Очистка инсулина

Очистка инсулина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Данное изобретение относится к хроматографическому способу выделения белковых компонентов раствора, содержащего белок, в частности выделения инсулинового пептида с учетом родственных примесей.

Уровень техники

Очистка рекомбинантных белков и пептидов для фармацевтического применения в основном проводится с использованием способов жидкостной хроматографии. Хроматографические способы характеризуются признаками их стационарной фазы, например хроматографии с обращенной фазой для гидрофобных хроматографических смол, тем не менее на разделение влияет целый ряд параметров, например состав подвижной фазы. Ионообменная хроматография (IEC) характеризуется заряженной поверхностью неподвижной фазы и применением буферов, солей и контролем pH подвижной фазы. IEC оказалась очень эффективной в разделении родственных и неродственных примесей, тем не менее некоторые примеси могут быть очень трудно удалимыми, например, если имеется один и тот же заряд целевого полипептида и примеси.

GB 694530 и GB 729670 описывают кристаллизацию инсулина в присутствии хинолина или акридин-подобных веществ и веществ фенольной природы, соответственно, а также в присутствии цинка.

US 5504188 описывает приготовление кристаллов аналога инсулина (LysPro) при pH 5,5-6,5 в присутствии (среди прочих) ионов цинка.

WO 98/34953 описывает кристаллизацию белка с лизиновой боковой цепью, несущей липофильный заместитель (инсулин детемир), в растворе, содержащем ионы цинка, при этом кристаллизация достигается путем подведения pH раствора от кислого до pH 7-10.

US 3907676 раскрывает способ снижения антигенности инсулина, извлеченного из поджелудочных желез домашних млекопитающих, в частности свиных и бычьих поджелудочных желез, и содержащего антигенные инсулин-подобные вещества с молекулярной массой примерно 6000 вместе с некоторыми антигенными белками, полученными из поджелудочной железы, с молекулярной массой более 6000. Снижение антигенности получают, проводя инсулин через хроматографическую колонку с анионообменной смолой, которая предпочтительно является сильным основанием, при этом в качестве элюента используют водосодержащий алифатический одноатомный спирт и собирают фракции элюата, содержащие инсулин, свободный или по существу свободный от упомянутых примесей.

EP 1071703 показывает, что добавление ионов кальция к подвижной фазе обеспечивает повышенную селективность между гликозилированными и негликозилированными видами (в частности, для инсулина) по сравнению с традиционными RPC-способами (использующими одновалентные ионы).

US 3649456 в основном описывает замену буфера полипептида на RPC-подобной неподвижной фазе из водного раствора на раствор, содержащий органический растворитель, в присутствии различных солей, включая хлорид кальция.

US 5633350 описывает отделение витамин K-зависимых белков от витамин K-независимых белков в присутствии ионов кальция на ионообменных смолах.

GB 2173503 A описывает способ очистки инсулина с использованием слабокислого катионного обменника, предпочтительно с предоставлением гидрофобной матрицы. Фракционирование инсулина проводят путем поэтапного или непрерывного изменения концентрации растворителя в кислом диапазоне pH.

US 4129560 описывает способ очистки высокомолекулярных пептидов, которые имеют тенденцию к ассоциации, с помощью ионообменной хроматографии в водных буферных растворителях на кислотных или основных ионообменниках, при этом способ включает растворение неионных детергнетов в буферизованных растворителях.

US 2005-080000A раскрывает способ хроматографической очистки препроинсулинов, в котором вещества с большей молекулярной массой удаляют из водного раствора препроинсулина при первой хроматографии на анионообменной смоле в проточном режиме и при последующей второй хроматографии на катионном обменнике в режиме адсорбции, а также способ получения инсулинов, который включает способ получения препроинсулинов.

US 2006-167221 A раскрывает извлечение и изоляцию инсулинов из рекомбинантных источников, в частности тех, которые экспрессируются и секретируются дрожжами. Органические растворители использовали для извлечения форм инсулинового пептида, связанных с хозяйской поверхностью. Кроме того, раскрыты процедуры поэтапной очистки среды, экстракции растворителем и хроматографии для осуществления одновременного выделения и очистки растворимых и мембраносвязанных форм инсулина.

US 5278284 описывает способ удаления нужного белка из сложного раствора и извлечения нужного белка в очищенном виде, который заключается в добавлении сорбента силикагеля с размером пор, приблизительно равным размеру молекулы белка, к раствору, содержащему белок, позволяя белку сорбироваться на сорбенте, выделении сорбента из раствора и последующем выделении белка из сорбента.

US 6451987 раскрывает способ ионообменной хроматографии для выделения пептида из смеси, содержащей пептид и родственные примеси, а также промышленный способ, включающий такой способ ионообменной хроматографии.

