Способ быстрого отбора вариантов gp-120 вич

Способ быстрого отбора вариантов gp-120 вич

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу быстрого отбора иммуногенов, которые могут индуцировать антитела с высокой нейтрализующей активностью (nAb). Описано и приведено в качестве примера несколько примеров таких иммуногенов с повышенной активностью nAb. В частности, описаны иммуногены с повышенной аффинностью антитела в отношении эпитопов Env ВИЧ-1.

Уровень техники

По расчетам, с 1982 года более 60 миллионов человек во всем мире было инфицировано вирусом иммунодефицита человека. Приблизительно половина из этих инфицированных индивидуумов умерли в результате синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) в течение того же периода времени. Несмотря на то, что в последнее время распространение вируса достигло плато, в 2009 годы было опубликовано о 2,5 миллионах новых ВИЧ-инфицированных. ВИЧ все еще представляет собой основную проблему здравоохранения. См. UNAIDS, 2010, Report on the global AIDS epidemic.

ВИЧ-1 представляет собой один из наиболее генетически многообразных вирусных патогенов, описанных на настоящее время. Существует три основных ветви филогенетического дерева ВИЧ-1, группы M (основной), N (новый) и O (посторонний). Вирусы группы M являются наиболее распространенными, насчитывая более 99% случаев инфекции во всем мире. В настоящее время эту группу разделяют на девять отдельных генетических подтипов или типов (от A до K), в основном в зависимости от коротких последовательностей гена env (оболочки). См. McCutchan F, AIDS, 2000, 14(S3):S31-S44 и Robertson D. et al., Science, 2000, 288:55-56.

Env представляет собой наиболее изменчивый ген ВИЧ-1, имеющий изменчивость последовательности до 35% между типами, изменчивость последовательности 20% внутри типа и изменчивость последовательности до 10% у инфицированного индивидуума. См. Kuiken C. et al., AIDS, 1996, 10:31-37 и Shankarappa R. et al., J. Virol., 1999, 73:10489-10502. Clade B is dominant in Europe, the Americas, and Australia. См. Kuiken C. et al., AIDS, 1996, Am. J. Epidemiol., 2000, 152:814-822. Clade C is common in southern Africa, China, and India and presently infects more people worldwide than any other clade. См. McCutchan, 2000, выше. Clades A and D are prominent in central and eastern Africa.

Однако большое число вирусов трудно классифицировать по типам вследствие обычно происходящего смешивания совместно циркулирующих вирусов, которое приводит к образованию рекомбинантных форм внутри типа. См. Heyndrickx L. et al., J. Virol., 200, 74:363-370 и McCutchan F. et al., Virology, 1999, 254:226-234. Некоторые рекомбинантные формы фактически дают важные эпидемиологические линии, называемые циркулирующие рекомбинантные формы (CRF). Две наиболее распространенные формы представляют собой CRF01 (AE), обнаруженный в Таиланде, который изначально классифицировали как тип E, хотя позже было обнаружено, что он является типом E только по env и типом A по другим частям генома, и CRF02, рекомбинантная форма AG, широко распространенная в Западной Африке. См. Robertson, 2000, выше. Во всем мире типы от A до D и рекомбинантые формы AE CRF01 и AG CRF02 насчитывают более 90% случаев инфицирования во всем мире.

Антитела с нейтрализующей активностью (nAb) в отношении белков оболочки вируса (Env) представляют собой первую линию приобретенной иммунной защиты против действия ВИЧ-1, благодаря блокированию инфицирования восприимчивых клеток. См. Kwong P, et al., Nature 1998; 393:648-659, Moore J, et al., J. Virol. 1994; 68:469-484, Moore P, et al., J. Virol. 1996; 70:1863-1872, and Parren P, et al., AIDS 1999; 13:S137-S162. Эффективность вакцин против некоторых вирусов объясняется их способностью индуцировать nAb. См. Burton D., Nat. Rev. Immunol., 2002, 2:706-713 и Zinkerangel R. et al., Adv. Immunol., 2001, 79:1-53. Однако несмотря на огромные усилия прогресс в разработке эффективных иммуногенов ВИЧ-1 крайне ограничен. См. Burton, 2002, выше, McMichael A., Hanke T., Nat. Med., 2003, 9:874-880 и Moore, 1996, выше. Для создания таких иммуногенов необходимо идентифицировать эпитопы, которые способны индуцировать более эффективную продукцию nAb. К сожалению, сделанные до настоящего времени попытки получения иммуногенов, которые вызывают продукцию широкого спектра nAb, были неудачными.

