Пептиды глюкагонового суперсемейства, обладающие активностью относительно ядерных гормональных рецепторов

Пептиды глюкагонового суперсемейства, обладающие активностью относительно ядерных гормональных рецепторов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ВКЛЮЧЕНИЕ С ПОМОЩЬЮ ССЫЛКИ МАТЕРИАЛОВ, ПРЕДСТАВЛЕННЫХ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

Включенным с помощью ссылки во всей его полноте является машиночитаемый список аминокислотных последовательностей, представленный одновременно с настоящим изобретением и указанный следующим образом: один 889723 байтовый ASCII (Text) файл, названный "44822B_SeqListing", созданный 29 апреля 2011.

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США № 61/334435, поданной 13 мая 2010, и 61/432077, поданной 12 января 2011. Описание каждой из предварительных заявок включено явно в настоящее изобретение во всей своей полноте с помощью ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к пептидам глюкагонового суперсемейства, конъюгированным с лигандами ядерных гормональных рецепторов, которые способны воздействовать на ядерные гормональные рецепторы.

Краткое описание родственного уровня техники

Белки ядерных гормональных рецепторов образуют класс белков, активируемых лигандом, которые, при связывании со специфическими последовательностями ДНК, служат в качестве переключателей транскрипции в клеточном ядре. Данные переключатели контролируют развитие и дифференциацию кожи, костей и центров в мозге, отвечающих за поведение, а также непрерывную регуляцию репродуктивных тканей.

Лиганды ядерных гормональных рецепторов, такие как стероиды, стеролы, ретиноиды, тироидные гормоны и витамин D функционируют, активируя ядерные гормональные рецепторы. Взаимодействие гормона и рецептора инициирует конформационное изменение в рецепторе, которое приводит в результате к регуляции последующих стадий генной экспрессии. Степень клеточной передачи сигнала, активированной взаимодействием лиганда и ядерного гормонального рецептора, определяется числом лигандов и рецепторов, имеющихся в наличии для связывания, и связывающей способностью между лигандом и рецептором. Многие лиганды и соответствующие аналоги, которые связываются с ядерными гормональными рецепторами, применяют в качестве лекарственных средств для лечения, например, болезни Паркинсона (NURR1), расстройств сна (RZRβ), артрита и мозжечковой атаксии (RORα), заболеваний центральной нервной системы (NOR-1, Rev-ErbAβ, T1x, NGFI-Bβ, HZF-2α, COUP-TFα, COUP-TFβ, COUR-TFγ, NUR77), гиперхолестеринемии (LXRα, COR), ожирения (Rev-ErbAα), диабета (HNF4α), заболеваний иммунной системы (TOR), нарушений обмена веществ (MB67α, SHP, FXR, SF-1, LXRβ) и бесплодия, и контрацепции (GCNF, TR2-11α,β, TR4, ERα,β, ERRα,β).

Препроглюкагон представляет собой полипептид-предшественник, состоящий из 158 аминокислот, который подвергается процессингу в различных тканях, образуя ряд различных пептидов, являющихся производными проглюкагона, включая глюкагон, глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1), глюкагоноподобный пептид-2 (GLP-2) и оксинтомодулин (OXM), которые вовлечены в широкий спектр физиологических функций, включая гомеостаз глюкозы, секрецию инсулина, опорожнение желудка и интестинальный рост, а также регуляцию потребления пищи. Глюкагон представляет собой пептид из 29 аминокислот, который соответствует аминокислотам 33-61 препроглюкагона, тогда как GLP-1 получается в виде пептида из 37 аминокислот, которые соответствуют аминокислотам 72-108 препроглюкагона. GLP-1(7-36) амид или GLP-1(7-37) кислота представляют собой биологически активные формы GLP-1, которые показывают по существу эквивалентную активность относительно GLP-1 рецептора.

Глюкагон применяют для неотложного лечения тяжелой гипогликемии. Сообщалось, что оксинтомодулин обладает фармакологической способностью подавлять аппетит и снижать вес тела. GLP-1 и GLP-1 рецепторные агонисты применяют для лечения диабета II типа. Эксендин-4, представляющий собой пептид, присутствующий в слюне ящерицы-ядозуба, который напоминает по структуре GLP-1 и напоминает глюкагон и GLP-1, усиливает высвобождение инсулина.

