Растение, обладающее повышенной устойчивостью или чувствительностью к ингибитору 4-hppd

Растение, обладающее повышенной устойчивостью или чувствительностью к ингибитору 4-hppd

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к агенту для придания растению устойчивости или чувствительности к ингибитору 4-HPPD, трансгенной клетке растения, способной к регенерации растения, обладающего повышенной устойчивостью или чувствительностью к ингибитору 4-HPPD, растению, регенерированному из этой клетки, и способам их создания. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу определения того, обладает ли растение устойчивостью или чувствительностью к ингибитору 4-HPPD, и способу селекции растения, обладающего повышенной устойчивостью или чувствительностью к ингибитору 4-HPPD, используя это определение.

Предпосылки создания изобретения

Вместе с увеличением спроса на топливный биоэтанол чрезмерно возросла импортная цена фуражного зерна из-за границы, что наложило тяжелое бремя на животноводческие хозяйства в Японии. В этой ситуации для увеличения внутреннего производства и уровня самообеспеченности фуражом выращивают не рис-падди, а чередующиеся культуры, используя земли под паром и т.д. Однако использование рисовых полей, подходящих для выращивания этих чередующихся культур, ограничено из-за таких проблем, как плохой дренаж. По этой причине были стимулированы использование риса в качестве фуража и разработки особенных культиваров фуражного риса с высокой продуктивностью (культиваров с высокой урожайностью). Для проявления такими культиварами с высокой урожайностью своих характерных свойств, относящихся к высокой урожайности, и демонстрации ими способности к стабильному росту, а также для увеличения вкусовой привлекательности и пищевой ценности скота борьба с сорняками на посевных рисовых полях является важным методом борьбы при выращивании (непатентная литература 1). Кроме того, для стабильных и экономичных производств не только культиваров с высокой урожайностью и риса, но также культур необходима недорогая, энергосберегающая и легкая борьба с сорняками. Разработка и использование гербицида с высокой избирательностью являются эффективными в такой борьбе (непатентная литература 2). Поэтому необходимы разработка и выращивание культур, устойчивых к используемому гербициду.

Между тем, в борьбе с сорняками на посевных рисовых полях широко используются гербициды на основе сульфонилмочевин (SU), поскольку эти гербициды являются эффективными против широкого ряда сорняков в низкой дозе и оказывают незначительное влияние на человека, а также на окружающую среду. Тем не менее, было обнаружено появление таких сорняков, как Scirpus juncoides Roxb., обладающих устойчивостью к гербицидам на основе SU. Это приводит к проблеме в борьбе при выращивании риса и т.д.

Недавно, в качестве средства против такой проблемы компоненты гербицидов, такие как бензобициклон (BBC), мезотрион и тефурилтрион, которые являются также эффективными против растений, устойчивых к гербицидам на основе SU, были разработаны и введены в практическое применение. Все из BBC, мезотриона и тефурилтриона являются агентами для ингибирования функционирования 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназы (4-HPPD) (ингибиторами 4-HPPD). Ингибирование функционирования этого фермента опосредованно ингибирует систему синтеза каротиноидов и является причиной разрушения хлорофилла с осветлением и увяданием тем самым растения насмерть (см. фиг. 1). Безопасность этих ингибиторов против культиваров пищевого риса была в достаточной мере подтверждена, так что эти ингибиторы быстро широко распространились при выращивании риса.

Однако чувствительность культиваров с высокой урожайностью к ингибиторам 4-HPPD не была проверена в достаточной степени на стадии разработки или других стадиях. На настоящий момент сообщено, что семь культиваров фуражного риса с высокой урожайностью чувствительны к ингибиторам 4-HPPD и могут засохнуть насмерть в некоторых случаях (непатентная литература 1 и 3).

Разработки способа, с помощью которого можно надежно определить устойчивость или чувствительность к ингибитору 4-HPPD, и способа, с помощью которого можно увеличить устойчивость или чувствительность к ингибитору 4-HPPD, сделали бы возможным использование ингибитора 4-HPPD для борьбы с угрозой прорастания (проблемой из-за упавших семян и проростков) «самосевных семян» предшествующего года в циклах чередования культур - культиваров пищевого и фуражного риса, как представлено на фиг. 2, например; в результате можно было ожидать увеличение производства культивара фуражного риса и т.д. Вдобавок, используя эти способы, ингибитор 4-HPPD можно также использовать в способе борьбы на полях в случае выращивания таких культур, как рис, при необходимости. Кроме того, в случае обнаружения гена, служащего в качестве маркера для определения устойчивости или чувствительности к ингибитору 4-HPPD, можно эффективно осуществлять селекцию культур, включая рис.

