Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики рака

Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики рака

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к новому фармацевтическому применению антитела против CAPRIN-1 или его фрагменту в качестве средства для лечения и/или профилактики рака.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рак является лидирующей причиной смертности. Проводимая в настоящее время терапия, главным образом, включает хирургическое вмешательство в сочетании с лучевой терапией и химиотерапией. Несмотря на разработку новых хирургических приемов и открытие новых противораковых средств в последние годы, результаты лечения рака ненамного улучшились в последнее время, за исключением некоторых типов рака. Недавние успехи в молекулярной биологии или иммунологии рака привели к идентификации антител, специфично взаимодействующих с раком, раковых антигенов, узнаваемых цитотоксическими T-клетками, генов, кодирующих раковые антигены и тому подобного. Потребность в специфичной терапии рака, нацеленной на раковые антигены, возрастает (непатентная литература 1).

При терапии рака желательно, чтобы пептиды, полипептиды или белки, распознаваемые в качестве антигенов, почти не присутствовали в нормальных клетках, но присутствовали специфично в злокачественных клетках, чтобы уменьшить побочные эффекты. В 1991 году Boon с соавторами (Ludwig Institute for Cancer Research, Belgium) выделили антиген меланомы человека MAGE1, узнаваемый CD8-позитивными T-клетками, способом клонирования кДНК на основе экспрессии с использованием аутологичных линий злокачественных клеток и реактивных по отношению к опухоли T-клеток (непатентная литература 2). Впоследствии сообщили о способе SEREX (серологическая идентификация антигенов посредством основанного на экспрессии рекомбинантов клонирования), который включает в себя идентификацию опухолевых антигенов, узнаваемых антителами, которые продуцируются in vivo в ответ на аутологичную злокачественную опухоль у пациента с раком, способом клонирования генов на основе экспрессии (непатентная литература 3 и патентная литература 1). С применением такого способа были выделены некоторые раковые антигены, которые практически не экспрессируются в нормальных клетках, но специфично экспрессируются в злокачественных клетках (непатентная литература 4-9). Кроме того, проводили клинические испытания клеточной терапии, нацеленной на некоторые раковые антигены, с использованием иммуноцитов, специфично отвечающих на раковые антигены, или специфичной по отношению к раку иммунотерапии с использованием вакцин или тому подобного, содержащих раковые антигены.

Тем временем, в последние годы во всем мире появились различные лекарства на основе антител, мишенью которых являются антигенные белки на злокачественных клетках, для лечения рака. Лекарства на основе антител оказывают некоторое фармакологическое действие в качестве специфичных для рака терапевтических средств, и поэтому привлекают внимание. Однако большинство антигенных белков, которые должны быть мишенями, также экспрессируются в нормальных клетках, так что не только злокачественные клетки, но и нормальные клетки, экспрессирующие антигены, также повреждаются в результате введения антител. Полученные побочные эффекты являются поводом для беспокойства. Поэтому предполагается, что идентификация раковых антигенов, которые специфично экспрессируются на поверхности злокачественной клетки, и применение антител, мишенью которых являются раковые антигены, в качестве фармацевтических средств позволит осуществить лечение основанными на антителах лекарственными средствами с более низкими побочными эффектами.

Цитоплазматический и ассоциированный с пролиферацией белок 1 (CAPRIN-1) экспрессируется, когда нормальные клетки в фазе покоя активируются или подвергаются клеточному делению, и он является внутриклеточным белком, который, как известно, образует внутриклеточные стрессовые гранулы с РНК в клетках для участия в транспорте мРНК и регуляции трансляции. При этом существует много других названий указанного CAPRIN-1, таких как GPI-заякоренный мембранный белок 1 или поверхностный маркерный белок 1 мембранного компонента (M11S1), поскольку такие белки были известны как якобы белки клеточной мембраны. Такие названия происходят на основании сообщения о том, что последовательность гена CAPRIN-1 соответствует мембранному белку, имеющему GPI-связывающую область и экспрессируемому в злокачественных клетках прямой и ободочной кишки (непатентная литература 10). Однако последовательность гена CAPRIN-1, представленная в указанном сообщении, оказалась неправильной, как было выявлено позднее. Недавно появилось следующее сообщение; а именно, делеция одного нуклеотида в последовательности гена CAPRIN-1, зарегистрированной в GenBank или тому подобной, вызывает сдвиг рамки, так что происходит утрата 80 аминокислот из C-конца, приводя к образованию артефакта (74 аминокислоты), который соответствует GPI-связывающей части, указанной в предыдущем сообщении, и кроме того, также присутствует другая ошибка с 5'-стороны генной последовательности, так что происходит утрата 53 аминокислот из N-конца (непатентная литература 11). Также недавно появилось сообщение о том, что белок, кодируемый последовательностью гена CAPRIN-1, зарегистрированной в GenBank или тому подобной, не является белком клеточной мембраны (непатентная литература 11).