Желудочный ингибиторный полипептид (GIP) также известен как глюкозозависимый инсулинотропный полипептид и является членом секретинового семейства гормонов. GIP получается из пробелка, состоящего из 153 аминокислот, кодируемого GIP геном, и он циркулирует в виде биологически активного пептида из 42 аминокислот. GIP ген экспрессируется в тонком кишечнике, а также в слюнной железе и является слабым ингибитором секреции желудочного сока. В добавление к его ингибирующему эффекту в желудке, в присутствии глюкозы, GIP усиливает высвобождение инсулина бета-клетками панкреатических островков при введении при физиологических дозах. Считают, что GIP функционирует как кишечный фактор, который стимулирует высвобождение поджелудочного инсулина и который может играть физиологическую роль в поддержании гомеостаза глюкозы.

Остеокальцин представляет собой неколлагеновый белок, обнаруживаемый в костях и зубах. Он секретируется остеобластами и считается, что он играет роль в минерализации и гомеостазе кальциевых ионов. Также сообщалось, что остеокальцин функционирует в качестве гормона в организме, побуждая бета-клетки в поджелудочной железе высвобождать большее количество инсулина и в то же время побуждая жировые клетки высвобождать гормон адипонектин, который увеличивает чувствительность к инсулину.

СУЩНОСТЬ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к пептидам глюкагонового суперсемейства, конъюгированным с лигандами ядерных гормональных рецепторов ("NHR лиганды"). Данные конъюгаты с множественной активностью являются пригодными для лечения ряда заболеваний.

Конъюгаты пептидов глюкагонового суперсемейства настоящего изобретения могут быть представлены следующей формулой:

Q-L-Y

где Q представляет собой пептид глюкагонового суперсемейства, Y представляет собой NHR лиганд, и L представляет собой связывающую группу или связь.

Пептид глюкагонового суперсемейства (Q) в некоторых вариантах осуществления может представлять собой родственный глюкагону пептид, который обладает агонистической активностью относительно глюкагонового рецептора, агонистической активностью относительно GLP-1 рецептора, агонистической активностью относительно GIP рецептора, соагонистической активностью относительно глюкагонового и GLP-1 рецепторов, соагонистической активностью относительно глюкагонового и GIP рецепторов, соагонистической активностью относительно GLP-1 и GIP рецепторов или триагонистической активностью относительно глюкагонового, GIP и GLP-1 рецепторов. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид обладает антагонистической активностью относительно глюкагонового, GLP-1 или GIP рецептора. Активность родственного глюкагону пептида относительно глюкагонового рецептора, относительно GLP-1 рецептора или относительно GIP рецептора может соответствовать любому из значений, приведенных в настоящем изобретении. В некоторых конкретных вариантах осуществления родственный глюкагону пептид обладает по меньшей мере 0,1% активностью нативного глюкагона относительно глюкагонового рецептора, по меньшей мере 0,1% активностью нативного GLP-1 относительно GLP-1 рецептора или по меньшей мере 0,1% активностью нативного GIP относительно GIP рецептора.

NHR лиганд (Y) является полностью или частично непептидным и воздействует на ядерный гормональный рецептор с активностью, соответствующей любому из значений, приведенных в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления NHR лиганд обладает EC₅₀ или IC₅₀ приблизительно 1 мМ или меньше, или 100 мкМ или меньше, или 10 мкМ или меньше, или 1 мкМ или меньше. В некоторых вариантах осуществления NHR лиганд имеет молекулярный вес вплоть до приблизительно 5000 дальтон, или вплоть до приблизительно 2000 дальтон, или вплоть до приблизительно 1000 дальтон или вплоть до приблизительно 500 дальтон. NHR лиганд может воздействовать на любой из ядерных гормональных рецепторов, описанных в настоящем изобретении, или иметь любую из структур, описанных в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид имеет EC₅₀ (или IC₅₀) относительно глюкагонового рецептора в пределах приблизительно 100-кратного, или в пределах приблизительно 75-кратного, или в пределах приблизительно 50-кратного, или в пределах приблизительно 40-, 30-, 25-, 20-, 15-, 10- или 5-кратного EC₅₀ или IC₅₀ NHR лиганда относительно его ядерного гормонального рецептора. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид имеет EC₅₀ (или IC₅₀) относительно GLP-1 рецептора в пределах приблизительно 100-кратного, или в пределах приблизительно 75-кратного, или в пределах приблизительно 50-кратного, или в пределах приблизительно 40-, 30-, 25-, 20-, 15-, 10- или 5-кратного EC₅₀ или IC₅₀ NHR лиганда относительно его ядерного гормонального рецептора. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид имеет EC₅₀ (или IC₅₀) относительно GIP рецептора в пределах приблизительно 100-кратного, или в пределах приблизительно 75-кратного, или в пределах приблизительно 50-кратного, или в пределах приблизительно 40-, 30-, 25-, 20-, 15-, 10- или 5-кратного EC₅₀ или IC₅₀ NHR лиганда относительно его ядерного гормонального рецептора.

