лечении хронических заболеваний, требующих повторного использования терапевтических средств. С другой стороны, если микроорганизм является патогеном для людей, то вполне вероятно, что фракция популяции индуцирует образование нейтрализующих антител, наличие которых до начала лечения потребует увеличения терапевтических доз лекарственного средства. В этой связи, поскольку значительная часть молекулярной поверхности сегмента Gly255-Ser274 нарушена внутри области взаимодействия N- и С-концевых доменов белка р50, и поэтому маскирована в нативной структуре белка. Следовательно, получаемый в результате пептид N06P87 потенциально является слабоиммуногенным, иначе говоря, антитела против белка р50 неэффективны в узнавании (нейтрализации) пептида N06P87. Исходя из вышеизложенного и рассматривая антигенный/иммуногенный потенциал терапевтической молекулы, более предпочтительным является использование пептидов вместо полноразмерных белков, особенно, когда пептиды способны вызывать биологический эффект подобный таковому природного белка.

Существенно важный аспект конструирования эффективных противораковых средств в настоящем изобретении включает конструирование циклических пептидов, то есть, они имеют аминокислоты, связанные ковалентными связями, включая химические группы, расположенные в боковых цепях, и/или группы на N- и С-концах. Таким образом, пептиды, сконструированные в настоящем документе, структурно ограничены посредством циклизации, что значительно снижает структурную пластичность этих молекул. В большинстве случаев использование пептидов в качестве терапевтических средств имеет несколько недостатков. Именно так обстоит дело для внутренней пластичности пептидов, особенно пептидов короткого и среднего размера, которые являются гораздо более гибкими, чем уложенные белки, и, следовательно, их процесс связывания с белками или другими рецепторными макромолекулами включает значительную потерю конформационной энтропии. Этот факт обусловливает у этих молекул, как правило, более низкую аффинность связывания, нежели таковую белок-белкового взаимодействия. Более низкая аффинность, демонстрируемая пептидами (и, следовательно, более низкая эффективность), может быть также связана с тем фактом, что белок-рецепторная контактная поверхность меньше по сравнению с белок-рецепторной областью взаимодействия, в частности, когда пептиды содержат фрагмент нативного белка. По этим причинам, реконструирование и химическая модификация пептидов необходимы для увеличения их аффинности связывания рецептора (и, следовательно, эффективности). Ранее был идентифицирован полипептид, полученный из опосредованной инфекцией модели регрессии опухоли, который был назван р25, оказывающий антиангиогенное и непосредственное воздействие на опухолевые клетки (международная патентная заявка № WO 2006/005268). В настоящем изобретении была разработана платформа, основанная на пептидах, имитирующих активный мотив полипептида р25, и демонстрирующая несколько усовершенствований по сравнению с исходной молекулой. Нативный полипептид бактериального происхождения может быть применен только ограниченное число раз для лечения злокачественных новообразований из-за потенциальной индукции иммунных ответов, которые могут нейтрализовать его активность, препятствуя пролонгированному лечению, требуемому при хронических заболеваниях, таких как злокачественные новообразования. Это является причиной, почему в настоящем изобретении область исследования была сфокусирована на создании молекул, полученных из инфекционно-опосредованной опухолевой регрессии и пригодных для лечения злокачественных новообразований, путем идентификации минимальной функционально активной единицы в полипептиде р25, которые мало чем отличаются от его противораковой активности, но не обладают способностью индуцировать негативный иммунный ответ во время пролонгированного применения лечения онкологических патологий или нежелательной клеточной пролиферации.