Некоторые из них (часто родственные) примеси часто являются трудными для устранения или уменьшения в связи с формой пика, например, примеси, которые элюируются на передней или задней границе пика. Таким образом, результатом может быть недостаточная чистота белка, представляющего интерес.

Сущность изобретения

Данное изобретение предусматривает средства для контроля формы хроматографического пика для улучшенного удаления примесей, например, родственных примесей, которые в противном случае трудно удалить при высокой нагрузке белком, представляющим интерес, колонки с хроматографическим твердофазным материалом. Форма пика контролируется путем присутствия ди- или поливалентных ионов металлов в белоксодержащем растворе, наносимом на хроматографическую колонку (т.е. загружаемом в нее), в сочетании с подведением pH элюента, например, в отношении изоэлектрической точки (pI) для белка, представляющего интерес, и это делает возможным сбор очень концентрированного пула белка, представляющего интерес, в очищенной форме.

Автором (авторами) данного изобретения было обнаружено, что контролируемая форма пика может позволить повысить нагрузку белком, представляющим интерес, и, следовательно, повысить мощность и снизить число циклов для данного количества белка, которое нужно очистить, так что можно получить пулы с более высокими концентрациями.

Таким образом, в первом аспекте данное изобретение относится к хроматографическому способу выделения белковых компонентов белоксодержащего раствора, при этом указанный раствор содержит инсулиновый пептид и один или более чем один ди- или поливалентный ион металл, и указанный инсулиновый пептид способен к самоассоциации и/или структурному изменению в присутствии ди- или поливалентных ионов металлов, причем способ включает следующие этапы:

а. нанесение белоксодержащего раствора на колонку с хроматографическим твердофазным материалом, где нагрузка инсулиновым пептидом составляет по меньшей мере 6,0 г на литр объема колонки (g/L_CV, г/л_CV); и

б. элюция инсулинового пептида из указанного твердофазного материала с помощью элюента с pH максимум 8,5; и сбор пула инсулинового пептида, соответствующего по меньшей мере 75% по весу инсулиновому пептиду, нанесенному на колонку на этапе (а).

Во втором аспекте данное изобретение относится к хроматографическому способу выделения белковых компонентов инсулинсодержащего раствора, при этом указанный раствор, содержащий инсулиновый пептид, способен к самоассоциации и/или структурному изменению в присутствии цинка и двухвалентных ионов цинка, причем указанный способ включает следующие этапы:

а. нанесение инсулинсодержащего раствора на колонку с анионообменным хроматографическим твердофазным материалом, где нагрузка инсулиновым пептидом, представляющим интерес, составляет по меньшей мере 6,0 г на литр объема колонки (г/л_CV); и

б. элюция инсулинового пептида, представляющего интерес, из указанного твердофазного материала с помощью элюента с pH максимум 6,8; и сбор пула представляющего интерес инсулинового пептида, соответствующего по меньшей мере 90% по весу представляющему интерес инсулиновому пептиду, нанесенному на колонку на этапе (а).

В третьем аспекте данное изобретение относится к способу контроля формы пика при ионообменной хроматографии инсулиновых пептидов, способных к самоассоциации и/или структурному изменению в присутствии ди- или поливалентных ионов металлов с использованием

а. ди- или поливалентных ионов металлов для получения оптимального разделения инсулинового пептида и родственных примесей, при котором двухвалентные ионы металлов были добавлены, чтобы закрепить форму передней части пика инсулинового пептида, где родственные примеси элюируют перед инсулиновым пептидом.

Краткое описание графических материалов

Фиг.1-3: Изменение профиля инсулинового пика от растянутого заднего пика при высоких значениях pH (тонкая пунктирная кривая на фиг.3, рН=7,2), который соответствует нормальному профилю Ленгмюра расширенного пика при заданном значении pH (сплошная тонкая кривая на фиг.2, pH 6,8), к профилю с растянутым передним краем пика при низком значении pH (толстая пунктирная кривая фиг.1, pH 6,4) в присутствии Zn²⁺ в подвижной фазе, т.е. в белоксодержащем растворе.

Фиг.4. Хроматограмма эксперимента с Zn-балансом.

Подробное описание изобретения

Как упоминалось выше, данное изобретение относится к хроматографическому способу выделения белковых компонентов белоксодержащего раствора. В частности, целью данного изобретения является применимый в промышленности способ, при котором белок, представляющий интерес, можно отделять от родственных примесей, в то же время получая высокое извлечение белка, представляющего интерес. Такие родственные примеси, как правило, являются неантигенными.