В некоторых аспектах настоящего изобретения настоящее изобретение относится к пролекарствам Q-L-Y, где пролекарство содержит дипептидный пролекарственный компонент (A-B), ковалентно связанный с активным участком Q амидной связью. Последующее удаление дипептида в физиологических условиях и в отсутствии ферментативной активности восстанавливает полную активность Q-L-Y конъюгата.

В некоторых аспектах настоящего изобретения настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим Q-L-Y конъюгат и фармацевтически приемлемый носитель.

В других аспектах настоящего изобретения настоящее изобретение относится к способам введения терапевтически эффективного количества Q-L-Y конъюгата, описанного в настоящем изобретении, для лечения заболевания или медицинского состояния у пациента. В некоторых вариантах осуществления заболевание или медицинское состояние выбрано из группы, состоящей из метаболического синдрома, диабета, ожирения, стеатоза печени и нейродегенеративного заболевания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 представляет собой сравнительный анализ аминокислотных последовательностей различных пептидов глюкагонового суперсемейства или их соответствующих фрагментов. Представленной аминокислотной последовательностью являются GHRH (SEQ ID NO: 1619), PHI (SEQ ID NO: 1622), VIP (SEQ ID NO: 1620), PACAP-27 (SEQ ID NO: 1621), эксендин-4 (SEQ ID NO: 1618), GLP-1 (SEQ ID NO: 1603), глюкагон (SEQ ID NO: 1601), оксинтомодулин (SEQ ID NO: 1606), GIP (SEQ ID NO: 1607), GLP-2 (SEQ ID NO: 1608) и секретин (SEQ ID NO: 1624). Сравнительный анализ показывает, как аминокислотные положения глюкагона могут соответствовать аминокислотным положениям в других пептидах глюкагонового суперсемейства.

Фигура 2 иллюстрирует эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на изменение веса тела и концентрации глюкозы в крови у db/db мышей. Фигура 2a показывает, что мыши, которым вводили большую дозу GLP-1(Aib²A²²CexK⁴⁰)/эстроген(17-сложный эфир) конъюгата, претерпевали немного большее снижение веса тела, чем мыши, которым вводили только GLP-1, но аналогичное снижение при введении среды. Фигуры 2b и 2c показывают, что мыши, которым вводили большую дозу GLP-1(Aib²A²²CexK⁴⁰)/эстроген(17-сложный эфир) конъюгат, претерпевали самое большое снижение концентрации глюкозы в крови между днями 0 и 14, показывая, что улучшенная способность снижать концентрацию глюкозы в крови не зависит от изменения веса тела.

Фигура 3 иллюстрирует эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на глюкозу в крови, вес тела, жировую массу и сухую мышечную массу у мышей с алиментарным ожирением. Фигура 3a иллюстрирует результаты ipGTT теста на день 21. Фигуры 3b-d иллюстрируют эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на изменение веса тела (фигура 3b), изменение жировой массы (фигура 3c) и изменение сухой мышечной массы (фигура 3d) у мышей с алиментарным ожирением. Мыши, которым вводили большую дозу GLP-1(Aib²A²²CexK⁴⁰)/эстроген(17-сложный эфир) конъюгата, претерпевали самое большое снижение веса тела и жировой массы и самое небольшое изменение сухой мышечной массы. Фигура 3e иллюстрирует эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на изменения глюкозы в крови у мышей с алиментарным ожирением. Мыши, которым вводили большую дозу GLP-1(Aib²A²²CexK⁴⁰)/эстроген(17-сложный эфир) конъюгата, претерпевали самое большое снижение концентрации глюкозы в крови между днями 0 и 14. Данные результаты показывают дополнительную дозозависимую эффективность добавления эстрогена к слабому GLP-1 агонисту на основе A22.

Фигура 4 иллюстрирует эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на концентрации глюкозы в крови, изменение веса тела, изменение жировой массы и изменение глюкозы в крови. Фигура 4a иллюстрирует эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов в тесте на толерантность к введенной внутрибрюшинно глюкозе на концентрации глюкозы в крови у мышей с алиментарным ожирением после четырнадцати ежедневных доз. Фигуры 4b-c показывают эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на изменение веса тела и изменение жировой массы у мышей с алиментарным ожирением. Мыши, которым вводили большую дозу GLP-1/эстроген конъюгатов, претерпевали самое большое снижение общего веса тела (Фигура 4b). Жировая масса снижалась при высоких дозах эстрогенового эфирного конъюгата по сравнению с животными, обработанными средой (Фигура 4c). Фигура 4d иллюстрирует эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на изменения глюкозы в крови у мышей с алиментарным ожирением. При высокой дозе, мыши, которым вводили любой GLP-1(Aib²E¹⁶CexK⁴⁰)/эстроген конъюгат, претерпевали большее изменение концентрации глюкозы в крови между днями 0 и 21, чем мыши, которым вводили только GLP-1(Aib²E¹⁶CexK⁴⁰).