Значительный вклад настоящего изобретения заключается в возможности на практике создать пептидные молекулы длиной до 25 аминокислот, которые в структурном плане имитируют минимальную функционально активную единицу противоопухолевых белков, полученных из инфекционно-опосредованной опухолевой регрессии. Поражает то, что эти небольшие молекулы не проявляют своей активности в отношении опухоли иммуно-опосредованными механизмами, как это ранее рассматривалось в качестве парадигмы для инфекционно-опосредованной опухолевой регрессии (Paglia P, y Guzman CA. Cancer Immunol. Immunother. 1998. 46:88-92). Более того, другой новый аспект настоящего изобретения заключается в том, что эти активные области не расположены на экспонируемой поверхности бактериальных белков, но становятся поверхностными, как только происходит ферментативное расщепление белка. Этот процесс может происходить в богатой металлопротеиназами окружающей опухоль области, инициирующей интенсивное цитотоксическое воздействие на опухолевые клетки и ассоциированный с опухолью ангиогенез. Это обстоятельство также может вносить вклад в потенциальную противоопухолевую активность, ранее приписываемую инфекционно-опосредованной опухолевой регрессии, области исследования, ожидающей пригодность молекул для лечения злокачественных новообразований и способность стать новыми биотехнологическими продуктами в лечении онкологических заболеваний на протяжении более века. В настоящем документе продемонстрирована обоснованность этой гипотезы, поскольку обнаружено противоопухолевое действие пептидов по настоящему изобретению in vitro и in vivo при пролонгированном лечении без признаков наличия нейтрализующих антител, которые могут ограничивать их продолжительное применение. Масштаб используемой технологии их получения различен. Преимуществами этих пептидов являются:

• Широкий спектр действия на опухолевые клетки различного гистологического происхождения.

• Непосредственное воздействие на опухолевый ангиогенез и непосредственное воздействие на опухолевые клетки.

• Р53-независимый механизм действия.

• Цитотоксическое воздействие на клетки, выделенные из метастазов опухоли человека, и последующее антиметастатическое воздействие.

• Индуцируют апоптоз на опухолевых клетках и специфичны для клеток, у которых активирована пролиферация.

• Противоопухолевый эффект либо при системном, либо внутриопухолевом применении. Снижают скорость роста ксенографтных опухолей и пролонгируют выживаемость имеющих опухоль животных.

• Полная регрессия опухоли в целом ряде опухолей.

• Отсутствие токсичности при повторных инъекциях у животных в течение длительного периода времени.

• Имеет величину распределения выше таковой молекулы происхождения.

• Профиль биораспределения обеспечивает лечение злокачественных опухолей различных патологий.

• Экономически доступные технологии производства.

• Более практически осуществимая и более быстрая фармацевтическая разработка, нежели таковая молекул, полученных рекомбинантными технологиями.

Субъектами по настоящему изобретению являются циклические пептиды с антинеопластической и антиангиогенной активностью, где указанные циклические полипептиды характеризуются аминокислотной последовательностью, содержащей:

а) сегмент А с аминокислотной последовательностью:

X¹-Asn-Thr-X²-Arg-Asp-Phe-X³-X⁴,

где

X¹ является аминокислотой, выбранной из группы, содержащей Ser, Cys, Lys, Asp, Glu и искусственную аминокислоту, боковая цепь которой содержит функциональную сульфгидрильную группу, аминогруппу или карбоксильную группу; или последовательностью, выбранной из группы, содержащей тетрапептид, пентапептид и гексапептид,

X² является аминокислотой Gly или D-Ala,

X³ является аминокислотой, выбранной из группы, содержащей Leu, Cys, Lys, Asp, Glu и искусственную аминокислоту, боковая цепь которой содержит функциональную сульфгидрильную группу, аминогруппу или карбоксильную группу

X⁴ является дополнительной аминокислотой, которая может быть выбрана из группы, содержащей Ser, Cys, Lys, Asp, Glu и искусственную аминокислоту, боковая цепь которой содержит функциональную сульфгидрильную группу, аминогруппу или карбоксильную группу;

b) N-концевой сегмент, дополнительный и расположенный до сегмента, описанного в а), с аминокислотной последовательностью:

X^-5-Asp-Thr-Val-X^-4-X^-3-X^-2-X^-1, где

X^-1 является аминокислотой, выбранной из группы, содержащей Asn, D-Asp, D-Glu, D-Gln и D-Ala, и связанной пептидной связью с остатком X¹, описанным в а), и указанная пептидная связь содержит карбонильную группу на основной цепи остатка X¹ и аминогруппу на основной цепи остатка X¹ сегмента, описанного в а);