Таким образом, в данной области существует необходимость в новых иммуногенах ВИЧ-1, способных индуцировать более эффективную продукцию nAb.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу быстрого отбора иммуногенов (RIS), которые могут вызывать высокую активность nAb при использовании их в качестве B-клеточных иммуногенов. Способ включает: i) случайную мутацию нуклеотидной кодирующей последовательности представляющего интерес эпитопа дикого типа с получением библиотеки вариантов указанного эпитопа, ii) тестирование библиотеки с использованием антитела или его частей, в отношении которых известна аффинность к эпитопу дикого типа, и iii) отбор вариантов эпитопа, которые повышают аффинность антитела. Предпочтительно, эпитоп представляет собой эпитоп ВИЧ. Более предпочтительно, эпитоп представляет собой эпитоп Env.

Во втором варианте осуществления изобретение относится к нуклеотидным последовательностям и пептидам, получаемым способом RIS, таким как нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3.

В третьем варианте осуществления изобретение относится к применению нуклеотидных последовательностей и пептидов, получаемых способом RIS, для профилактики и лечения заболеваний, индуцируемых полностью или частично под действием представляющего интерес эпитопа дикого типа. Предпочтительно, заболевание представляет собой СПИД или заболевание, вызываемое инфекцией ВИЧ.

В четвертом варианте осуществления изобретение относится к диагностическому применению способа RIS.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Последовательность мутантов, идентифицированных способом RIS по изобретению. Верхняя последовательность соответствует аминокислотам 121-160 полипептида gp160 AC10. Последовательности соответствующих областей в выделенных клонах показаны в виде точек, где аминокислота является такой же, как аминокислота в gp160 AC10 или соответствует аминокислоте в этих положениях, где последовательность мутанта отличается от последовательности дикого типа.

Фигура 2. Предполагаемое взаимодействие между антителом 4E10 и конкретным мутантом LR1-C1. Показаны одиннадцать замен аминокислот во всем гене env, включая потерю 3 потенциальных N-связанных участков гликозилирования. Мутация C131Y является особенно релевантной, т.к. такая замена устраняет нативную дисульфидную связь между C131 и C157, разрушая структуру петли V1/V2.

Фигура 3. Для вириона LR1-C1, идентифицированного способом RIS по изобретению, показано повышение аффинности к антителу с нейтрализующей активностью широкого спектра действия 4E10. На графике показано титрование связывания вирионов с планшетами, покрытыми антителом 4E10, которое определено добавлением возрастающего количества изолята AC10 дикого типа и изолята LR1-C1 к планшетам, покрытым антителом 4E10 или без обработки. На диаграмме показано 4-кратное повышение аффинности антитела 4E10 к LR1-C1 по сравнению с вариантом дикого типа.

Фигура 4. Для вириона LR1-C1, идентифицированного способом RIS по изобретению с использованием антитела 4E10, не показана повышенная аффинность к другим антителам с нейтрализующей активностью широкого спектра действия. На графике показано титрование связывания вирионов с планшетами, покрытыми антителами 2F5 (панель A), 2G12 (панель B) или b12 (панель C), что определено при добавлении возрастающего количества изолята AC10 дикого типа, изолята LR1-C1 или вирионов, несущих делецию в гене env, к планшетам, покрытым антителами или без обработки.

Фигура 5. Выравнивание SEQ ID NO:31 с последовательностью HXB2 AC10 дикого типа. SEQ ID NO:31 обладает аффинностью к антителу PG16. Модифицированная последовательность содержит две мутации: i) N203S в потенциальном участке гликозилирования и ii) G604E в области антигенной детерминанты gp41.

Подробное описание изобретения

A. Способ быстрого отбора иммуногенов (RIS)

Изобретение относится к новому подходу оптимизации белка оболочки (Env) ВИЧ-1 в качестве иммуногена. В этом подходе учитывают зависимость способности эпитопа индуцировать антитела от его присутствия на вирионе. Способ основан на отборе вариантов с повышенной аффинностью к nAb широкого спектра действия из библиотеки вирионов со случайно мутировавшими белками оболочки.

Согласно изобретению полноразмерный ген env штамма АС10 ВИЧ используют для создания библиотеки случайно мутировавших оболочек с помощью способа ПЦР. Клонирование осуществляли в окружении pNL4-3 и получали вирионы посредством временной трансфекции в клетки 293T. Отбор вирусов с повышенной аффинностью в отношении nAb 4E10 широкого спектра проводили с помощью улучшенного анализа захвата вириона в растворе. РНК экстрагировали из захваченной популяции вируса и проводили ПЦР с обратной транскрипцией с получением гена env из соответствующих вирусов для дальнейшего секвенирования и клонирования обратно в окружение pNL4-3. После одного круга отбора выделяли оболочку с 4-кратной повышенной аффинностью в отношении антитела 4E10. См. примеры.

Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к способу идентификации иммуногенов, способных индуцировать антитела с нейтрализующей активностью против полипептида, который включает:

i) приведение в контакт антитела с нейтрализующей активностью, специфичного для указанного полипептида, с библиотекой рекомбинантных вирусов, где каждый из указанных рекомбинантных вирусов содержит рандомизированный ген, кодирующий вариант указанного полипептида и экспрессирующий указанный полипептид,

ii) отделение членов библиотеки рекомбинантных вирусов, которые связываются с антителом с нейтрализующей активностью, от членов, которые не связываются, по их способности связываться с антителом с нейтрализующей активностью и

iii) определение последовательности вариантов полипептидов, обнаруженных среди членов библиотеки рекомбинантных вирусов, отобранных на стадии (ii).

Как используется в настоящем описании термин "иммуноген" обозначает вещество, которое способно индуцировать приобретенный иммунный ответ у индивидуума, где указанный приобретенный иммунный ответ способен индуцировать иммунный ответ, со значительным вовлечением патогенных агентов, которые обладают общими иммунологическими свойствами с иммуногеном.

Термин "индукция", когда относится к иммунному ответу, как используют в настоящем изобретении, относится к специфическому контролю или к влиянию на активность иммунного ответа и включает активацию иммунного ответа, стимуляцию иммунного ответа, усиление иммунного ответа и/или изменение иммунного ответа (например, посредством индукции типа иммунного ответа, который в свою очередь изменяет преобладающий тип иммунного ответа у индивидуума от одного типа иммунного ответа, который является вредным или неэффективным, на другой тип, который является благоприятным и защитным).

Термин "антитело с нейтрализующей активностью" представляет собой любое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с патогеном и нарушает способность патогена инфицировать клетку и/или вызывать заболевания у индивидуума. Как правило, используемые в способе по настоящему изобретению антитела с нейтрализующей активностью связываются с поверхностью патогена и ингибируют или уменьшают инфекцию патогеном по меньшей мере на 99 процентов, по меньшей мере на 95 процентов, по меньшей мере на 90 процентов, по меньшей мере на 85 процентов, по меньшей мере на 80 процентов, по меньшей мере на 75 процентов, по меньшей мере на 70 процентов, по меньшей мере на 60 процентов, по меньшей мере на 50 процентов, по меньшей мере на 45 процентов, по меньшей мере на 40 процентов, по меньшей мере на 35 процентов, по меньшей мере на 30 процентов, по меньшей мере на 25 процентов, по меньшей мере на 20 процентов или по меньшей мере на 10 процентов по сравнению с инфекцией патогеном в отсутствии указанных антител(а) или в присутствии отрицательного контроля. Затем nAb можно тестировать для определения, обладают ли они нейтрализующей активность или активностью BNAb, используя любой из описанных в настоящем описании способов. Если антитела с нейтрализующей активностью или BNAb были индуцированы у животного, кроме человека, то CDR могут быть перенесены из каркаса, не являющегося каркасом человека, в каркас человека с получением антитела, подходящего для введения человеку. Способы определения, является ли антитело антителом nAb, описаны в данной области. См. Li M, et al., J. Virol., 2005, 79:10108-10125, Wei X, et al., Nature 2003, 422:307-312 и Montefiori D., Curr. Protoc. Immunol. 2005, Jan, Chapter 12:Unit 12.11. Эти способы основаны на определении снижения экспрессии репортерного гена после одного круга вирусной инфекции, используя получающую клеточную линию и вирус, который кодирует репортерный ген.

Как используется в настоящем изобретении термин "вирус" обозначает небольшой инфекционный агент, который может реплицироваться только внутри живых клеток различных организмов. Неограничивающие примеры семейств вирусов, которые можно использовать в способе по настоящему изобретению, включают Adenoviridae, вирусы подобные африканской лихорадке свиней, Arenaviridae, Arterivirus, Astroviridae, Baculoviridae, Birnaviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Circoviridae, Coronaviridae, Deltavirus, Filoviridae, Flaviviridae, Hepadnaviridae, Hepeviridae, Herpesviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Picomaviridae, Poxyviridae, Reoviridae, Retroviridae и Rhabdoviridae.

A.1 Стадия приведения в контакт

На первой стадии способ по изобретению включает приведение в контакт антитела с нейтрализующей активностью, специфичного в отношении полипептида, находящегося на поверхности указанного вируса, с библиотекой рекомбинантных вирусов, где каждый из указанных рекомбинантных вирусов содержит рандомизированный ген, кодирующий вариант указанного полипептида, находящегося на поверхности вируса.