Фигура 5 иллюстрирует эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на изменение веса тела и изменение глюкозы в крови у мышей с алиментарным ожирением. Мыши, которым вводили большую дозу GLP-1/эстроген конъюгатов, претерпевали самое большое снижение веса тела (Фигура 5a). Мыши, которым вводили или большую или маленькую дозу GLP-1(Aib²E¹⁶K⁴⁰Cex), претерпевали самое большое изменение глюкозы в крови, наряду с самым большим изменением при высокой дозе GLP-1(Aib²E¹⁶K⁴⁰Cex)/эстроген(3-эфир) (Фигура 5b).

Фигура 6 иллюстрирует эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на изменение веса тела, жировой массы и изменение глюкозы в крови у мышей с алиментарным ожирением. Мыши, которым вводили любой эстрогеновый конъюгат, претерпевали самое большое снижение общего веса тела (Фигура 6a). Анализ жировой массы (Фигура 6b) был относительно постоянен с потерей общего веса тела. Мыши, которым вводили GLP-1(Aib²E¹⁶K⁴⁰Cex)/эстроген(3-эфир) или GLP-1(Aib²E¹⁶K⁴⁰Cex)/эстроген(17-сложный эфир) конъюгат, претерпевали самое большое изменение концентрации глюкозы в крови между днями 0 и 7 (Фигура 6c).

Фигура 7 иллюстрирует эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на изменение веса тела и глюкозу в крови у мышей с алиментарным ожирением. Мыши, которым вводили GLP-1(Aib²E¹⁶K⁴⁰Cex)/эстроген конъюгаты, претерпевали самое большое снижение общего веса тела (Фигура 7a) и концентрации глюкозы в крови (Фигура 7b) в течение периода времени 7 дней. Ни A22, ни пептиды, содержащие d-аминокислоты, не показывали большего снижения по сравнению с GLP-1(Aib²E¹⁶CexK⁴⁰)/эстроген конъюгатами. Кроме того, эстрогеновые конъюгаты GLP-1(Aib²E¹⁶CexK⁴⁰) были явно более эффективными, чем неэстрогеновая форма того же пептида.

Фигура 8 иллюстрирует эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на изменение веса тела, глюкозы в крови и жировой массы. Пептиды, содержащие d-аминокислоты, были явно хуже во всех измерениях эффективности, чем пептиды, содержащие l-аминокислоты. Фигура 8a иллюстрирует эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на изменение веса тела у мышей с алиментарным ожирением. Были незначительные явные отличия снижения веса тела при данных дозах для пептидов с или без эстрогена. Тем не менее, на фигуре 8b показан эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на изменение глюкозы в крови у мышей с алиментарным ожирением. Мыши, которым вводили GLP-1(Aib²E¹⁶CexK⁴⁰)/эстроген(3-сложный эфир) конъюгат, претерпевали самое большое изменение концентрации глюкозы в крови между днями 0 и 7 in vivo, гораздо большее, чем животные, обработанные тем же самым пептидом, но без эстрогена. Это демонстрирует прямое улучшение, связанное с глюкозой в крови, независимое от различий в весе тела. Фигура 8c иллюстрирует эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на изменение жировой массы.

Фигура 9 иллюстрирует эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на изменение веса тела, количества жировой массы и изменение глюкозы в крови у мышей с алиментарным ожирением. Мыши, которым вводили содержащий d-аминокислоты GLP-1/эстроген(3-сложный эфир) конъюгат при повышенных дозах по сравнению с контролем, содержащим l-аминокислоты, претерпевали самое большое снижение веса тела (Фигура 9a) и имели наименьшее количество жировой массы (Фигура 9b). Присутствовало явное дозозависимое снижение глюкозы с содержащим d-аминокислоты GLP-1/эстроген(3-сложный эфир) конъюгатом между днями 0 и 7, и оно увеличивалось при самой большой дозе по сравнению с мышами, которым вводили только GLP-1 (Фигура 9c).