В одном аспекте предусмотрен хроматографический способ выделения белковых компонентов белоксодержащего раствора, при этом указанный раствор содержит инсулиновый пептид и один или более чем один ди- или поливалентный ион металлов, указанный инсулиновый пептид способен к самоассоциации и/или структурному изменению в присутствии ди- или поливалентных ионов металла, причем указанный способ включает следующие этапы:

а. нанесение белоксодержащего раствора на колонку с хроматографическим твердофазным материалом, где нагрузка инсулиновым пептидом, представляющим интерес, составляет по меньшей мере 6,0 г на литр объема колонки (г/л_CV); и

б. элюция инсулинового пептида из указанного твердофазного материала с помощью элюента с pH максимум 8,5; и сбор пула инсулинового пептида, соответствующего по меньшей мере 75% по весу инсулиновому пептиду, нанесенному на колонку на этапе (а).

В другом аспекте предусмотрен хроматографический способ выделения белковых компонентов инсулинсодержащего раствора, при этом указанный раствор содержит инсулиновый пептид, который способен к самоассоциации и/или структурному изменению в присутствии цинка или двухвалентных ионов цинка, причем указанный способ включает следующие этапы:

а. нанесение инсулинсодержащего раствора на колонку с анионообменным хроматографическим твердофазным материалом, где нагрузка инсулиновым пептидом, представляющим интерес, составляет по меньшей мере 6,0 г на литр объема колонки (г/л_CV); и

б. элюция инсулинового пептида, представляющего интерес, из указанного твердофазного материала с помощью элюента с pH максимум 6,8; и сбор пула инсулинового пептида, представляющего интерес, соответствующего по меньшей мере 90% по весу представляющему интерес инсулиновому пептиду, нанесенному на колонку на этапе (а).

В другом аспекте предусмотрен способ контроля формы пика при ионообменной хроматографии инсулиновых пептидов, способных к самоассоциации и/или структурному изменению в присутствии ди- или поливалентных ионов металлов, с использованием

а. ди- или поливалентных ионов металлов для получения оптимального разделения инсулинового пептида и родственных примесей, где двухвалентные ионы металлов были добавлены, чтобы закрепить форму переднего края пика инсулинового пептида, где родственные примеси элюируются перед инсулиновым пептидом.

Белки могут происходить из экспрессионных систем дрожжей. В способе производства белков применение хроматографической очистки широко распространено. Белки, как правило, подвергают химическим модификациям и серии этапов хроматографической очистки, в частности колоночной хроматографии, включая высокоэффективную жидкостную хроматографию (или жидкостную хроматографию высокого давления, ВЭЖХ), например, обращенно-фазовую хроматографию (RPC), хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC) и ионообменную хроматографию (IEC) (например, анионообменную хроматографию (AIEC) или катионообменную хроматографию (CIEC)), аффинную хроматографию, эксклюзионную хроматографию, металл-хелатную хроматографию, псевдоаффинную хроматографию и/или хроматографию смешанного режима.

Принцип очистки белков с применением колоночной хроматографии основан на различиях в равновесии между неподвижной и подвижной фазами белков, которые нужно разделить. С помощью соответствующей комбинации неподвижной и подвижной фаз белки покидают колонку через разные интервалы времени. В контексте данного изобретения было обнаружено, что модификация подвижной фазы, изначально загруженной в колонку, посредством ди- или поливалентных ионов металлов обеспечивает усовершенствование формы пика по сравнению с контролем и тем самым обеспечивает отделение белка, представляющего интерес, от близкородственных примесей.

Важным параметром хроматографической очистки является емкость колонки, определенная как количество (целевого) белка, которое может связаться с колонкой. Емкость колонки зависит от концентрации белка в подвижной фазе, и изображение концентрации белка на стационарной фазе в зависимости от концентрации белка в подвижной фазе называют изотермами связывания. Изотермы связывания могут быть вогнутыми (хроматографические пики впереди) или выпуклыми (хроматографические пики позади) [J.M. Mollerup, Chem. Eng. Technol. 31 (2008) 864-874]. В редких случаях получаются s-образные изотермы, когда пики идут впереди при низко концентрированной подвижной фазе и позади при более высоко концентрированной подвижной фазе [J.M. Mollerup et al., J. Liq. Chromatogr. Rel. Technol. 32 (2009) 1577-1597].

Mollerup (J.M. Mollerup, Chem. Eng. Technol. 31 (2008) 864-874) ранее показали, что кооперативность, когда адсорбция одной молекулы способствует адсорбции другой молекулы, может привести к фронтальным хроматограммам.

В хроматографии привлекательно иметь наклон до высоких концентраций, близкий к начальному наклону изотермы, для получения небольшого объема пула и высокой концентрации пула.

Были определены некоторые существенные параметры:

- ди- или поливалентные ионы металлов (например, Zn²⁺) пытаются придать восходящее направление кривой изотермы, (dq/dc растет - q является концентрацией белка, связанного с твердофазным материалом, а с является концентрацией белка в растворе).