Кроме того, на основе сообщения в непатентной литературе 10 о том, что CAPRIN-1 является белком клеточной мембраны, в патентной литературе 2 и 3 описано, что CAPRIN-1 (в качестве белка клеточной мембраны) под названием M11S1 может быть использован в качестве мишени для основанного на антителах лекарственного средства при терапии рака, хотя в рабочих примерах не описано лечение с применением антитела против данного белка. Однако, как сообщается в непатентной литературе 11, обычно полагали со времени подачи патентного документа 2 до настоящего времени, что CAPRIN-1 не экспрессируется на поверхности клетки. Содержание патентных документов 2 и 3, основанных только на неверной информации о том, что CAPRIN-1 является белком клеточной мембраны, не следует понимать как обычный уровень техники, известный специалистам в данной области.

ЛИТЕРАТУРА ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Патентная литература

Патентная литература 1: патент США № 5698396;

Патентная литература 2: US2008/0075722;

Патентная литература 3: WO2005/100998.

Непатентная литература

Непатентная литература 1: Tsuyoshi Akiyoshi, "Gan To Kagaku-Ryoho (Cancer and Chemotherapy)," 1997, Vol. 24, p551-519 (Cancer and Chemotherapy Publishers, Inc., Japan);

Непатентная литература 2: Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647 (1991);

Непатентная литература 3: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 92: 11810-11813 (1995);

Непатентная литература 4: Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997);

Непатентная литература 5: Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998);

Непатентная литература 6: Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998);

Непатентная литература 7: Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999);

Непатентная литература 8: Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996);

Непатентная литература 9: Hum. Mol. Genet6: 33-39, 1997;

Непатентная литература 10: J. Biol. Chem., 270: 20717-20723, 1995;

Непатентная литература 11: J. Immunol., 172: 2389-2400, 2004.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Проблема, решаемая изобретением

Целями настоящего изобретения являются: идентификация белка ракового антигена, специфично экспрессируемого на поверхности злокачественной клетки, и применение антитела, мишенью которого является белок ракового антигена, в качестве средства для лечения и/или профилактики рака.

СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ

В результате интенсивных исследований авторы настоящего изобретения в настоящее время получили кДНК, кодирующую белок, который связывается с антителом, присутствующем в сыворотке собак с раком молочной железы, способом SEREX, используя как библиотеки кДНК, полученные из тканей семенников собак, так и сыворотки собак с раком молочной железы. Кроме того, авторы настоящего изобретения получили в настоящее время белки CAPRIN-1, имеющие аминокислотные последовательности, пронумерованные четными числами среди последовательностей SEQ ID NO: 2-30, и антитела против таких белков CAPRIN-1, на основе полученного гена собак и соответствующих гомологичных генов человека, коровы, лошади, мыши и кур. Таким образом, авторы настоящего изобретения обнаружили в настоящее время, что CAPRIN-1 специфично экспрессируется в рака молочной железы, опухоли головного мозга, при лейкозе, лимфоме, раке легкого, раке шейки матки, раке мочевого пузыря, раке пищевода, раке прямой и ободочной кишки, раке желудка, раке почек, раке яичника, раке простаты и фибросаркоме, и что часть белка CAPRIN-1 специфично экспрессируется на поверхности каждой злокачественной клетки. Таким образом, авторы изобретения в настоящее время обнаружили, что антитело или антитела против части CAPRIN-1, экспрессируемой на поверхности каждой злокачественной клетки, является/являются цитотоксичными для CAPRIN-1-экспрессирующих злокачественных клеток. На основе указанных открытий было осуществлено настоящее изобретение, которое описано ниже.