Как используется в настоящем описании термин "библиотека" относится к различным коллекциям или смесям полинуклеотидов, содержащим полинуклеотиды, кодирующие различные рекомбинантные полипептиды. Размер и сложность библиотеки, которую используют в способах по настоящему изобретению, могут изменяться. Например, способы по изобретению можно использовать для скрининга библиотеки с до 500000 различных членов или библиотеки с 1×10⁶, 1×10⁸ или более членов. Характерные библиотеки вирусов содержат от 1×10⁸ до 1×10¹³ членов, и такие библиотеки могут быть скринированы способами по изобретению. Безусловно, такие библиотеки являются предпочтительными, хотя понятно, что способы также можно без труда использовать для скрининга гораздо меньших библиотек (например, библиотек с количеством членов от 1000 до 50000, от 50 до 1000 или от 100 до 500, или от 10 до 100, или от 5 до 100). Разнообразие вариантов в библиотеке можно получать посредством мутагенеза генов, кодирующих варианты на уровне триплетов ДНК, таким образом, что отдельные кодоны становятся мозаичными (например, с помощью праймеров частично рандомизированной последовательности в реакции ПЦР).

Когда речь идет о библиотеках молекул в настоящем описании, то этот термин можно использовать для обозначения библиотеки на уровне нуклеиновых кислот или белков (т.е. до или после экспрессии). Однако понятно, что такие библиотеки экспрессии должны быть предоставлены на уровне белков для того, чтобы отобрать взаимодействующих связывающихся партнеров. Таким образом, для того, чтобы стадия приведения в контакт (a) успешно прошла, необходимо, чтобы библиотеки были представлены на уровне белков (хотя исходно они могут быть представлены на уровне нуклеиновых кислот).

В предпочтительном варианте осуществления полипептид, против которого используют антитела с нейтрализующей активностью в стадии (i), экспрессируется в вирусе. В предпочтительном варианте осуществления полипептид находится "на поверхности вируса". В описании настоящего изобретения этот термин относится к любому полипептиду, который является доступным для реагентов, таких как антитела, без необходимости разрушения структуры вируса. Понятно, что расположенный на поверхности полипептид может быть капсидным полипептидом в случае безоболочечных вирусов или полипептидом оболочки в случае оболочечных вирусов. В предпочтительном варианте осуществления находящийся на поверхности вируса полипептид является полипептидом оболочки.

Для получения библиотеки рекомбинантных вирусов можно конструировать любой белок вирусной оболочки, где каждый из указанных рекомбинантных вирусов содержит рандомизированный ген, кодирующий вариант указанного полипептида. Характерные антигены включают антигены, выбранные из гемагглютинина вируса гриппа, гликопротеина G респираторно-синцитиального вируса человека, корового белка, белка матрикса или другого белка вируса денге, гемагглютинина вируса кори, гликопротеина gB вируса простого герпеса 2 типа, полиовируса I VP1, гликопротеинов оболочки или капсида ВИЧ-1 или ВИЧ-II, поверхностного антигена гепатита B, дифтерийного токсина, эпитопа 24M стрептококков, гонококкового пилина, g50 (gpD) вируса псевдобешенства, вируса псевдобешенства II (gpB), вируса псевдобешенства gIII (gpC), гликопротеина H вируса псевдобешенства, гликопротеина E вируса псевдобешенства, гликопротеина 195 трансмиссивного гастроэнтерита, белка матрикса инфекционного гастроэнтерита, гликопротеина 38 ротавируса свиньи, капсидного белка парвовируса свиньи, защитного антигена Serpulinahydodysenteriae, гликопротеина 55 вирусной диареи крупного рогатого скота, гемагглютинин-нейраминидазы вируса болезни Ньюкасла, гемагглютинина свиного грипп, нейраминидазы свиного гриппа, вируса ящура, вируса холеры свиней, вируса инфлюэнца свиней, вируса африканской лихорадки свиней, Mycoplasma liyopneutiioniae, вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, гликопротеина E вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, гликопротеина G, вируса инфекционного ларинготрахеита, гликопротеина G или гликопротеина I вируса инфекционного ларинготрахеита, гликопротеина вируса Ла Кросс, вируса диареи новорожденных телят, вируса венесуэльского энцефалита лошадей, вируса Пунта-Торо, вируса лейкоза мышей, вируса опухоли молочной железы мышей, корового белка вируса гепатита B и поверхностного антигена или его фрагмента или производного вируса гепатита B, антигена вируса гриппа лошадей или вируса герпеса лошадей, включая нейраминидазу вируса гриппа лошадей типа A/Alaska 91, нейраминидазу вируса гриппа лошадей типа A/Miami 63, нейраминидазу вируса гриппа лошадей типа A/Kentucky 81, гликопротеина B вируса герпеса лошадей типа 1 и гликопротеина D вируса герпеса лошадей типа 1, антигена респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота или вируса парагриппа крупного рогатого скота, белка прикрепления (BRSV G) респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота, слитого белка (BRSV F) респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота, нуклеокапсидного белка (BRSV N) респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота, слитого белка вируса парагриппа типа 3 крупного рогатого скота, гемагглютинин-нейраминидазы вируса парагриппа типа 3 крупного рогатого скота, гликопротеина 48 и гликопротеина 53 вируса вирусной диареи крупного рогатого скота.