- Повышенная нагрузка на смолу придает нисходящее направление кривой (dq/dc уменьшается).

- при pH, близком к изоэлектрической точке, суммарный заряд мал, и силы отталкивания между белками малы.

- при приближении к изоэлектрической точке растворимость белка, как правило, уменьшается. Тем не менее, самоассоциация может привести к явному повышению растворимости вблизи изоэлектрической точки.

Белок, представляющий интерес

Термин «белок» предназначен для охвата белков, полипептидов и пептидов, состоящих по меньшей мере из десяти составных аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями. Составные аминокислоты могут быть выбраны из группы аминокислот, кодируемых генетическим кодом, и они могут быть природными аминокислотами, которые не кодируются генетическим кодом, а также синтетическими аминокислотами.

В данном описании термин «аминокислотный остаток» означает аминокислоту, в которой формально гидроксильная группа удалена из карбоксигруппы, и/или в которой формально атом водорода удален из аминогруппы.

Природными аминокислотами, которые не кодируются генетическим кодом, являются, например, γ-карбоксиглутамат, орнитин, фосфосерин, D-аланин и D-глутамин. Синтетические аминокислоты включают аминокислоты, полученные путем химического синтеза, т.е. D-изомеры аминокислот, кодируемых генетическим кодом, такие как D-аланин и D-лейцин, Aib (α-аминоизомасляную кислоту), Abu (α-аминомасляную кислоту), TLE (трет-бутилглицин), β-аланин, 3-аминометилбензойную кислоту, антраниловую кислоту.

22 протеогенные аминокислоты представляют собой: аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, цистин, глутамин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, гидроксипролин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин.

Таким образом, непротеогенная аминокислота представляет собой группировку, которая может быть включена в пептид через пептидные связи, но не является протеогенной аминокислотой. Примерами являются (но не ограничиваясь ими) γ-карбоксиглутамат, орнитин, фосфосерин, D-аминокислоты, такие как D-аланин и D-глутамин. Синтетические непротеогенные аминокислоты включают аминокислоты, полученные путем химического синтеза, т.е. D-изомеры аминокислот, кодируемых генетическим кодом, такие как D-аланин и D-лейцин, Aib (α-аминоизомасляную кислоту), Abu (α-аминомасляную кислоту), Tle (трет-бутилглицин), 3-аминометилбензойную кислоту, антраниловую кислоту, дезаминогистидин, бета-аналоги аминокислот, такие как β-аланин и т.д., D-гистидин, дезаминогистидин, 2-аминогистидин, β-гидроксигистидин, гомогистидин, N^α-ацетилгистидин, α-фторметилгистидин, α-метилгистидин, 3-пиридилаланин, 2-пиридилаланин или 4-пиридилаланин, (1-аминоциклопропил)карбоновую кислоту, (1-аминоциклобутил)карбоновую кислоту, (1-аминоциклопентил)карбоновую кислоту, (1-аминоциклогексил)карбоновую кислоту, (1-аминоциклогептил)карбоновую кислоту или (1-аминоциклооктил)карбоновую кислоту, α-метилпролин, 1-метилгистидин, 3-метилгистидин и 4,5,6,7-тетрагидро-1Н-имидазо-[4,5-с]-пиридин-6-карбоновой кислоты β-(1,2,4-триазол-1-ил)-аланин.

В данном описании термин «белок, представляющий интерес» означает белок (или белки), который желательно получить в изолированной, концентрированной или очищенной форме по сравнению с белком, присутствующем в белоксодержащем растворе (см. ниже). В некоторых случаях белок, представляющий интерес, может претерпевать некоторые четко определенные изменения в способе хроматографического процесса; конечно, следует понимать, что в таких случаях белок, представляющий интерес, в белоксодержащем растворе и в полученной форме может не быть химически или структурно одинаковым.

Считается, что хроматографический способ особенно пригоден для белков, которые способны к самоассоциации и/или структурным изменениям в присутствии ди- или поливалентных ионов металлов. Примерами таких белков являются инсулиновые пептиды, глюкагон-подобные пептиды, эксендины, глюкагон, hGH (человеческий гормон роста), апротинин, инсулин-подобный фактор роста-1, инсулин-подобный фактор роста-2, желудочный ингибирующий пептид, рилизинг-фактор гормона роста, пептид, активирующий аденилатциклазу гипофиза, секретин, энтерогастрин, соматостатин, соматотропин, соматомедин, паратгормон, тромбопоэтин, эритропоэтин, гипоталамические рилизинг-факторы, пролактин, тиреотропные гормоны, эндорфины, энкефалины, вазопрессин, окситоцин, опиоиды, GIP (желудочный ингибиторный полипептид), амид пептида гистидин-метионин, хелоспектины, гелодермин, пептид, связанный с пептидом, активирующим аденилатциклазу гипофиза, вазоактивный кишечный полипептид, в том числе его варианты (см. ниже).