Настоящее изобретение имеет следующие отличительные признаки.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака, содержащей антитело или его фрагмент в качестве активного ингредиента, обладающего иммунологической реактивностью по отношению к неполному полипептиду CAPRIN-1, при этом CAPRIN-1 представлен любой из последовательностей, пронумерованных четными числами в SEQ ID NO: 2-30, и при этом неполный полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37, или аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более высокую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 37.

В одном варианте указанная выше рак представляет собой рак молочной железы, опухоль головного мозга, лейкоз, лимфому, рак легкого, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак пищевода, рак прямой и ободочной кишки, рак желудка, рак почек, рак яичника, рак простаты или фибросаркому.

В другом варианте антитело является моноклональным антителом или поликлональным антителом.

В другом варианте антитело является человеческим антителом, гуманизированным антителом, химерным антителом, одноцепочечным антителом или биспецифичным антителом.

Настоящее описание включают все или часть содержания, которое раскрыто в описаниях и/или на чертежах в заявках на выдачу патента Японии № 2010-023454 и 2010-183162, на основании которых настоящая заявка притязает на приоритет.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Антитело против CAPRIN-1, применяемое в настоящем изобретении, является цитотоксичным для злокачественных клеток. Как таковое антитело против CAPRIN-1 применимо для лечения или профилактики рака.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 показывает картины экспрессии генов, кодирующих белки CAPRIN-1, в нормальных тканях и в линиях опухолевых клеток. Обозначение № 1 указывает на картины экспрессии генов, кодирующих белки CAPRIN-1, и обозначение № 2 указывает на картины экспрессии генов GAPDH.

Фиг.2 показывает цитотоксичность по отношению к линии злокачественных клеток молочной железы MDA-MB-157, экспрессирующих CAPRIN-1, поликлональных анти-CAPRIN-1-антител, которые взаимодействуют с поверхностями злокачественных клеток. Обозначение № 3 указывает активность, проявляемую в случае, когда добавляют поликлональное анти-CAPRIN-1-антитело № 1. Обозначение № 4 указывает на активность, проявляемую в случае, когда добавляют контрольное антитело, полученное от кролика, не подвергаемого иммунизации антигеном. Обозначение № 5 указывает на активность, проявляемую в случае добавления PBS вместо антител.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Противоопухолевую активность антитела против полипептида, представленного любой из последовательностей SEQ ID NO: 2-30, пронумерованных четными числами, используемого в настоящем изобретении, можно оценить благодаря определению in vivo подавления опухолевого роста у животных с раком или благодаря исследованию того, проявляет ли антитело или не проявляет цитотоксичность посредством иммуноцитов или комплемента по отношению к опухолевым клеткам, экспрессирующим полипептид, in vitro, как описано далее.

В данном контексте нуклеотидные последовательности полинуклеотидов, кодирующих белки, содержащие аминокислотные последовательности, пронумерованные четными числами (т.е. SEQ ID NO: 2, 4, 6,..., 28, 30) среди последовательностей SEQ ID NO: 2-30, представлены последовательностями, пронумерованными нечетными числами (т.е. SEQ ID NO: 1, 3, 5,..., 27, 29) среди последовательностей SEQ ID NO: 1-29.

Аминокислотные последовательности, которые представлены в виде SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 и 14 в списке последовательностей, приведенном в настоящем описании, представляют собой аминокислотные последовательности CAPRIN-1, выделенные в виде полипептидов, которые связываются с антителами, специфично присутствующими в сыворотке от собаки с раком, способом SEREX с использованием библиотеки кДНК из ткани семенников собаки и сыворотки собаки с раком молочной железы. Аминокислотные последовательности, представленные в виде SEQ ID NO: 2 и 4, представляют собой аминокислотные последовательности CAPRIN-1, выделенные в виде гомологов человека. Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 16, является аминокислотной последовательностью CAPRIN-1, выделенной в качестве гомолога, присутствующего у коров. Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 18, является аминокислотной последовательностью CAPRIN-1, выделенной в качестве гомолога, присутствующего у лошади. Аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 20-28, являются аминокислотными последовательностями CAPRIN-1, выделенными в качестве мышиных гомологов. Аминокислотная последовательность, представленная в виде SEQ ID NO: 30, является аминокислотной последовательностью CAPRIN-1, выделенного в качестве куриного гомолога (смотри пример 1, описанный далее). Известно, что CAPRIN-1 экспрессируется, когда нормальные клетки в фазе покоя подвергаются активации или стимуляции клеточного деления.