Предпочтительно, библиотека рекомбинантных вирусов представляет собой библиотеку ретровируса. Термин "ретровирус" означает любой РНК-вирус, который реплицируется в клетке-хозяине с помощью фермента обратной транскриптазы с образованием ДНК из его генома РНК и который относится к семейству Retroviridae.

Термин "ретровирус" используют в настоящем описании в его общепринятом значении, и, как правило, он включает класс вирусов, в которых генетический материал представляет собой одноцепочечную РНК, и которые используют обратную транскриптазу для транскрипции вирусной РНК в ДНК в хозяине. Ретровирусы, как предусмотрено в настоящем описании, могут, в частности, принадлежать к семейству вирусов Retroviridae, более конкретно, к подсемействам Oncovirinae, Lentivirinae или Spumavirinae, ретровирусы, как предусмотрено в настоящем описании, могут быть патогенными. Последовательности env могут быть получены из любого известного ретровируса, включая, но не ограничиваясь ими, ВИЧ, MuLV, SMRV, SFV, HPV, MMTV, SRV, HTLV-I, HTLV-II, BLV, BIV, SIV, вирус висны, EIAV, FIV и EIAV, и из любого вируса подсемейства ретровирусов (например, Oncovirinae, Lentivirinae или Spumavirinae). Многие клоны ретровирусов, включая клоны ВИЧ-1, являются хорошо охарактеризованными и доступными.

В частности, в настоящем описании предусмотрены ретровирусы, инфицирующие животных, более предпочтительно, ретровирусы теплокровных животных, еще более предпочтительно, позвоночных животных, еще более предпочтительно, млекопитающих, еще более предпочтительно, приматов и, наиболее предпочтительно, людей. Особенно предпочтительными в настоящем описании являются ретровирусы человека, включая, но ими не ограничиваясь, ВИЧ-1, ВИЧ-2, HTLV-I и HTLV-2. Общепринятые хранилища информации последовательности ВИЧ (и других ретровирусов) включают GenBank, EMBL, DDBJ и NCBI. Хорошо охарактеризованные клоны ВИЧ-1 включают HXCB2, ВИЧ-1-MN и ВИЧ-1-MN-ST.1. См. Hall L, et al., J. Virol., 1992, 66(9):5553-5560.

В предпочтительном варианте осуществления библиотека рекомбинантных вирусов представляет собой библиотеку вирусов ВИЧ, получаемых при рандомизации по меньшей мере одного поверхностного полипептида. Сокращение "ВИЧ" используют в настоящем описании для обозначения вирусов иммунодефицита человека в общем, и оно включает все типы и/или штаммы вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1) и вируса иммунодефицита человека 2 (ВИЧ-2) и является синонимичным более старым терминам для ВИЧ, таким как HTL VIII и LAV.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления различные члены библиотеки ВИЧ являются рандомизированными по гену env. Как используется в настоящем изобретении термин ген env относится к полинуклеотиду вирусного генома, который кодирует белок оболочки ВИЧ. Как используется в настоящем изобретении термины "полипептид Env" или "полипептид оболочки" относятся к молекуле, получаемой из белка оболочки ВИЧ. Белок оболочки ВИЧ представляет собой гликопротеин приблизительно 160 кДа (gp160). При вирусной инфекции клетки-хозяина gp160 расщепляется протеазами клетка-хозяина с образованием gp120 и интегрального мембранного белка gp41.