Наиболее интересные в настоящее время белки выбраны среди инсулиновых пептидов, глюкагон-подобных пептидов и эксендинов, включая их варианты.

В некоторых особенно интересных воплощениях белок, представляющий интерес, выбран из инсулиновых полипептидов, включая их варианты.

Особенно интересной группой белков является та, которая представлена белками, способными к самоассоциации в присутствии ионов двухвалентных металлов, таких как Zn²⁺.

Термин «вариант», используемый в данном документе по отношению к белку, означает модифицированный белок, который является аналогом родительского белка, производным родительского белка (включая DPP-IV-защищенные формы) или производным аналога родительского белка (включая DPP-IV-защищенные формы).

Термин «аналог», используемый в данном документе по отношению к белку, означает модифицированный белок, в котором один или более чем один аминокислотный остаток белка замещен другим аминокислотным остатком, и/или в котором один или более чем один аминокислотный остаток удален из белка, и/или в котором один или более чем один аминокислотный добавлен к белку. Такое добавление или удаление аминокислотных остатков может иметь место на М-конце белка и/или на С-конце белка. Две различные и простые системы часто используются для описания аналогов: например, Arg³⁴-GLP-1 (7-37) или K34R-GLP-1 (7-37) обозначают аналог GLP-1, в котором природный лизин в позиции 34 заменен аргинином (стандартные однобуквенные аббревиатуры для аминокислот используются в соответствии с номенклатурой IUPAC-IUB).

Термин «производное», используемый в данном документе по отношению к родительскому белку, означает химически модифицированный родительский белок или его аналог, в котором по меньшей мере один заместитель не присутствует в родительском белке или его аналоге, т.е. родительский белок, который подвергся ковалентной модификации. Типичными модификациями являются амиды, углеводы, алкильные группы, ацильные группы, сложные эфиры, пегилирование и т.п. Примером производного GLP-1 (7-37) является Arg³⁴, Lys²⁶(N^ε-(γ-Glu(N^α-гексадеканоил)))-GLP-1(7-37). Производные также включают DPP-IV-защищенные формы изучаемого белка.

Термин «DPP-IV-защищенный», используемый в данном документе по отношению к белку, означает белок, который был химически модифицирован для того, чтобы сделать указанное соединение устойчивым к плазматической пептидазе дипептидиламинопептидазе-4 (DPP-IV). Фермент DPP-IV в плазме, как известно, участвует в разрушении некоторых белков (например, пептидных гормонов), например, GLP-1, GLP-2, эксендина-4 и т.д. Таким образом, нужно приложить значительные усилия, чтобы разработать аналоги и производные белков, чувствительные к DPP-IV-опосредованному гидролизу, с тем чтобы уменьшить скорость деградации посредством DPP-IV. В одном воплощении DPP-IV-защищенный белок является более устойчивым к DPP-IV, чем GLP-1 (7-37) или эксендин-4(1-39).

Термин «человеческий инсулин», используемый в данном документе, обозначает человеческий гормон инсулин, структура и свойства которого хорошо известны. Человеческий инсулин состоит из двух полипептидных цепей, называемых A-цепью и B-цепью. A-цепь является 21-аминокислотным пептидом, а B-цепь является 30-аминокислотным пептидом, при этом две цепи соединены дисульфидными мостиками: первый мостик между цистеином в позиции 7 A-цепи и цистеином в позиции 7 B-цепи, и второй между цистеином в позиции 20 A-цепи и цистеином в позиции 19 B-цепи. Третий мостик находится между цистеинами в позициях 6 и 11 A-цепи.

В человеческом организме гормон синтезируется в виде одноцепочечного предшественника проинсулина (препроинсулина), состоящего из препептида из 24 аминокислот, за которым следует проинсулин, содержащий 86 аминокислот в следующей конфигурации: препептид-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A, где C представляет собой связывающий пептид из 31 аминокислоты. Arg-Arg и Lys-Arg являются сайтами расщепления для отщепления связывающего пептида от A- и B-цепей.

Под «инсулином» в данном документе понимается человеческий инсулин или инсулин от других видов, такой как свиной или бычий инсулин.

Термин «инсулиновый пептид», используемый в данном документе, обозначает пептид (белок), который является инсулином или его аналогом или производным с инсулиновой активностью, т.е. активирует инсулиновый рецептор.