Фигура 10 иллюстрирует эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на изменение веса тела и изменение концентрации глюкозы в крови у мышей с алиментарным ожирением. Мышам вводили содержащие d-аминокислоты GLP-1/эстроген конъюгаты, где эстроген был ковалентно присоединен или в виде стабильного амида или в виде эфира, который был нестабилен in vivo. Животные, обработанные нестабильным эфирным конъюгатом, претерпевали самое большое снижение общего веса тела (Фигура 10a). Фигура 10b показывает, что мыши, которым вводили содержащий d-аминокислоты GLP-1/эстроген эфирный конъюгат, претерпевали большее изменение концентрации глюкозы в крови между днями 0 и 7, чем мыши, которым вводили сравнительный пептид, содержащий d-аминокислоты, но в виде стабильного эстрогенового конъюгата.

Фигура 11 иллюстрирует активность указанных конъюгатов относительно GLP-1 рецептора и эстрогенового рецептора. Активные неустойчивые GLP-1/эстроген конъюгаты были одинаково активны относительно GLP-1 рецептора (Фигура 11a) и обладали разной активностью относительно эстрогенового рецептора (Фигура 11b).

Фигура 12 иллюстрирует эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на изменение веса тела, потребление пищи, глюкозы в крови, веса печени и веса матки у мышей с алиментарным ожирением. Мыши, которым вводили неактивный, эстроген-лабильный содержащий d-аминокислоты GLP-1/эстроген(3-сложный эфир) конъюгат, претерпевали самое большое снижение веса тела, причем эффект был более явно выражен при большей дозе (Фигура 12a). Фигура 12b показывает, что мыши, которым вводили неактивный, эстроген-лабильный содержащий d-аминокислоты GLP-1/эстроген(3-сложный эфир) конъюгат, потребляли значительно меньше пищи, чем мыши, которым вводили только неактивный содержащий d-аминокислоты GLP-1 или эстроген-стабильный содержащий d-аминокислоты GLP-1/эстроген(3-эфир) конъюгат, причем эффект был более явно выражен при большой дозе. Фигура 12c показывает, что большая доза эстроген-лабильного неактивного содержащего d-аминокислоты GLP-1/эстроген(3-сложный эфир) конъюгата снижала концентрацию глюкозы в крови по сравнению с животными, обработанными средой. Фигура 12d показывает, что мыши, которым вводили эстроген-лабильный неактивный содержащий d-аминокислоты GLP-1/эстроген(3-эфир) конъюгат, претерпевали едва заметное, но большее снижение веса печени, чем мыши, которым вводили эстроген-стабильный неактивный содержащий d-аминокислоты GLP-1/эстроген(3-эфир) конъюгат. Фигура 12e показывает, что мыши, которым вводили неактивный, эстроген-лабильный содержащий d-аминокислоты GLP-1/эстроген(3-сложный эфир) конъюгат, претерпевали значительно большее увеличение веса матки, чем мыши, которым вводили только неактивный GLP-1 или неактивный, эстроген-стабильный содержащий d-аминокислоты GLP-1/эстроген(3-эфир) конъюгат.

Фигура 13 иллюстрирует эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на изменение веса тела, жировой массы, потребления пищи, концентрации глюкозы в крови и веса матки у мышей после овариэктомии. Фигура 13a показывает, что мыши, которым вводили активный, эстроген-стабильный GLP-1 агонист/эстроген(3-эфир) конъюгат, претерпевали большее снижение веса тела, чем мыши, которым вводили только активный GLP-1 агонист, неактивный, эстроген-лабильный содержащий d-аминокислоты GLP-1/эстроген(3-сложный эфир) конъюгат или неактивный, эстроген-стабильный содержащий d-аминокислоты GLP-1/эстроген(3-эфир) конъюгат. Фигура 13b показывает, что мыши, которым вводили GLP-1 агонист, неактивный, эстроген-лабильный содержащий d-аминокислоты GLP-1/эстроген(3-сложный эфир) конъюгат и активный, эстроген-стабильный GLP-1 агонист/эстроген(3-эфир) конъюгат, показывали снижение жировой массы. Фигура 13c показывает, что мыши, которым вводили активный, эстроген-стабильный GLP-1 агонист/эстроген(3-эфир) конъюгат, потребляли меньше пищи, чем мыши, которым вводили только активный GLP-1 агонист, неактивный, эстроген-лабильный содержащий d-аминокислоты GLP-1/эстроген(3-сложный эфир) конъюгат или неактивный, эстроген-стабильный содержащий d-аминокислоты GLP-1/эстроген(3-эфир) конъюгат. Фигура 13d показывает, что мыши, которым вводили неактивный, эстроген-лабильный содержащий d-аминокислоты GLP-1/эстроген(3-сложный эфир) конъюгат или неактивный, эстроген-стабильный содержащий d-аминокислоты GLP-1/эстроген(3-эфир) конъюгат или активный, эстроген-стабильный GLP-1 агонист/эстроген(3-эфир) конъюгат, претерпевали снижение концентрации глюкозы в крови, большее, чем в случае введения среды, и что мыши, которым вводили неактивный, эстроген-стабильный содержащий d-аминокислоты GLP-1/эстроген(3-эфир) конъюгат, не проявляли снижение концентрации глюкозы в крови. Фигура 13e показывает, что мыши, которым вводили неактивный, эстроген-лабильный содержащий d-аминокислоты GLP-1/эстроген(3-сложный эфир) конъюгат, претерпевали значительно большее увеличение веса матки, чем мыши, которым вводили только GLP-1, неактивный, эстроген-стабильный содержащий d-аминокислоты GLP-1/эстроген (3-эфир) конъюгат или активный, эстроген-стабильный GLP-1/эстроген(3-эфир) конъюгат.