"Полипептид gp120" представляет собой молекулу, получаемую из области gp120 полипептида Env. Зрелые полипептиды gp120 дикого типа содержат приблизительно 500 аминокислот в своей первичный последовательности. Gp120 является сильно N-гликозилированным, что обуславливает кажущуюся молекулярную массу 120 кДа. Аминокислотная последовательность gp120 приблизительно составляет 511 аминокислот. Gp120 содержит пять относительно консервативных доменов (C1-C5), диспергированных с пятью вариабельными доменами (V1-V5). Вариабельные домены содержат много аминокислотных замен, вставок и делеций. "Полипептид gp120" содержит отдельные субъединицы и мультимеры. Участок gp41 закреплен (и пронизывает) мембранный бислой вириона, тогда так сегмент gp120 выступает в окружающую среду. Рецептор-связывающий домен gp120 расположен на N-концевой половине белка. За ним следует пролин-богатая область (PRR), которая, как предполагают, действует как шарнирная область или инициатор взаимодействия связывания рецептора с комплексом слияния. C-конец gp120 является высококонсервативным и взаимодействует с gp41. Примерные последовательности полипептидов gp160 дикого типа являются доступными. См. номера доступа GeneBank AAB05604 и AAD12142.

Рандомизацию гена env можно проводить по полной последовательности гена env или, предпочтительно, по части гена env, которая соответствует кодирующей области gp120, т.к. она представляет собой молекулу, которая взаимодействует с рецептором на клетки-мишени и которая является лучшим кандидатом для связывания с антителами с нейтрализующей активностью. Кроме того, рандомизацию области гена env, кодирующей gp120 можно проводить по полной последовательности, или она может быть направленной к одному или более доменам полипептида gp120. Таким образом, способ RIS по изобретению предусматривает использование библиотеки ВИЧ, получаемой рандомизацией в любой из консервативных петель (C1-C5) gp120, в любой из вариабельных петель (V1-V5) в gp120 или в предпочтительной комбинации консервативных областей и вариабельных петель. В предпочтительном варианте осуществления рандомизацию проводят по всему гену env. В другом варианте осуществления рандомизацию проводят в области гена env, соответствующей gp120. В другом варианте осуществления рандомизацию проводят в областях гена env, соответствующих областям V1 и/или V2 gp120.

Для введения мутации в молекулу нуклеиновой кислоты можно использовать любые способы мутагенеза. См. Sambrook J, et al., “Molecular Cloning. A Laboratory Manual” (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, US, 1989), Bishop T, et al., “Nucleic Acid and Protein Sequence. A Practical Approach” (IRL Press, Oxford, England, 1987), Reznikoff W, Ed., “Maximizing Gene Expression” (Butterworths Publishers, Stoneham, MA, US, 1987), Davis L, et al., “Basic Methods in Molecular Biology” (Elsevier Science Publishing Co., New York, NY, US, 1986), Schleef M, Ed., “Plasmid for Therapy and Vaccination” (Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Germany 2001), Adereth Y, et al., Biotechniques 2005, 38:864-868, Allan J, et al., Biotechniques 1995; 18:746-750, Bubeck A, et al., J. Virol. 2004, 78:8026-8035, Doran B, патентная публикация США 20070111201, Locher C, et al., DNA Cell Biol. 2005; 24:256-263, Vasl J, et al., Biotechniques 2004; 37:726-730, Weiss G, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97:8950-8954, и Delcourt M, US 6924112. Стратегии мутагенеза включают случайный мутагенез, Ala-сканирующий мутагенез, сайт-специфический мутагенез и химерную рекомбинацию. Наборы и службы для проведения мутагенеза являются коммерчески широкодоступными.

Термин "антитела с нейтрализующей активностью" включает подкласс BNAb. Как используется в настоящем изобретении под "антителом с нейтрализующей активностью с широким спектром действия" или "BNAb" понимают антитело, получаемое любым способом, которое при доставке в эффективной дозе можно использовать в качестве терапевтического средства для профилактики или лечения инфекции ВИЧ или СПИД, против более 7 штаммов ВИЧ, предпочтительно, более 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более штаммов ВИЧ. Подходящие антитела с нейтрализующей активностью, которые можно использовать в способе RIS по настоящему изобретению включают, но ими не ограничиваются, антитела, направленные против мембрано-проксимального внешнего региона (MPER), антитела, направленные против участка связывания CD4, и антитела, направленные против гликанов с высоким содержанием маннозы. В предпочтительных вариантах осуществления антитела с нейтрализующей активностью, которые можно использовать в способе RIS по настоящему изобретению включают одно или более антител, выбранных из группы, состоящей из:

a) антитела 4E10, которое распознает сегмент эктодомена gp41, прилежащего к вирусной мембране. См. Cardoso R, et al., Immunity, 2005, 22:163-173, номер доступа PHSL 90091703, каталожный номер NIH ARRRP 10091 и Katinger H, et al., US 5753503;

b) антитела 2F5, которое распознает сегмент эктодомена gp41, прилежащего к вирусной мембране. См. Ofek G. et al., J. Virol., 2004, 78:10724-10737, номер доступа PHSL 90.091704, каталожный номер NIH ARRRP 1475 и Katinger, выше;