Соответственно, была сильно желательной разработка способа для придания растению устойчивости или чувствительности к ингибитору 4-HPPD и способа определения того, обладает ли растение устойчивостью или чувствительностью к ингибитору 4-HPPD. Однако способы, с помощью которых эффективно достигаются эти цели, до сих пор не разработаны.

Список ссылочной литературы

Непатентная литература

Непатентная литература 1: Keisuke Sekino et al., "Sensitivity of Nineteen Varieties and Line of Forage Rice to Paddy Herbicide, benzobicyclon," Japanese Journal of Crop Science, March 25, 2009, vol. 227, extra issue, pp. 120 to 121

Непатентная литература 2: Terry R. Wright et al., Proc Natl Acad Sci USA., November 23, 2010, vol. 107, no. 47, pp. 20240 to 20245

Непатентная литература 3: Kiyoaki Maruyama et al., "Forage rice and so forth are revealed to be susceptible to some herbicide", [опубликованная в сети], March 26, 2010, National Agriculture and Food Research Organization Agricultural Research Center, Press Release, [исправленная 29 сентября 2010], the Internet URL:http://narc.naro.affrc.go.jp/press/h22/0326/index.htm

Краткое изложение сущности изобретения

Техническая проблема

Настоящее изобретение было сделано в связи с проблемами описанных выше традиционных способов. Целью настоящего изобретения является обеспечение совокупности способов, с помощью которых можно эффективно придать растению устойчивость или чувствительность к ингибитору 4-HPPD, и обеспечение совокупности способов, с помощью которых можно эффективно определить, обладает ли растение устойчивостью или чувствительностью к ингибитору 4-HPPD.

Решение проблемы

Для достижения вышеуказанной цели авторы настоящего изобретения сначала попытались идентифицировать гены, связанные с устойчивостью к ингибитору 4-HPPD, в растении. А именно, авторы настоящего изобретения сначала выполнили анализ локуса количественных признаков (QTL), используя чувствительный к ингибитору 4-HPPD рис и устойчивый к ингибитору 4-HPPD рис. Его результат показал, что генный локус для определения устойчивости к ингибитору 4-HPPD расположен на коротком плече хромосомы 2 риса. Затем авторы настоящего изобретения проверили фенотип (чувствительность к ингибитору 4-HPPD), используя линию Nipponbare, имеющую ретротранспозон Tos17, вставленный в гипотетический ген железо/аскорбат-зависимой оксидоредуктазы, расположенный в генном локусе, определенном с помощью анализа QTL. Было установлено, что гомозиготные по вставке Tos17 отдельные представители проявляют чувствительность к ингибитору 4-HPPD. Когда обнаруженный таким образом ген железо/аскорбат-зависимой оксидоредуктазы был введен в Arabidopsis thaliana (A. thaliana) и рис, эти трансгенные растения проявили устойчивость к ингибитору 4-HPPD. Это подтверждало, что этот ген является геном, ответственным за придание растению устойчивости к ингибитору 4-HPPD (ниже также называемым реагирующим на ингибитор 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназы геном № 1 (HIS1)). Кроме того, гены с высокой степенью гомологии с геном HIS1 риса также существуют в ячмене, сорго, кукурузе и т.п.

Далее авторы настоящего изобретения сравнили структуру гена HIS1 между чувствительным к ингибитору 4-HPPD рисом и устойчивым к ингибитору 4-HPPD рисом с помощью анализа с использованием ПЦР. В результате, культивары риса, проявляющие чувствительность к ингибитору 4-HPPD, имели вставку в районе с четвертого экзона по пятый экзон гена HIS1 или делецию из него. Это может означать, что подавление функционирования гена HIS1 придает растению чувствительность к ингибитору 4-HPPD.

Сверх того, было обнаружено, что ген риса (ген HSL1), обладающий наибольшей степью гомологии с геном HIS1, расположен на хромосоме 6 риса. Кроме того, было также обнаружено, что после введения гена HSL1 в рис трансгенный рис также проявлял устойчивость к ингибитору 4-HPPD.