Фигура 14 иллюстрирует эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на изменение веса тела, жировой массы, глюкозы в крови и веса матки у мышей после овариэктомии. Мыши, которым вводили нестабильные GLP-1 агонист/эстроген конъюгаты, претерпевали большее снижение веса тела и жировой массы, чем мыши, которым вводили только активный GLP-1 агонист или активный, эстроген-лабильный GLP-1 агонист/эстроген(3-сложный эфир) конъюгат (Фигуры 14a и 14b). Мыши, которым вводили нестабильные фермент- и кислотолабильные конъюгаты, GLP-1 агонист/эстроген(17-катепсин) и GLP-1 агонист/эстроген(17-гидразон), соответственно, первоначально имели самое большое снижение веса тела, тогда как нестабильный чувствительный к восстановлению тиолом конъюгат, GLP-1 агонист/эстроген(17-карбаматдисульфид), проявлял суммарное самое большое снижение веса тела. Фигура 14c показывает, что мыши, которым вводили нестабильные чувствительные к восстановлению тиолом и кислотолабильные конъюгаты, GLP-1 агонист/эстроген(17-карбаматдисульфид) и GLP-1 агонист/эстроген(17-гидразон), соответственно, претерпевали большее снижение концентрации глюкозы в крови, чем эстроген-лабильный GLP-1 агонист/эстроген(3-сложный эфир) конъюгат. Фигура 14d показывает, что мыши, которым вводили эстроген-лабильный GLP-1/эстроген(3-сложный эфир) конъюгат, претерпевали значительно большее увеличение веса матки, чем мыши, которым вводили любой из трех нестабильных GLP-1/эстроген конъюгатов.

Фигура 15 иллюстрирует эффект введения указанных GLP-1 конъюгатов на изменение веса тела и общее потребление пищи. Мыши, которым вводили активный, эстроген-стабильный GLP-1 агонист/эстроген(3-эфир) конъюгат, претерпевали значительно большее снижение веса тела, чем мыши, которым вводили только активный GLP-1 агонист или активный, эстроген-лабильный GLP-1 агонист/эстроген(3-сложный эфир) конъюгат (Фигура 15a). Фигура 15b показывает, что мыши, которым вводили активный, эстроген-стабильный GLP-1 агонист/эстроген(3-эфир) конъюгат, потребляли значительно меньше пищи, чем мыши, которым вводили только активный GLP-1 агонист или активный, эстроген-лабильный GLP-1 агонист/эстроген(3-сложный эфир) конъюгат.

На фигурах 16a-e изображены ВЭЖХ кривые, которые показывают стабильность указанных GLP-1/эстроген конъюгатов в плазме крови при 37°C. Эстроген-стабильные GLP-1/эстроген(3-эфир) конъюгаты не проявляли высвобождение эстрогена в течение 72 часов, тогда как эстроген-лабильные GLP-1/эстроген(3-сложный эфир) конъюгаты показывали значительное высвобождение эстрогена через 3 часа и полное высвобождение эстрогена в пределах 6 часов.

Фигуры 17a-c показывают эффект введения указанных конъюгатов на изменение веса тела в процентах, суммарное потребление пищи и концентрацию глюкозы в крови у мышей с алиментарным ожирением.

Фигуры 18a-c показывают эффект введения указанных конъюгатов на изменение веса тела в процентах, суммарное потребление пищи и концентрацию глюкозы в крови у мышей дикого типа с алиментарным ожирением, у мышей с «нокаутом» эстрогенового рецептора бета (ERβ KO) и у мышей с «нокаутом» эстрогенового рецептора альфа (ERα KO).