c) антитела, описанного в EP 0822941, связывающегося с двумя различными антигенными детерминантами ВИЧ-1, где антигенные детерминанты представляют собой фрагменты gp160 и соответствуют аминокислотным последовательностям 79-184 и 326-400 процессированного gp120 изолята ВИЧ-1 BH10. См. номера доступа PHSL 95032240 и 95032241;

d) 2G12, которое распознает углеводороды на внешней поверхности gp120 (mAb 2G12). См. Trkola A, et al., J. Virol., 1996, 70:1100-1108, номер доступа EACC 93091517 и NIH ARRRP каталожный номер 1476;

e) антитела b12, которое распознает участок связывания CD4. См. Burton D, et al., Science, 1994, 266: 1024-1027, каталожный номер NIH ARRRP 2640 и Burton D, et al., EP 0675904; и

f) антител с нейтрализующей активностью PG9, PG16, PG20, PGG14 и PGC14. См. Chan-Hui P, et al., WO2010107939.

Способы определения, является ли антитело антителом nAb, описаны в данной области. Некоторые из этих способов основаны на определении уменьшение эффекта антитела, экспрессии репортерного гена после одного круга вирусной инфекции с использованием получающей клеточной линии, которая кодирует репортерный ген. См. Li, 2005, Wei, 2003, Montefiori, 2005, выше и Alvin C. WO2009117661.

Нейтрализующую способность антител для применения по настоящему изобретению можно охарактеризовать IC50 (т.е. концентрацией антитела, которая вызывает 50% снижение инфекции клетки-мишени). Предпочтительно, антитела с нейтрализующей активностью для применения по настоящему изобретению обладают IC50 2 мкг/мл или менее (менее 0,15 мкг/мл, менее 0,125 мкг/мл, менее 0,10 мкг/мл, менее 0,075 мкг/мл, менее 0,05 мкг/мл, менее 0,025 мкг/мл, менее 0,02 мкг/мл, менее 0,015 мкг/мл, менее 0,0125 мкг/мл, менее 0,01 мкг/мл, менее 0,0075 мкг/мл, менее 0,005 мкг/мл или менее 0,004 мкг/мл (концентрация антитела 10^-8 или менее, предпочтительно, 10^-9 M или менее, предпочтительно, 10^-10 M или менее, т.е. 10^-11 M, 10^-12 M, 10^-13 M или менее). Это означает, что для 50 процентной нейтрализации клинического изолята ВИЧ in vitro необходимы только очень низкие концентрации антитела. Активность может быть измерена стандартным анализом нейтрализации, как описано в данной области.

Стадию приведения в контакт проводят в условиях, достаточных для того, чтобы члены библиотеки рекомбинантных вирусов, которые способны специфически связываться с антителами с нейтрализующей активностью, фактически связывались с указанными антителами.

Как используется в настоящем изобретении термин "специфически связываться" (или его производные) относится к взаимодействию между связывающимися парами (например, двумя белками или соединениями). В некоторых вариантах осуществления константа аффинности взаимодействия составляет не более 10^-6 моль/литр, не более 10^-7 моль/литр или не более 10^-8 моль/литр. В основном фраза "специфически связывается" относится к специфическому связыванию одного соединения с другим, где уровень связывания, как измерено стандартным анализом (например, иммунологическим анализом), является статистически значимо выше контрольного фонового значения анализа.

Условия во время стадии приведения в контакт специалист в данной области может определять общепринятым способом. Примерные условия "приведения в контакт" могут включать инкубацию в течение от 15 минут до 4 часов (например, один час при 4°C, 37°C или при комнатной температуре). Однако их можно изменять при необходимости в зависимости, например, от природы взаимодействующих партнеров по связыванию. Образец можно необязательно и, предпочтительно, подвергать аккуратному встряхиванию, перемешиванию или вращению. Кроме того, можно добавлять другие соответствующие реагенты, такие как блокирующие средства, для снижения неспецифического связывания. Например, можно использовать 1-4 процентный BSA или другое подходящее блокирующее средство (например, молоко). Следует понимать, однако, что специалист может изменять и адаптировать условия для приведения в контакт в зависимости от цели способа скрининга. Например, если температура инкубации, например, составляет комнатную температуру или 37°C, это может повышать возможность идентификации связывающих средств, которые являются стабильными в этих условиях (например, в случае инкубации при 37°C, связывающие средства, которые являются стабильными в условиях, встречающихся в организме человека). Такое свойство может быть чрезвычайно полезным, если один или оба партнера по связыванию представляют собой кандидат для применения в некоторых видах терапевтического применения (например, антитело). Такие адаптации входят в компетенцию специалиста.