Термин «инсулиновый аналог», используемый в данном документе, означает модифицированный инсулин, в котором один или более чем один аминокислотный остаток инсулина замещен другим аминокислотным остатком, и/или в котором один или более чем один аминокислотный остаток удален из инсулина, и/или в котором один или более чем один аминокислотный добавлен к инсулину. Аминокислоты предпочтительно представляют собой аминокислоты, которые могут быть кодированы триплетом («кодоном») нуклеотидов, см. генную инженерию. В данном документе аминокислоты могут быть предоставлены их стандартными трехбуквенными кодами, предпочтительно: Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Cys, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Gin, Asn, Glu, Asp, Ser и Thr. Альтернативно, могут быть использованы однобуквенные коды.

В одном воплощении инсулиновый аналог содержит менее 8 модификаций (замен, делеций, добавлений (включая инсерции) и любых их комбинаций) по сравнению с родительским инсулином, альтернативно менее 7 модификаций по сравнению с родительским инсулином, альтернативно менее 6 модификаций по сравнению с родительским инсулином, альтернативно менее 5 модификаций по сравнению с родительским инсулином, альтернативно менее 4 модификаций по сравнению с родительским инсулином, альтернативно менее 3 модификаций по сравнению с родительским инсулином, альтернативно менее 2 модификаций по сравнению с родительским инсулином.

Модификации в молекуле инсулина обозначают с указанием цепи (A или B), позиции и одно- или трехбуквенного кода для аминокислотного остатка, заменяющего остаток природной аминокислоты.

Под «соединительным пептидом» или «C-пептидом» понимается соединяющая группировка «C» полипептидной последовательности B-C-A одноцепочечной проинсулиновой молекулы. В цепи человеческого инсулина C-пептид соединяет позицию 30 B-цепи и позицию 1 A-цепи и имеет 35 аминокислотных остатков в длину. Связывающий пептид включает две концевых двухосновных аминокислотных последовательности, например, Arg-Arg и Lys-Arg, которые выступают в качестве сайтов рестрикции для отщепления соединительного пептида от A- и B-цепей, чтобы сформировать двуцепочечную молекулу инсулина.

Под «desB30» или «B(1-29)» понимается природная инсулиновая B-цепь или ее аналог, в котором отсутствует аминокислотный остаток B30, а под «A(1-21)» понимается природная A-цепь инсулина. Таким образом, например, человеческий инсулин A21Gly, B28Asp, desB30 представляет собой аналог человеческого инсулина, в котором аминокислота в позиции 21 A-цепи замещена глицином, аминокислота в позиции 28 в B-цепи замещена аспарагиновой кислотой, а аминокислота в позиции 30 B-цепи удалена.

В данном документе такие термины как «A1», «A2», «A3» и т.д. показывают, соответственно, позиции 1, 2 и 3 в A-цепи инсулина (считая с N-конца). Аналогичным образом такие термины как «B1», «B2», «B3» и т.д. показывают, соответственно, позиции 1, 2 и 3 в В-цепи инсулина (считая с N-конца). При использовании однобуквенных кодов аминокислот такие термины, как «A21A», «A21G» и «A21Q» обозначают, что аминокислота в позиции A21 представляет собой A, G и Q, соответственно. При использовании трехбуквенных кодов аминокислот соответствующие выражения представляют собой A21Ala, A21Gly и A21Gin, соответственно.

В данном документе термины «A(0)» или «B(0)» указывают на позиции аминокислот, соседних с N-конца по отношению к A1 или B1, соответственно. Термины «A(-1)» или «B(-1)» указывают на позиции первых аминокислот с N-конца от A(0) или B(0), соответственно. Таким образом, «A(-2)» и «B(-2)» указывают на аминокислотные позиции, N-концевые по отношению к A(-1) и B(-1), соответственно, A(-3) и B(-3) указывают на аминокислотные позиции, N-концевые по отношению к A(-2) и B(-2), соответственно, и т.д.

В данном документе термины «A(0)» или «B(0)» указывают на позиции аминокислот, соседних с N-конца по отношению к A1 или B1, соответственно. Термины «A(-1)» или «В(-1)» указывают на позиции первых аминокислот с N-конца от A(0) или B(0), соответственно. Таким образом, «А(-2)» и «В(-2)» указывают на аминокислотные позиции, N-концевые по отношению к A(-1) и B(-1), соответственно, «А(-3)» и «В(-3)» указывают на аминокислотные позиции, N-концевые по отношению к A(-2) и B(-2), соответственно, и т.д. Термины «A22» или «B31» указывают на позиции аминокислот, C-концевых по отношению к А21 или B30, соответственно. Термины «A23» или «B32» указывают на позиции первых аминокислот, C-концевых по отношению к A22 или B31, соответственно. Таким образом, A24 и B33 указывают на позиции аминокислот, C-концевых по отношению к A23 и B32, соответственно, и т.д.