Фигура 19 иллюстрирует эффект указанных GLP-1 конъюгатов на концентрации глюкозы в крови с течением времени. Мыши, которым вводили GLP-1 агонист, показали самое неэффективное снижение глюкозы в крови в течение 48 часов (за исключением среды), тогда как мыши, которым вводили эстроген-стабильный GLP-1 агонист/эстроген (3-эфир) конъюгат, показали самое эффективное снижение глюкозы в крови в течение 48 часов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В описании и формуле изобретения настоящего изобретения, будут применять следующую терминологию в соответствии с определениями, изложенными ниже.

Термин "приблизительно", как применяют в настоящем изобретении, обозначает больше или меньше в районе 10 процентов, чем величина или диапазон величин, но не предполагается, что он обозначает любую величину или диапазон величин, только для этого широкого определения. Также предполагается, что каждая величина или диапазон величин, которым предшествует термин "приблизительно" включает вариант осуществления заданной абсолютной величины или диапазона величин.

Как применяют в настоящем изобретении, термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает любой из стандартных фармацевтических носителей, такой как физиологический раствор с фосфатным буфером, вода, эмульсии, такие как эмульсия масло/вода или эмульсия вода/масло, и различные типы смачивающих агентов. Термин также включает любые агенты, одобренные регуляторным органом правительства США или перечисленные в фармакопеи США для применения на животных, включая человека.

Как применяют в настоящем изобретении, термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к солям соединений, которые сохраняют биологическую активность исходного соединения, и которые не является биологически или иначе нежелательными. Многие из соединений, описанных в настоящем изобретении, способны образовывать кислые и/или основные соли за счет наличия амино и/или карбоксильной группы или аналогичных им групп.

Фармацевтически приемлемые соли присоединения основания можно получить из неорганических и органических оснований. Соли, полученные из неорганических оснований, включают, только в качестве примера, натриевые, калиевые, литиевые, аммониевые, кальциевые и магниевые соли. Соли, полученные из органических оснований, включают, но не ограничиваясь этим, соли первичных, вторичных и третичных аминов. Фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот можно получить из неорганических и органических кислот. Соли, полученные из неорганических кислот, включают хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и подобные. Соли, полученные из органических кислот, представляют собой уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, пировиноградную кислоту, щавелевую кислоту, яблочную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, малеиновую кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, коричную кислоту, миндальную кислоту, метансульфокислоту, этансульфокислоту, п-толуолсульфокислоты, салициловую кислоту и т.д.

Как применяют в настоящем изобретении, термин "лечение" включает профилактику конкретного заболевания или состояния, или облегчение симптомов, связанных с конкретным заболеванием или состоянием, и/или предотвращение или устранение указанных симптомов. Например, как применяют в настоящем изобретении, термин "лечение диабета" будет относиться в общем к изменению концентрации глюкозы в крови в сторону нормальной концентрации и может включать увеличение или снижение концентрации глюкозы в крови в зависимости от указанной ситуации.

Как применяют в настоящем изобретении, "эффективное" количество или "терапевтически эффективное количество" глюкагонового пептида относится к нетоксичному, но достаточному количеству пептида, обеспечивающему требуемый эффект. Например, одним желательным эффектом будет предотвращение или лечение гипогликемии, как измерено, например, увеличением концентрации глюкозы в крови. Альтернативный желательный эффект для глюкагоновых пептидов настоящего описания будет включать лечение гипергликемии, например, как измерено изменением концентрации глюкозы в крови в сторону нормальной концентрации, или будет вызывать потерю веса/предотвращение набора веса, например, как измерено снижением веса тела, или предотвращать или замедлять увеличение веса тела, или нормализовывать распределение жира в теле. Количество, которое является "эффективным", будет изменяться от субъекта к субъекту, в зависимости от возраста и общего состояния индивида, пути введения и подобных. Таким образом, не всегда возможно указать точное "эффективное количество". Однако подходящее "эффективное" количество в случае любого индивида может быть определено специалистом в данной области техники, применяя стандартный эксперимент.

Термин "парентеральный" обозначает не через пищеварительный тракт, но некоторым другим путем, например, подкожно, внутримышечно, интраспинально или внутривенно.

Как применяют в настоящем изобретении, предполагается, что термин "пациент", без дополнительного обозначения, включает любое теплокровное позвоночное животное (включая, например, но не ограничиваясь этим, сельскохозяйственных животных, лошадей, кошек, собак и других домашних животных), млекопитающее и людей.

Термин "выделенный", как применяют в настоящем изобретении, обозначает удаленный из окружающей его среды. В некоторых вариантах осуществления аналог получают с помощью рекомбинантных способов, и аналог выделяют из клеток-хозяев.