X^-2 является аминокислотой, выбранной из группы, содержащей Phe, Cys, Lys, Asp, Glu и искусственную аминокислоту, боковая цепь которой содержит функциональную сульфгидрильную группу, аминогруппу или карбоксильную группу,

X^-3 является аминокислотой, выбранной из группы, содержащей Gly и D-Ala,

X^-4 является аминокислотой, выбранной из группы, содержащей Tyr, Cys, Lys, Asp, Glu и искусственную аминокислоту, боковая цепь которой содержит функциональную сульфгидрильную группу, аминогруппу или карбоксильную группу,

X^-5 является аминокислотой, выбранной из группы, содержащей Gly и D-Ala,

c) C-концевой сегмент, дополнительный и расположенный после сегмента, описанного в а), аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, содержащей Thr-X⁺¹X⁺², Thr-X⁺¹-X⁺²-X⁺³ и Thr-X⁺¹-X⁺²-X⁺³-X⁺⁴,

где

N-концевой остаток Thr в указанном С-концевом сегменте соединен с сегментом, описанном в а), пептидной связью, которая содержит аминогруппу основной цепи указанного N-концевого остатка Thr и карбонильную группу основной цепи остатка X⁴ сегмента, описанного в а),

X⁺¹ является аминокислотой, выбранной из группы, содержащей Thr, Gly и Ala,

X⁺² является аминокислотой, выбранной из группы, содержащей Ser, Asn, Cys, Lys, Asp, Glu и искусственную аминокислоту, содержащую в боковой цепи функциональную сульфгидрильную группу, аминогруппу или карбоксильную группу,

X⁺³ является аминокислотой, выбранной из группы, содержащей Cys, Gln, Arg, Asn, Lys, Asp, Glu и искусственную аминокислоту, содержащую в боковой цепи функциональную сульфгидрильную группу, аминогруппу или карбоксильную группу,

X⁺⁴ является аминокислотой, выбранной из группы, содержащей Gln, Arg, Asn и Lys,

d) по меньшей мере ковалентную связь, выбранную из группы, содержащей пептидную связь, образованную аминогруппой и карбонильной группой N- и С-конца пептида, присутствующего, если последовательность X¹ сегмента, описанного в а), является последовательностью тетрапептида, пентапептида или гексапептида; ковалентный дисульфидный мостик, содержащий сульфгидрильные группы в боковой цепи остатков X¹ и X⁴, или X^-4 и X³, или X^-2 и X⁺², или X^-2 и X⁺³, если указанные X¹ и X⁴, или X^-4 и X³, или X^-2 и X⁺², или X^-2 и X⁺³ являются цистеинами или искусственной аминокислотой, боковая цепь которой содержит сульфгидрильную группу; амидную связь, содержащую карбонильную группу и аминогруппу в боковых цепях остатков X¹ и X⁴, или X^-4 и X³, или X^-2 и X⁺², или X^-2 и X⁺³, если указанные X¹ и X⁴, или X^-4 и X³, или X^-2 и X⁺², или X^-2 и X⁺³ являются Lys (или искусственная аминокислота, боковая цепь которой содержит аминогруппу) и Glu (или Asp или искусственная аминокислота, боковая цепь которой содержит карбонильную группу), или указанные остатки являются соответственно Glu (или Asp или искусственной аминокислотой, боковая цепь которой содержит карбонильную группу) и Lys (или искусственная аминокислота, боковая цепь которой содержит аминогруппу); и амидную связь, содержащую карбонильную концевую группу пептида и аминогруппу боковой цепи остатка X^-2, и указанная амидная связь присутствует, если X⁺² является остатком на карбоксильном конце пептида, Asn аминокислотой и X^-2 является аминокислотой Lys или искусственной аминокислотой, боковая цепь которой содержит аминогруппу.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения циклические пептиды содержат пептидную связь между аминогруппой и карбонильной группой N- и С-конца пептида, и последовательность X¹ указанных пептидов является аминокислотной последовательностью тетрапептида, предпочтительно, последовательностью, выбранной из группы, содержащей (D-Ser)-Pro-Thr-Pro, (D-Ala)-Pro-Thr-Pro и Gly-Pro-Thr-Pro.