Примерами инсулиновых аналогов являются такие, в которых Pro в позиции 28 B-цепи заменен на Asp, Lys, Leu, Val или Ala, и/или Lys в позиции B29 заменен на Pro, Glu или Asp. Кроме того, Asn в позиции B3 может быть заменен на Thr, Lys, Gin, Glu или Asp. Аминокислотный остаток в позиции A21 может быть заменен на Gly. Также одна или более чем одна аминокислота может быть добавлена к C-концу A-цепи и/или B-цепи, например, Lys. Аминокислота в позиции В1 может быть заменена на Glu. Аминокислота в позиции B16 может быть заменена на Glu или His. Другими примерами инсулиновых аналогов являются аналоги с делециями, например аналоги, в которых аминокислота B30 человеческого инсулина удалена (человеческий инсулин des(B30)), инсулиновые аналоги, в которых аминокислота B1 человеческого инсулина удалена (человеческий инсулин des(B1)), человеческий инсулин des(B28-B30) и человеческий инсулин des(B27). Также примерами инсулиновых аналогов являются инсулиновые аналоги, в которых A-цепь и/или B-цепь имеют N-концевое удлинение, и инсулиновые аналоги, в которых A-цепь и/или B-цепь имеют C-концевое удлинение, например два остатка аргинина, добавленные к C-концу B-цепи. Другими примерами являются инсулиновые аналоги, содержащие комбинации упомянутых мутаций. Другими примерами инсулиновых аналогов являются инсулиновые аналоги, в которых аминокислота в позиции A14 является Asn, Gin, Glu, Arg, Asp, Gly или His, аминокислота в позиции B25 является His, и которые также, возможно, включают одну или более чем одну дополнительную мутацию. Также примерами инсулиновых аналогов являются инсулиновые аналоги человеческого инсулина, где аминокислотный остаток в позиции A21 является Gly, и где инсулиновый аналог также удлинен на C-конце двумя остатками аргинина.

Другие примеры аналогов инсулина включают, но не ограничиваясь ими: человеческий инсулин desB30; человеческий инсулин AspB28; человеческий инсулин AspB28, desB30; человеческий инсулин LysB3, GluB29; человеческий инсулин LysB28, ProB29; человеческий инсулин GlyA21, ArgB31, ArgB32; человеческий инсулин GluA14, HisB25; человеческий инсулин HisA14, HisB25; человеческий инсулин GluA14, HisB25, desB30; человеческий инсулин HisA14, HisB25, desB30; человеческий инсулин GluA14, HisB25, desB27, desB28, desB29, desB30; человеческий инсулин GluA14, HisB25, GluB27, desB30; человеческий инсулин GluA14, HisB16, HisB25, desB30; человеческий инсулин HisA14, HisB16, HisB25, desB30; человеческий инсулин HisA8, GluA14, HisB25, GluB27, desB30; человеческий инсулин HisA8, GluA14, GluB1, GluB16, HisB25, GluB27, desB30 и человеческий инсулин HisA8, GluA14, GluB16, HisB25, desB30.

Термин «производное инсулина», используемый в данном документе, означает химически модифицированный родительский белок или его аналог, в котором модификация(и) находится в форме амидов, углеводородов, алкильных групп, ацильных групп, сложных эфиров, пегилирования и т.п. Примерами производных человеческого инсулина являются метиловый эфир треонина человеческого инсулина ВЗО, человеческий инсулин GlyA21, ArgB31, Arg-амидB32, человеческий инсулин N^εB29-тетрадеканоил desB30, человеческий инсулин N^εB29-тетрадеканоил, человеческий инсулин N^εB29-деканоил desB30, человеческий инсулин N^εB29-додеканоил desB30, человеческий N^εB29-3-(2-{2-(2-метокси-этокси)-этокси}-этокси)-пропионил-инсулин, человеческий инсулин LysB29(Nε-гексадекандиол-γ-Glu)des(B30)); человеческий инсулин N^εB29-(N^α-(Sar-OC(CH₂)₁₃CO)-γ-Glu)desB30, человеческий инсулин N^εB29-ω-карбокси-пентадеканоил-γ-L-глутамиламид desB30, человеческий инсулин N^εB29-гексадекандиол-γ-амино-бутаноил desB30, инсулин N^εB29-гексадекандиол-γ-L-Glu-амид desB30.

Термин «глюкагон-подобный пептид», используемый в данном документе, относится к гомологичным пептидам глюкагон-подобному пептиду 1 (GLP-1), глюкагон-подобному пептиду 2 (GLP-2) и оксинтомодулину (ОХМ), полученным из гена препроглюкагона, эксендинам, а также к их аналогам и производным. Эксендины, которые найдены у Gila monster, гомологичны GLP-1, а также оказывают инсулинотропный эффект. Примерами эксендинов являются эксендин-4 и эксендин-3.