Было известно, что CAPRIN-1 не экспрессируется на поверхности клеток. Однако в результате исследования, проведенного авторами настоящего изобретения, в настоящее время выявлено, что часть белка CAPRIN-1 экспрессируется на поверхности различных злокачественных клеток. Таким образом, в настоящее время обнаружено, что антитело, узнающее неполный полипептид белка CAPRIN-1, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 37, или аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более высокую, предпочтительно 85% или более высокую, более предпочтительно 90% или более высокую, еще более предпочтительно 95% или более высокую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 37, проявляет противоопухолевую активность. Примеры антител согласно настоящему изобретению включают все антитела, которые связываются с фрагментом указанного выше белка CAPRIN-1 и проявляют противоопухолевую активность.

Описанное выше анти-CAPRIN-1-антитело, используемое в настоящем изобретении, может быть антителом любого типа, при условии, что оно может проявлять противоопухолевую активность. Примеры таких антител включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, рекомбинантные антител, такие как синтетические антитела, полиспецифичные антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела и одноцепочечные антитела (scFv), человеческие антитела и их фрагменты, такие как Fab, F(ab')₂ и Fv. Такие антитела и их фрагменты могут быть получены способами, известными специалистам в данной области. В настоящем изобретении требуются антитела, обладающие иммунологической реактивностью по отношению к белкам CAPRIN-1 или его неполным (поли)пептидам (то есть связывающиеся с белками CAPRIN-1 в результате взаимодействия антиген-антитело), и предпочтительно антитела, способные специфично связываться с белками CAPRIN-1. Предпочтительно они являются моноклональными антителами. Также можно применять поликлональные антитела, при условии, что могут быть стабильно продуцированы гомогенные антитела. Также в том случае, когда субъектом является человек, требуются человеческие антитела или гуманизированные антитела, чтобы избежать или чтобы подавить отторжение. Термин «специфично связывающееся с белком CAPRIN-1» в используемом в настоящем описании смысле означает, что антитело специфично связывается с белком CAPRIN-1, но по существу не связывается с другими белками, отличными от белка CAPRIN-1.

Противоопухолевую активность антитела, которое можно применять в настоящем изобретении, можно оценивать, как описано ниже, путем исследования in vivo подавления роста опухоли у животных с раком или путем исследования того, проявляет ли оно или не проявляет цитотоксическую активность in vitro, которая опосредована иммуноцитами или комплементом, по отношению к опухолевым клеткам, экспрессирующим полипептид.

Кроме того, примерами субъектов для лечения и/или профилактики рака согласно настоящему изобретению являются млекопитающие, такие как человек, комнатные животные, домашние животные и животные для соревнований. Предпочтительным субъектом является человек.

Получение антигенов и антител и фармацевтических композиций, относящихся к настоящему изобретению, описано ниже.

Получение антигенов для получения антител

Белки или их фрагменты, используемые в качестве сенсибилизирующих антигенов для получения анти-CAPRIN-1-антител, применяемых в настоящем изобретении, могут быть получены из любого вида животного без особого ограничения, такого как человек, собаки, крупный рогатый скот, лошади, мыши, крысы и куры. Однако белки или их фрагменты предпочтительно выбраны с учетом совместимости с исходными клетками, используемыми для слияния клеток. В общем, предпочтительными являются полученные от млекопитающих белки и, в частности, предпочтительным является белок, полученный из организма человека. Например, когда CAPRIN-1 является CAPRIN-1 человека, можно использовать белок CAPRIN-1 человека, его неполный пептид или клетки, экспрессирующие CAPRIN-1 человека.

Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности CAPRIN-1 человека и его гомологов можно получить, осуществляя доступ в GenBank (NCBI, U.S.A.) и используя такие алгоритмы, как BLAST или FASTA (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 5873-5877, 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).

В настоящем изобретении на основе нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 1 или 3) или аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 2 или 4) CAPRIN-1 человека определили, что нуклеиновая кислота-мишень или белок-мишень содержит последовательность, имеющую 70-100%, предпочтительно 80-100%, более предпочтительно 90-100%, еще более предпочтительно 95-100% (например, 97-100%, 98-100%, 99-100% или 99,5-100%) идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью или аминокислотной последовательностью ORF или зрелой части CAPRIN-1 человека. В используемом в настоящем описании смысле термин «идентичность последовательности в %» относится к процентному содержанию (%) идентичных аминокислот (или нуклеотидов) относительно общего количества аминокислот (или нуклеотидов) при выравнивании двух последовательностей для достижения наибольшего сходства с введением или без введения пробелов.

Длина фрагмента белка CAPRIN-1 варьирует от длины аминокислот эпитопа (антигенной детерминанты), который является минимальной единицей, узнаваемой антителом, до длины, составляющей менее полной длины белка. Термин «эпитоп» относится к полипептидному фрагменту, обладающему антигенностью или иммуногенностью у млекопитающих, предпочтительно у человека, и минимальная единица эпитопа состоит примерно из 7-12 аминокислот, например, 8-11 аминокислот. Таким образом, антитело согласно настоящему изобретению характеризуется узнаванием фрагмента, состоящего примерно из 7-12 аминокислот (например, 8-11 аминокислот) в аминокислотной последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 37, или в аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более высокую, предпочтительно 85% или более высокую, более предпочтительно 90% или более высокую, еще более предпочтительно 95% или более высокую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 37.

Полипептиды, содержащие указанный выше белок CAPRIN-1 человека или неполные пептиды белка, могут быть синтезированы способом химического синтеза, таким как Fmoc-способ (способ с использованием флуоренилметилоксикарбонила) или tBoc-способ (способ с использованием трет-бутилоксикарбонила) (под редакцией The Japanese Biochemical Society, Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimental Lecture Series) 1, Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, TOKYO KAGAKU DOZIN (Japan), 1981). Альтернативно указанные выше полипептиды также могут быть синтезированы обычными способами с использованием различных коммерчески доступных синтезаторов пептидов. Кроме того, с применением известных способов генетической инженерии (например, Sambrook et al., Molecular Cloning, 2^nd Edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3^rd Edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons) получают полинуклеотид, кодирующий указанный выше полипептид, и затем включают в экспрессирующий вектор, который затем вводят в клетку-хозяина, чтобы получить представляющий интерес полипептид в клетке-хозяине, и затем извлекают его.

Полинуклеотиды, кодирующие указанные выше полипептиды, можно легко получить известными способами генетической инженерии или обычными способами с использованием коммерчески доступного синтезатора нуклеиновых кислот. Например, ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, может быть получена в ПЦР с использованием библиотеки хромосомной ДНК человека или кДНК в качестве матрицы и пары праймеров, сконструированных так, чтобы можно было амплифицировать нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. Условия ПЦР могут быть соответствующим образом определены. Например, условия ПЦР включают в себя проведение 30 следующих циклов реакции: денатурация при 94°C в течение 30 секунд; отжиг при 55°C в течение периода времени от 30 секунд до 1 минуты; и элонгация при 72°C в течение 2 минут, с использованием термостабильной ДНК-полимеразы (например, Taq-полимеразы или Pfu-полимеразы) и буфера для ПЦР, содержащего Mg²⁺, с последующим проведением реакции при 72°C в течение 7 минут. Однако условия ПЦР не ограничены приведенным выше примером. Способы ПЦР, условия и тому подобное описаны в публикации Ausubel с соавторами (Short Protocols in Molecular Biology, 3^rd Edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley and Sons (в частности в главе 15)).