На основе этих обнаружений авторы настоящего изобретения установили, что использование гена HIS1 или гомологичного ему гена делает возможным создание растения, обладающего повышенной устойчивостью или чувствительностью к ингибитору 4-HPPD, и что использование этих генов в качестве мишеней делает возможным определение того, обладает ли растение устойчивостью или чувствительностью к ингибитору 4-HPPD. Эти обнаружения привели к завершению настоящего изобретения.

Конкретнее, настоящее изобретение заключается в следующем.

(1) Агент для придания растению устойчивости к ингибитору HPPD, включающий по крайней мере одну ДНК или вектор, содержащий встроенную в него ДНК, кодирующую белок, обладающий силой придать растению устойчивость к ингибитору 4-HPPD, при этом ДНК выбирают из группы, состоящей из следующих ДНК (a)-(d):

(a) ДНК, кодирующей белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 2 и 17;

(b) ДНК, кодирующей белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 2 и 17, в (из) которой одна или более аминокислот замещены, делетированы, добавлены и/или вставлены;

(c) ДНК, гибридизующейся в жестких условиях с ДНК, имеющей последовательность оснований, представленную в любой из SEQ ID NO: 1 и 16; и

(d) ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность, гомологичную на 60% или более аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 2 и 17.

(2) Трансгенная клетка растения, способная к регенерации растения, обладающего повышенной устойчивостью к ингибитору 4-HPPD, включающая по крайней мере одну ДНК или вектор, содержащий встроенную в него ДНК, кодирующую белок, обладающий силой придать растению устойчивость к ингибитору 4-HPPD, при этом ДНК выбирают из группы, состоящей из следующих ДНК (a)-(d):

(a) ДНК, кодирующей белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 2 и 17;

(b) ДНК, кодирующей белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 2 и 17, в (из) которой одна или более аминокислот замещены, делетированы, добавлены и/или вставлены;

(c) ДНК, гибридизующейся в жестких условиях с ДНК, имеющей последовательность оснований, представленную в любой из SEQ ID NO: 1 и 16; и

(d) ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность, гомологичную на 60% или более аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 2 и 17.

(3) Растение, обладающее повышенной устойчивостью к ингибитору 4-HPPD, которое регенерировано из трансгенной клетки растения в соответствии с (2).

(4) Растение, обладающее повышенной устойчивостью к ингибитору 4-HPPD, которое представляет собой любой из потомка и клона растения в соответствии с (3).

(5) Материал для размножения растения, обладающего повышенной устойчивостью к ингибитору 4-HPPD, в соответствии с любым из (3) и (4).

(6) Способ создания растения, обладающего повышенной устойчивостью к ингибитору 4-HPPD, включающий:

(I) стадию введения в клетку растения по крайней мере одной ДНК или вектора, содержащего встроенную в него ДНК, кодирующую белок, обладающий силой придать растению устойчивость к ингибитору 4-HPPD, при этом ДНК выбирают из группы, состоящей из следующих ДНК (a)-(d):

(a) ДНК, кодирующей белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 2 и 17;

(b) ДНК, кодирующей белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 2 и 17, в (из) которой одна или более аминокислот замещены, делетированы, добавлены и/или вставлены;

(c) ДНК, гибридизующейся в жестких условиях с ДНК, имеющей последовательность оснований, представленную в любой из SEQ ID NO: 1 и 16; и

(d) ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность, гомологичную на 60% или более аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 2 и 17; и

(II) стадию регенерации растения из трансгенной клетки растения, в которую введена ДНК или вектор, содержащий встроенную в него ДНК, на стадии (I).

(7) Агент для придания растению чувствительности к ингибитору HPPD, включающий по крайней мере одну ДНК или вектор, содержащий встроенную в него ДНК, кодирующую РНК, обладающую силой придать растению чувствительность к ингибитору 4-HPPD, при этом ДНК выбирают из группы, состоящей из следующих ДНК (a)-(с):

(a) ДНК, кодирующей двухцепочечную РНК, комплементарную транскрипту с ДНК в соответствии с (1);

(b) ДНК, кодирующей антисмысловую РНК, комплементарную транскрипту с ДНК в соответствии с (1); и

(c) ДНК, кодирующей РНК, обладающую рибозимной активностью специфического расщепления транскрипта с ДНК в соответствии с (1).