Термин «пептид GLP-1», используемый в данном документе, обозначает GLP-1 (7-37), амид GLP-1 (7-36), а также их аналоги и производные, которые можно получить с помощью обычных методик рекомбинантной ДНК, а также обычных синтетических способов. Такие GLP-1-пептиды включают, но не ограничиваясь ими, нативный глюкагон-подобный пептид-1, например, такие пептидные фрагменты, которые включают GLP-1 (7-37) и их функциональные производные, описанные в WO 87/06941; такие пептидные фрагменты, которые включают GLP-1 (7-36) и их функциональные производные, описанные в WO 90/11296; такие аналоги активных GLP-1-пептидов 7-34, 7-35, 7-36 и 7-37, описанные в WO 91/11457; такие производные GLP-1, в которых липофильный заместитель присоединен по меньшей мере к одному аминокислотному остатку, как описано в WO 98/08871; такие усеченные с М-конца фрагменты GLP-1, которые описаны в EP 0699686-А2; и такие аналоги и производные GLP-1, которые содержат N-концевую группу имидазола, как описано в EP 0708179-А2.

Термин «пептид GLP-2», используемый в данном документе, обозначает GLP-2 (1-35), GLP-2 (1-34), GLP-2 (1-33), а также их аналоги и производные, которые можно получить с помощью обычных методик рекомбинантной ДНК, а также обычных синтетических способов. Такие GLP-2-пептиды включают, но не ограничиваясь ими, нативный глюкагон-подобный пептид-2, производные GLP-2, в которых липофильный заместитель присоединен по меньшей мере к одному аминокислотному остатку, как описано в WO 98/08872, человеческий глюкагон-подобный пептид-2 (hGLP-2), GLP-2(1-30); GLP-2(1-31); GLP-2(1-32); GLP-2(1-33); GLP-2(1-34), GLP-2(1-35), Lys²⁰GLP-2(1-33), Lys²⁰Arg³⁰GLP-2(1-33), Arg³⁰Lys³⁴GLP-2(1-34), Arg³⁰Lys³⁵GLP-2(1-35), Arg^30,35Lys²⁰GLP-2(1-35), Arg³⁵GLP-2(1-35), Lys²⁰(N^ε-тетрадеканоил)GLP-2(1-33); Lys^20,30-бис(N^ε-тетрадеканоил)GLP-2(1-33); Lys²⁰(N^ε-тетрадеканоил)Arg³⁰GLP-2(1-33); Arg³⁰Lys³⁵(N^ε-тетрадеканоил)GLP-2(1-35); Arg^30,35Lys²⁰(N^ε-тетрадеканоил)GLP-2(1-35); Arg³⁵Lys³⁰(N^ε-тетрадеканоил)GLP-2(1-35); Arg³⁰Lys³⁴(N^ε-тетрадеканоил)GLP-2(1-34); Lys²⁰(N^ε-(ω-карбоксинонадеканоил))GLP-2(1-33); Lys^20,30-бис(N^ε-(ω-карбоксинонадеканоил))GLP-2(1-33); Lys²⁰(N^ε-(ω-карбоксинонадеканоил))-Arg³⁰GLP-2(1-33); Arg³⁰Lys³⁵(N^ε-(ω-карбоксинонадеканоил))GLP-2(1-35); Lys³⁰(N^ε-(γ-глутамил(N^α-тетрадеканоил)))hGLP-2, Lys³⁰(N^ε-(γ-глутамил(N^α-гексадеканоил)))hGLP-2, Arg^30,35Lys²⁰(N^ε-(ω-карбоксинонадеканоил))GLP-2(1-35); Arg³⁰Lys³⁴(N^ε-(ω-карбоксинонадеканоил))GLP-2(1-35); и Arg³⁰Lys³⁴(N^ε-(ω-карбоксинонадеканоил))GLP-2(1-34).

Термин «эксендин», используемый в данном документе, обозначает эксендин, а также его аналоги, производные и фрагменты, например, эксендин-3 и -4. Эксендин, а также его аналоги, производные и фрагменты описаны, например, в WO 99/43708, содержание которого включено в данное описание посредством ссылки во всей его полноте.

Одной из целей данного изобретения является разработка способа удаления одной или более чем одной родственной примеси в отношении белка, представляющего интерес.

Термин «родственная примесь» при использовании в данном документе означает примесь, которая обладает структурным сходством с белком, представляющим интерес. Родственная примесь имеет химическую или физическую структуру, отличную от белка, представляющего интерес, например усеченную форму, удлиненную форму (дополнительные аминокислоты, различные производные и т.д.), дезамидированную форму, неправильно свернутую форму, форму с нежелательным (например, избыточным, неверным или недостаточным) гликозилированием, включая сиалилирование, окисленные формы, формы, полученные при рацемизации, формы, в которых ацилирование имеет место на другом остатке, чем было нужно, и другие.

В одном воплощении такие родственные примеси элюируются перед белком, представля