Также на основе информации о нуклеотидной последовательности и аминокислотной последовательности, представленной в виде последовательностей SEQ ID NO: 1-30 в списке последовательностей, приведенном в настоящем описании, получают соответствующие зонды или праймеры и затем, используя их, проводят скрининг библиотеки кДНК человека или тому подобной, с тем, так что можно выделить требуемую ДНК. Библиотеку кДНК предпочтительно конструируют из клеток, органов или тканей, которые экспрессируют белки, имеющие последовательности SEQ ID NO: 2-30, пронумерованные четными числами. Примеры таких клеток или тканей включают клетки или ткани, полученные из семенников, и рака или опухоли, такие как лейкоз, рак молочной железы, лимфома, опухоль головного мозга, рак легкого, рак прямой и ободочной кишки и тому подобные. Способы, такие как получение зондов или праймеров, конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование генов-мишеней, известны специалисту в данной области и могут быть осуществлены способами, описанными Sambrook с соавторами (Molecular Cloning, 2^nd Edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989)), Ausbel с соавторами (выше), и тому подобными. Из полученной таким образом ДНК может быть получена ДНК, кодирующая белок CAPRIN-1 человека или его неполный пептид.

Клетками-хозяевами могут быть любые клетки, при условии, что они могут экспрессировать указанный выше полипептид. Примерами прокариотических клеток являются без ограничения клетки Escherichia coli и тому подобные. Примерами эукариотических клеток являются без ограничения клетки млекопитающих, такие как клетки почки обезьяны (COS1) и клетки яичника китайского хомячка (CHO), линия клеток почки плода человека (HEK293), линии клеток кожи плода мыши (NIH3T3), дрожжевые клетки, такие как почкующиеся дрожжи и делящиеся дрожжи, клетки шелкопряда и ооциты Xenopus.

В случае использования прокариотических клеток в качестве клеток-хозяев экспрессирующий вектор, используемый в настоящем изобретении, содержит начало, реплицируемое в прокариотических клетках, промотор, сайт связывания рибосомы, сайт множественного клонирования, терминатор, ген лекарственной резистентности, ген, комплементирующий ауксотрофность, и тому подобное. Примеры экспрессирующего вектора для Escherichia coli включают вектор на основе pUC, pBluescript II, систему экспрессии pET и систему экспрессии pGEX. ДНК, кодирующую указанный выше полипептид, включают в такой экспрессирующий вектор, прокариотические клетки-хозяева трансформируют вектором, полученные таким образом трансформированные клетки культивируют и, таким образом, полипептид, кодируемый ДНК, может быть экспрессирован в прокариотических клетках-хозяевах. В то же время полипептид также может быть экспрессирован в виде белка, слитого с другим белком.

При использовании в качестве клеток-хозяев эукариотических клеток экспрессирующий вектор, используемый в настоящем изобретении, представляет собой экспрессирующий вектор для эукариотических клеток, который содержит промотор, область сплайсинга, сайт добавления поли(A) и тому подобное. Примеры такого экспрессирующего вектора включают pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, вектор EBV, pRS, pcDNA3 и pYES2. Подобно упоминаемому выше случаю ДНК, кодирующую указанный выше полипептид, включают в такой экспрессирующий вектор, эукариотические клетки-хозяева трансформируют вектором, полученные таким образом трансформированные клетки культивируют и таким образом, полипептид, кодируемый ДНК, может быть экспрессирован в эукариотических клетках-хозяевах. Когда используют векторы pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 или тому подобные в качестве экспрессирующего вектора, указанный выше полипептид может быть экспрессирован в виде слитого белка, к которому может быть добавлена метка из числа различных меток, таких как His-метка (например, (His)₆-(His)₁₀), FLAG-метка, myc-метка, HA-метка и GFP.

Для введения экспрессирующего вектора в клетки-хозяева можно применять известный способ, такой как электропорация, способ с использованием фосфата кальция, способ на основе липосом, способ с использованием DEAE-декстрана, микроинъекция, вирусная инфекция, липофекция и связывание с проникающим через клеточную мембрану пептидом.

Представляющий интерес полипептид может быть выделен и очищен из клеток-хозяев с использованием сочетания известных способов разделения. Примеры таких способов включают без ограничения обработку денатурирующим агентом, таким как мочевина или поверхностно-активное вещество, обработку ультразвуком, ферментативное расщепление, высаливание или фракционирование в растворителях и преципитация, диализ, центрифугирование, ультрафильтрация, гель-фильтрация, SDS-ПААГ, изоэлектрическое фокусирование ионообменная хроматография, гидрофобная хроматография, аффинная хроматография и обращено-фазовая хроматография.