(8) Трансгенная клетка растения, способная к регенерации растения, обладающего повышенной чувствительностью к ингибитору 4-HPPD, включающая по крайней мере одну ДНК или вектор, содержащий встроенную в него ДНК, кодирующую РНК, обладающую силой придать растению чувствительность к ингибитору 4-HPPD, при этом ДНК выбирают из группы, состоящей из следующих ДНК (a)-(с):

(a) ДНК, кодирующей двухцепочечную РНК, комплементарную транскрипту с ДНК в соответствии с (1);

(b) ДНК, кодирующей антисмысловую РНК, комплементарную транскрипту с ДНК в соответствии с (1); и

(c) ДНК, кодирующей РНК, обладающую рибозимной активностью специфического расщепления транскрипта с ДНК в соответствии с (1).

(9) Растение, обладающее повышенной чувствительностью к ингибитору 4-HPPD, которое регенерировано из трансгенной клетки растения в соответствии с (8).

(10) Растение, обладающее повышенной чувствительностью к ингибитору 4-HPPD, которое представляет собой любой из потомка и клона растения в соответствии с (9).

(11) Материал для размножения растения, обладающего повышенной чувствительностью к ингибитору 4-HPPD, в соответствии с любым из (9) и (10).

(12) Способ создания растения, обладающего повышенной чувствительностью к ингибитору 4-HPPD, включающий:

(I) стадию введения в клетку растения по крайней мере одной ДНК или вектора, содержащего встроенную в него ДНК, кодирующую РНК, обладающую силой придать растению чувствительность к ингибитору 4-HPPD, при этом ДНК выбирают из группы, состоящей из следующих ДНК (a)-(с):

(a) ДНК, кодирующей двухцепочечную РНК, комплементарную транскрипту с ДНК в соответствии с (1);

(b) ДНК, кодирующей антисмысловую РНК, комплементарную транскрипту с ДНК в соответствии с (1); и

(c) ДНК, кодирующей РНК, обладающую рибозимной активностью специфического расщепления транскрипта с ДНК в соответствии с (1), и

(II) стадию регенерации растения из трансгенной клетки растения, в которую введена ДНК или вектор, содержащий встроенную в него ДНК, на стадии (I).

(13) Способ определения того, обладает ли растение устойчивостью или чувствительностью к ингибитору 4-HPPD, который включает анализ последовательности оснований по крайней мере одной ДНК, в исследуемом растении, выбираемой из группы, состоящей из следующих ДНК (a)-(d), или последовательности оснований контролирующей экспрессию области ДНК:

(a) ДНК, кодирующей белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 2 и 17;

(b) ДНК, кодирующей белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 2 и 17, в (из) которой одна или более аминокислот замещены, делетированы, добавлены и/или вставлены;

(c) ДНК, гибридизующейся в жестких условиях с ДНК, имеющей последовательность оснований, представленную в любой из SEQ ID NO: 1 и 16; и

(d) ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность, гомологичную на 60% или более аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 2 и 17.

(14) Способ определения того, обладает ли растение устойчивостью или чувствительностью к ингибитору 4-HPPD, который включает определение экспрессии по крайней мере одной ДНК, в исследуемом растении, выбираемой из группы, состоящей из следующих ДНК (a)-(d), или молекулярной массы любого из продукта амплификации ДНК и продукта экспрессии (с) ДНК:

(a) ДНК, кодирующей белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 2 и 17;

(b) ДНК, кодирующей белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 2 и 17, в (из) которой одна или более аминокислот замещены, делетированы, добавлены и/или вставлены;

(c) ДНК, гибридизующейся в жестких условиях с ДНК, имеющей последовательность оснований, представленную в любой из SEQ ID NO: 1 и 16; и

(d) ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность, гомологичную на 60% или более аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 2 и 17.

(15) Способ селекции растения, обладающего повышенной устойчивостью к ингибитору 4-HPPD, включающий:

(a) стадию скрещивания культивара растения, устойчивого к ингибитору 4-HPPD, с каким-либо культиваром;

(b) стадию определения того, обладают ли отдельные представители, полученные в результате скрещивания на стадии (a), устойчивостью или чувствительностью к ингибитору 4-HPPD, с помощью способа в соответствии с любым из (13) и (14); и

(c) стадию отбора отдельного представителя, который в соответствии с определением обладает устойчивостью к ингибитору 4-HPPD.