Термин "очищенный", как применяют в настоящем изобретении, относится к выделению молекулы или соединения в форме, которая практически не содержит примесей, обычно связанных с молекулой или соединением в природной или естественной среде и обозначает повышенный по чистоте как результат отделения от других компонентов первоначального состава. Термин "очищенный полипептид" применяют в настоящем изобретении для обозначения полипептида, который был отделен от других соединений, включая, но не ограничиваясь этим, молекулы нуклеиновых кислот, липиды и сахара.

Как применяют в настоящем изобретении, термин "пептид" включает последовательность 2 или более аминокислот и обычно меньше, чем 50 аминокислот, где аминокислоты являются встречающимися в природе или кодируемыми или не встречающимися в природе или некодируемыми аминокислотами. Не встречающиеся в природе аминокислоты относятся к аминокислотам, которые не встречаются в природе in vivo, но которые, тем не менее, можно ввести в пептидные структуры, описанные в настоящем изобретении. "Некодируемая", как применяют в настоящем изобретении, относится к аминокислоте, которая не является L-изомером любой из следующих 20 аминокислот: Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr.

Как применяют в настоящем изобретении, "частично непептидный" относится к молекуле, где часть молекулы представляет собой химическое соединение или заместитель, который обладает биологической активностью и не содержит последовательности аминокислот.

Как применяют в настоящем изобретении, "непептидный" относится к молекуле, обладающей биологической активностью и не содержащей последовательность аминокислот.

Как применяют в настоящем изобретении, термины "полипептид" и "белок" представляют собой термины, который применяют для обозначения полимера аминокислот, независимо от длины полимера. Обычно, полипептиды и белки имеют полимерную длину, которая является большей, чем длина "пептидов". В ряде случаев, белок содержит более одной полипептидной цепи, ковалентно или нековалентно связанные друг с другом.

Во всей настоящей заявке, все ссылки на конкретное положение аминокислоты номером (например, положение 28) относятся к аминокислоте в положении в нативном глюкагоне (SEQ ID NO: 1601) или соответствующему положению аминокислоты в любом его аналоге. Например, ссылка в настоящем изобретении на "положение 28" будет обозначать соответствующее положение 27 для аналога глюкагона, в котором первая аминокислота SEQ ID NO: 1601 удалена. Аналогично, ссылка в настоящем изобретении на "положение 28" будет обозначать соответствующее положение 29 для аналога глюкагона, в котором одна аминокислота присоединена к N-концу SEQ ID NO: 1601.

Как применяют в настоящем изобретении, "аминокислотная модификация" относится к (i) замещению или замене аминокислоты исходного пептида (например, SEQ ID NO: 1601, 1603, 1607) отличной аминокислотой (встречающейся в природе или кодируемой или некодируемой или не встречающейся в природе аминокислотой), (ii) присоединению аминокислоты (встречающейся в природе или кодируемой или некодируемой или не встречающейся в природе аминокислоты) к исходному пептиду (например, SEQ ID NO: 1601, 1603, 1607) или (iii) удалению одной или более аминокислот из исходного пептида (например, SEQ ID NO: 1601, 1603, 1607).

В некоторых вариантах осуществления аминокислотное замещение или замена представляет собой консервативную аминокислотную замену, например, консервативную замену аминокислоты в одном или более из положений 1, 2, 5, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29. Как применяют в настоящем изобретении, термин "консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей аналогичные свойства, например, размер, заряд, гидрофобность, гидрофильность и/или ароматичность, и включает замены в пределах одной из следующих пяти групп:

I. небольшие алифатические, неполярные или по существу неполярные остатки: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;

II. Полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды и эфиры: Asp, Asn, Glu, Gln, цистеиновая кислота и гомоцистеиновая кислота;

III. Полярные, положительно заряженные остатки: His, Arg, Lys; орнитин (Orn)

IV. Большие алифатические неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val, Cys, норлейцин (Nle), гомоцистеин

V. Большие ароматические остатки:

Phe, Tyr, Trp, ацетилфенилаланин

В некоторых вариантах осуществления аминокислотная замена является неконсервативной аминокислотной заменой, например, представляет собой неконсервативную аминокислотную замену.

Как применяют в настоящем изобретении, термин "аминокислота" включает любую молекулу, содержащую и амино, и карбоксильную функциональную группу, где амино и карбоксильные группы соединены с одним атомом углерода (альфа-атом углерода). Альфа атом углерода необязательно может содержать один или два дополнительных органических заместителя. Для целей настоящего изобретения предполагается, что обозначение аминокислоты без указания ее стереохимии включает или L, или D форму аминокислоты, или ра