Структура антитела

Антитело является гетеромультимерным гликопротеидом, который, в общем, содержит, по меньшей мере, две тяжелых цепи и две легких цепи. Антитела, отличные от IgM, представляют собой антитело, которое является гетеротетрамерным гликопротеидом с молекулярной массой примерно 150 кД, состоящим из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Обычно каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной дисульфидной ковалентной связью, однако количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями различных изотипов иммуноглобулинов варьируют. Каждая тяжелая цепь или каждая легкая цепь также имеет внутрицепочечную дисульфидную связь. Каждая тяжелая цепь имеет вариабельный домен (VH-область) на одном конце, за которой следует несколько константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (VL-область) и имеет одну константную область на конце, противоположном другому концу. Константная область легкой цепи совмещена с первой константной областью тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи совмещен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Специфичная область вариабельного домена антитела имеет специфичную вариабельность, и такую область называют определяющей комплементарность областью (CDR), в силу того, что она придает антителу специфичность связывания. Часть вариабельной области, которая является относительно консервативной, называют каркасной областью (FR). Полные вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи по отдельности содержат четыре FR, соединенные тремя CDR. Три CDR в тяжелой цепи называют CDRH1, CDRH2 и CDRH3 в порядке, начиная с N- конца. Подобным образом в случае легкой цепи CDRL называют CDRL1, CDRL2 и CDRL3. CDRH3 наиболее важна для специфичности связывания антитела с антигеном. Также CDR каждой цепи удерживаются вместе в состоянии близкого соседства друг с другом благодаря FR-областям, внося вклад в образование антигенсвязывающего участка антитела вместе с CDR из другой цепи. Константная область непосредственно не вносит вклад в связывание антитела с антигеном, но проявляет различные эффекторные функции, такие как участие в зависимой от антител опосредованной клетками цитотоксичности (ADCC), фагоцитоз посредством связывания с рецептором Fcγ, определение показателя времени полужизни/клиренса посредством неонатального Fc-рецептора (FcRn) и зависимая от комплемента цитотоксичность (CDC) посредством компонента C1q каскада комплемента.

Получение антитела

Термин «анти-CAPRIN-1-антитело» в используемом в настоящем описании смысле относится к антителу, обладающему иммунологической реактивностью по отношению к полноразмерному белку CAPRIN-1 белок или его фрагменту.

В используемом в настоящем описании смысле термин «иммунологическая реактивность» относится к свойству антитела связываться in vivo с антигеном CAPRIN-1. Посредством такого связывания in vivo осуществляется функция повреждения опухоли (например, гибель, супрессия или деградация). В частности, антитело, используемое в настоящем изобретении, может представлять собой антитело любого типа, при условии, что оно связывается с белком CAPRIN-1, таким образом, становясь способным повреждать опухоль, такую как лейкоз, лимфома, рак молочной железы, опухоль головного мозга, рак легкого, рак пищевода, рак желудка, рак почек, рак прямой и ободочной кишки, рак яичника, рак простаты или фибросаркома.

Примеры антитела включают моноклональное антитело, поликлональное антитело, синтетические антитело, полиспецифичное антитело, человеческое антитело, гуманизированные антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело и фрагмент антитела (например, Fab и F(ab')₂). Также антитело может представлять собой молекулу иммуноглобулина любого класса, такого как IgG, IgE, IgM, IgA, IgD или IgY, или любого подкласса, такого как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2.

Антитело может быть дополнительно модифицировано в дополнение к гликозилированию, ацетилированию, формилированию, амидированию, фосфорилированию, пегилированию (ПЭГ) или тому подобному.

Различные примеры получения антител описаны ниже.