(16) Способ селекции растения, обладающего повышенной чувствительностью к ингибитору 4-HPPD, включающий:

(a) стадию скрещивания культивара растения, чувствительного к ингибитору 4-HPPD, с каким-либо культиваром;

(b) стадию определения того, обладают ли отдельные представители, полученные в результате скрещивания на стадии (a), устойчивостью или чувствительностью к ингибитору 4-HPPD, с помощью способа в соответствии с любым из (13) и (14); и

(c) стадию отбора отдельного представителя, который в соответствии с определением обладает чувствительностью к ингибитору 4-HPPD.

Полезные эффекты настоящего изобретения

Использование генов, идентифицированных в настоящем изобретении, делает возможным эффективное создание растения, обладающего повышенной устойчивостью или чувствительностью к ингибитору 4-HPPD. Кроме того, использование генов, идентифицированных в настоящем изобретении, в качестве мишеней делает возможным эффективное определение того, обладает ли растение устойчивостью или чувствительностью к ингибитору 4-HPPD.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой диаграмму для иллюстрации схемы пути метаболизма тирозина и пути биосинтеза каротиноидов и их связи с ингибитором 4-HPPD.

Фиг. 2 представляет собой диаграмму для иллюстрации схемы борьбы с угрозой прорастания «самосевных семян» предшествующих лет в циклах чередования культур - культиваров пищевого и фуражного риса.

Фиг. 3 является представлением для иллюстрации схемы бинарного вектора (pIG121-Hm/HIS1), используемого для трансформации Arabidopsis thaliana методом с использованием Agrobacterium, который был получен посредством соединения краевых последовательностей (RB: правой краевой последовательности, LB: левой краевой последовательности) с кассетами для экспрессии гена устойчивости к канамицину (NPTII), управляемой промотором nos (nos-P), экспрессии гена устойчивости к гигромицину (hygR), управляемой промотором CaMV35S (CaMV35S-P), и экспрессии AK065581 (HIS1), управляемой промотором CaMV35S.

Фиг. 4 является представлением для иллюстрации схемы бинарного вектора (35sHIS1 pZH2B), используемого для трансформации Arabidopsis thaliana и риса методом с использованием Agrobacterium, который был получен посредством соединения краевых последовательностей (RB: правой краевой последовательности, LB: левой краевой последовательности) с кассетами для экспрессии гена устойчивости к гигромицину (mHPT), управляемой промотором CaMV35S (35S Pro), и экспрессии AK065581 (HIS1), управляемой промотором CaMV35S (35S Pro).

Фиг. 5 является представлением для иллюстрации схемы бинарного вектора (35sHIS1 pZK3), используемого для трансформации помидоров методом с использованием Agrobacterium, который был получен посредством соединения краевых последовательностей (RB: правой краевой последовательности, LB: левой краевой последовательности) с кассетами для экспрессии гена устойчивости к канамицину (NPT2), управляемой промотором nos (NOSpro), и экспрессии AK065581 (HIS1), управляемой промотором CaMV35S (35S Pro).

Фиг. 6 является представлением для иллюстрации схемы бинарного вектора (35sHSL1 pZH2B), используемого для трансформации Arabidopsis thaliana и риса методом с использованием Agrobacterium, который был получен посредством соединения краевых последовательностей (RB: правой краевой последовательности, LB: левой краевой последовательности) с кассетами для экспрессии гена устойчивости к гигромицину (mHPT), управляемой промотором CaMV35S (35S Pro), и экспрессии AK241948 (HSL1), управляемой промотором CaMV35S (35S Pro).

Фиг. 7 является представлением для иллюстрации схемы бинарного вектора (35sHSL1 pZK3), используемого для трансформации помидоров методом с использованием Agrobacterium, который был получен посредством соединения краевых последовательностей (RB: правой краевой последовательности, LB: левой краевой последовательности) с кассетами для экспрессии гена устойчивости к канамицину (NPT2), управляемой промотором nos (NOSpro), и экспрессии AK241948 (HSL1), управляемой промотором CaMV35S (35S Pro).

Фиг. 8 является представлением для демонстрации гена устойчивости к ингибитору 4-HPPD (AK065581), определенного с помощью анализа QTL, и гомологичных ему генов, которые находятся на хромосомах риса.

На фиг. 9 представлена фотография для иллюстрации устойчивости к ингибитору 4-HPPD (бензобициклону (ВВС)) рекомбинантного A. thaliana (экотипа Columbia), содержащего введенный в него ген-мишень (AK065581). Примите к сведению, что на фигуре «Col» указывает на результат для A. thaliana дикого типа (экотипа Columbia), «#1» и «#3» указывают на результаты для рекомбинантного A. thaliana (экотипа Columbia), содержащего введенный в него ген-мишень (AK065581).