В другом варианте осуществления изобретения указанные циклические пептиды содержат пептидную связь между аминогруппой и карбонильной группой на N- и С-концевых остатках пептида, и последовательность X¹ указанных пептидов является пентапептидной аминокислотной последовательностью, предпочтительно последовательностью, выбранной из группы, содержащей Arg-Arg-Pro-Asn-Ser, Arg-Arg-Pro-(D-Ala)-Ser, Lys-Lys-Pro-Asn-Ser и Lys-Lys-Pro-(D-Ala)-Ser. В другом варианте осуществления изобретения указанные циклические пептиды содержат пептидную связь между аминогруппой и карбонильной группой на N- и С-концах пептида, и последовательность X¹ указанных пептидов имеет гексапептидную аминокислотную последовательность, предпочтительно, последовательность, выбранную из группы, содержащей Thr-Pro-(D-Ala)-Gln-Asn-Ser, Arg-Pro-(D-Ala)-Gln-Asn-Ser, Thr-Pro-(D-Ala)-(_BmGln)-(_NmAsn)-Ser и Arg-Pro-(D-Ala)-(_BmGln)-(_NmAsn)-Ser, где _BmGln представляет собой аминокислоту L-b-метилглутамин и _NmAsn представляет собой аминокислоту L-N-метиласпарагин.

В данном изобретении циклические пептиды могут иметь N-конец, ковалентно связанный с ацетильной группой, пироглутаминовой аминокислотой, с липидом или полимером, предпочтительно, полиэтиленгликолем, и связь может быть образована напрямую или посредством спейсерной группы, предпочтительно, аминокислоты Gly. Более того, циклические пептиды по изобретению могут иметь С-конец в амидной форме или быть ковалентно связанными с липидом или полимером, предпочтительно, полиэтиленгликолем, и связь образуется напрямую или посредством спейсера, предпочтительно, аминокислоты Gly.

В другом варианте осуществления изобретения циклические пептиды могут содержать ковалентную связь между пептидом и липидом или любым полимером, предпочтительно, полиэтиленгликолем, и указанная связь может содержать сульфгидрильную группу, аминогруппу или карбоксильную группу на боковой цепи остатка X¹, X³, X⁴, X^-2, X^-4, X⁺² или X⁺³, и указанный остаток X¹, X³, X⁴, X^-2, X^-4, X⁺² или X⁺³ представляет собой аминокислоту Cys, Lys, Asp, Glu или искусственную аминокислоту, боковая цепь которой содержит функциональную сульфгидрильную группу, аминогруппу или карбоксильную группу.

В другом варианте осуществления изобретения циклическим пептидам могут быть свойственны остатки X¹, X³, X⁴, X^-2, X^-4, X⁺² или X⁺³, выбранные из группы, содержащей аминокислоту цистеин, (2R)-2-амино-3-сульфанилбутановую кислоту, (2R)-2-амино-3-метил-3-сульфанилбутановую кислоту, (2S)-2-амино-4-сульфанилбутановую кислоту, 2-амино-5-сульфанилпентановую кислоту, 2-амино-3-сульфанилпентановую кислоту, 2-амино-4-метил-3-сульфанилпентановую кислоту, 2-амино-3-метил-4-сульфанилпентановую кислоту, 2-амино-3,4-диметил-3-сульфанилпентановую кислоту, 2-амино-3-этил-3-сульфанилпентановую кислоту, (2R)-2-амино-3-метил-3-сульфанилпентановую кислоту, (4S)-4-амино-2-метил-5-сульфанилпентановую кислоту, (4R)-4-амино-2-метил-5-сульфанилпентановую кислоту, (4R)-4-амино-5-сульфанилпентановую кислоту, и (4S)-4-амино-5-сульфанилпентановую кислоту. В другом варианте осуществления изобретения циклическим пептидам могут быть свойственны остатки X¹, X³, X⁴, X^-2, X^-4, X⁺² или X⁺³, выбранные из группы, содержащей аминокислоту Lys, 2-[бис(3-аминопропил)амино]уксусн