Когда антитело является моноклональным антителом, мыши вводят, например, линию злокачественных клеток молочной железы SK-BR-3, экспрессирующую CAPRIN-1, для иммунизации, из организма мыши извлекают селезенку, отделяют клетки и затем такие клетки и клетки миеломы мышей сливают. Из полученных таким образом слитых клеток (гибридом) отбирают клон, продуцирующий антитело, обладающее эффектом подавления пролиферации злокачественных клеток. Гибридому, продуцирующую моноклональное антитело, которое оказывает действие, подавляющее пролиферацию злокачественных клеток, выделяют, гибридому культивируют и затем очищают антитело из надосадка культуры общим способом аффинной очистки, таким образом может быть получено антитело.

Гибридому, продуцирующую моноклональное антитело, также можно получить, например, как описано ниже. Сначала животное иммунизируют сенсибилизирующим антигеном согласно известному способу. Обычно способ осуществляют путем инъекции сенсибилизирующего антигена млекопитающему внутрибрюшинно или подкожно. В частности, сенсибилизирующий антиген разбавляют в PBS (фосфатно-солевом буфере), физиологическом растворе или тому подобном до соответствующего количества, затем суспендируют. Полученную суспензию при необходимости затем смешивают с подходящим количеством обычного адъюванта, такого как полный адъювант Фрейнда. После эмульгирования раствор вводят млекопитающему несколько раз каждый 4-21 день. Кроме того, при иммунизации сенсибилизирующим антигеном также можно использовать подходящий носитель.

Млекопитающего иммунизируют, как описано выше. После подтверждения появления требуемого уровня антител в сыворотке иммунизированные клетки собирают из организма млекопитающего и затем подвергают клеточному слиянию. Особенно предпочтительными иммунизированными клетками являются спленоциты.

Клетки миеломы млекопитающих используют в качестве других клеток-партнеров, сливаемых с иммунизированными клетками. В качестве клеток миеломы предпочтительно используют различные известные линии клеток, такие как P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8. 653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (deSt. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) и R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).

Слияние иммунизированной клетки и клетки миеломы можно осуществить, в основном, согласно известному способу, такому как, например, способ, описанный Kohler и Milstein (Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Более конкретно, описанное выше слияние клеток осуществляют, например, в присутствии ускорителя клеточного слияния в обычной питательной культуральной среде. В качестве такого ускорителя слияния используют полиэтиленгликоль (ПЭГ), вирус Сендай (HVJ), или тому подобные. При необходимости может быть добавлено вспомогательное средство, такое как диметилсульфоксид, и использовано, чтобы усилить эффективность слияния.

Отношение иммунизированных клеток к клеткам миеломы, используемое в настоящем изобретении, может быть установлено произвольно. Например, количество иммунизированных клеток, которое предпочтительно используется, составляет один к десяти к количеству клеток миеломы. В качестве культуральной среды, используемой для указанного выше слияния клеток, можно использовать культуральную среду RPMI1640, подходящую для пролиферации указанной выше линии клеток миеломы, культуральную среду MEM и другие культуральные среды, обычно используемые для культивирования такого вида клеток. Кроме того, вместе со средами можно использовать жидкость, дополняющую сыворотку, такую как фетальная сыворотка теленка (FCS).

Слияние клеток можно осуществлять, тщательно смешивая предварительно определяемые количества указанных выше иммунизированных клеток и клеток миеломы в указанной выше культуральной среде и добавляя раствор ПЭГ (например, имеющего среднюю молекулярную массу в диапазоне примерно от 1000 до 6000), предварительно нагретый примерно до 37°C, обычно в концентрации 30%-60% (масс./об.) и смешивая с получением при этом культуры, содержащей представляющие интерес гибридомы. Затем подходящую культуральную среду последовательно добавляют к полученной таким образом культуре, которую затем центрифугируют, чтобы удалить надосадок, и такую процедуру повторяют, чтобы удалить агент для слияния клеток или тому подобное, что не желательно для роста гибридом.

Полученные таким образом гибридомы культивируют для селекции в обычной культуральной селекционной среде (например, культуральной среде HAT, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культивирование в такой культуральной среде HAT продолжают в течение периода времени (обычно от нескольких суток до нескольких недель), достаточного для того, чтобы другие клетки (неслитые клетки), отличные от целевых гибридом, погибли. Затем осуществляют скрининг и разовое клонирование гибридомы, к