В предпочтительном варианте осуществления антитело с нейтрализующей активностью, используемое на стадии приведения в контакт, можно иммобилизовать на твердой подложке различными способами, известными специалистам в данной области, которые подробно описаны в патентной и научной литературе. Твердая подложка может представлять собой любое известное специалистам в данной области вещество, для которого известно, что на нем можно фиксировать антитело. Например, твердая подложка может представлять собой стенку тестового планшета для микротитрования или нитроцеллюлозный фильтр, или другую подходящую мембрану. Альтернативно, подложка может представлять собой гранулу или диск, такой как из стекла, стеклопластика, латекса или пластикового материала, такого как полистирол или поливинилхлорид. Подложка также может представлять собой магнитную частицу или волоконный оптический сенсор. См. Jorgenson R, et al., US 5359681.

Антитело можно иммобилизовать на твердой подложке различными способами, известными специалисту в данной области, которые подробно описаны в патентной и научной литературе. В контексте настоящего изобретения иммобилизация включает нековалентную связь, такую как адсорбция, и ковалентное связывание (которое может представлять собой прямую связь между антигеном и функциональными группами на подложке или может представлять собой связь посредством перекрестносшивающего средства). Предпочтительной является иммобилизация посредством адсорбции в лунке планшета для микротитрования или на мембране. В таких случаях адсорбцию можно получать приведением в контакт антитела в подходящем буфере с твердой подложкой в течение подходящего количества времени. Время приведения в контакт зависит от температуры, но, как правило, составляет приблизительно от 1 часа до 1 суток. В одном из вариантов осуществления приведение в контакт лунки пластикового планшета для микротитрования (такого как из полистирола или поливинилхлорида) с количеством антитела в диапазоне приблизительно от 10 нг приблизительно до 1 мкг и, предпочтительно, приблизительно 100-200 нг является достаточным для иммобилизации подходящего количества полипептида.

Ковалентное связывание антитела с твердой подложкой можно также получать сначала взаимодействием подложки с бифункциональным реагентом, который взаимодействует с подложкой и функциональной группой, такой как гидроксильная группа или аминогруппа, на антителе. Например, антитело можно ковалентно связывать с подложками, содержащими соответствующее полимерное покрытие, с использованием бензохинона или путем конденсации альдегидной группы на подложке с амином и активным водородом на партнере по связыванию хорошо известными способами.

Альтернативно, вместо иммобилизации антитела с нейтрализующей активностью ковалентно или нековалентно на подложке в изобретение предусмотрена возможность иммобилизации антитела посредством связывания с первым специфическим к Fc антителом или фрагментом антитела против Fc, который предварительно иммобилизовали на подложке. В дополнение к облегчению иммобилизации антитела первое антитело располагает антитело с нейтрализующей активностью так, чтобы повышать процент иммобилизованного антитела, которое является активным для связывания с членами вирусной библиотеки. Например, иммобилизацию можно проводить сначала приведением в контакт антитела, которое иммобилизовали на твердой подложке, как правило, в лунке планшета для микротитрования, с библиотекой, таким образом, чтобы обеспечить тем вирусам в библиотеке, которые обладают аффинностью к образцу антитела с нейтрализующей активностью, связывание с иммобилизованным антителом. Затем удаляют несвязавшийся образец из иммобилизованных комплексов антитело-вирус. Более конкретно, после того, как антитело иммобилизуют на подложке, как описано выше, как правило, оставшиеся участки связывания белка на подложке являются блокированными.

A.2 Стадия разделения

На второй стадии способ RIS по изобретению включает отделение тех членов библиотеки рекомбинантных вирусов, которые связываются с антителом с нейтрализующей активностью, от членов, которые не связываются, на основании их способности связываться с антителом с нейтрализующей активностью.

Указанная стадия разделения может относиться к физическому разделению (например, на гранулах или FACS) или удалению твердой фазы из реакционной смеси, или может относиться к стадии, в которой твердую фазу подвергают одной или более стадиям промывания для удаления других компонентов реакционной смеси. В вариантах осуществления, где проводят физическое разделение или удаление твердой фазы, предпочтительно, затем твердую фазу также подвергают одной или более стадиям промывания.

Стадии промывания можно проводить любым подходящим образом в зависимости от природы твердой фазы и взаимодействующих партнеров по связыванию, связанных с ней. Специалисту в данной области хорошо известны подходящие способы промывания твердых фаз в форме частиц. Например, если твердая фаза является фазой в форме частиц, то стадии промывания можно проводить центрифугированием частиц в таких условиях, что они образуют осадок при удалении супернатанта. Затем частицы можно ресуспендирова