На фиг. 10 представлены фотографии для иллюстрации устойчивости к ингибитору 4-HPPD (бензобициклону) рекомбинантного риса (чувствительного к ингибитору 4-HPPD культивара: Kanto 239), содержащего введенный в него ген-мишень (AK065581). Примите к сведению, что на фигуре «Kanto 239» указывает на результат для Kanto 239 (дикого типа), а «BBC21-23B» и «BBC21-23C» указывают на результаты для Kanto 239 (рекомбинантного риса), содержащего введенный в него ген-мишень (AK065581).

На фиг. 11 представлена фотография для иллюстрации устойчивости к ингибитору 4-HPPD (бензобициклону) рекомбинантного риса (Kanto 239), содержащего введенный в него ген-мишень (AK065581). Примите к сведению, что на фигуре «Nipponbare» и «Kanto 239», соответственно, указывают на результаты для Nipponbare (дикого типа) (устойчивого к ингибитору 4-HPPD культивара) и Kanto 239 (дикого типа), а «BBC21-1A, 2, 3, 3D, 3F, 3-3, 9, 15» указывают на результаты для Kanto 239 (рекомбинантного риса), содержащего введенный в него ген-мишень (AK065581) (это же распространяется на фиг. 12-15). Кроме того, «Дата применения» и «Дата оценки» означают, соответственно, «дату, когда семена засевали в твердую (агаровую) среду, дополненную ингибитором 4-HPPD», и «дату, когда проверяли состояние роста растений, выращиваемых из семян» (это же распространяется на фиг. 12-15 и 22).

На фиг. 12 представлена фотография для иллюстрации устойчивости к ингибитору 4-HPPD (мезотриону) рекомбинантного риса (Kanto 239), содержащего введенный в него ген-мишень (AK065581).

На фиг. 13 представлены фотографии для иллюстрации устойчивости к ингибитору 4-HPPD (тефурилтриону) рекомбинантного риса (Kanto 239), содержащего введенный в него ген-мишень (AK065581).

На фиг. 14 представлена фотография для иллюстрации устойчивости к ингибитору 4-HPPD (темботриону) рекомбинантного риса (Kanto 239), содержащего введенный в него ген-мишень (AK065581).

На фиг. 15 представлена фотография для иллюстрации устойчивости к ингибитору 4-HPPD (NTBC) рекомбинантного риса (Kanto 239), содержащего введенный в него ген-мишень (AK065581).

На фиг. 16 представлены изображения после электрофореза для иллюстрации полученных в результате ПЦР множеств амплифицированных экзонных районов гена HIS1 культиваров риса. Примите к сведению, что на фигуре «1» указывает на результат для Nipponbare, «2» указывает на результат для Koshihikari, «3» указывает на результат для Kasalath, «4» указывает на результат для Hokuriku 193, «5» указывает на результат для Takanari, «6» указывает на результат для Momiroman, и «M» означает маркер размера. Кроме того, «экзон 1» означает район экзона 1 гена HIS1, который был амплифицирован с помощью ПЦР, используя праймер, имеющий последовательность оснований SEQ ID NO: 3, и праймер, имеющий последовательность оснований SEQ ID NO: 4, «экзон 2» означает район экзона 2 гена HIS1, который был амплифицирован с помощью ПЦР, используя праймер, имеющий последовательность оснований SEQ ID NO: 5, и праймер, имеющий последовательность оснований SEQ ID NO: 6, «экзон 3» означает район экзона 3 гена HIS1, который был амплифицирован с помощью ПЦР, используя праймер, имеющий последовательность оснований SEQ ID NO: 7, и праймер, имеющий последовательность оснований SEQ ID NO: 8, «экзон 4» означает район экзона 4 гена HIS1, который был амплифицирован с помощью ПЦР, используя праймер, имеющий последовательность оснований SEQ ID NO: 9, и праймер, имеющий последовательность оснований SEQ ID NO: 10, и «экзон 5» означает район экзона 5 гена HIS1, который был амплифицирован с помощью ПЦР, используя праймер, имеющий последовательность оснований SEQ ID NO: 11, и праймер, имеющий последовательность оснований SEQ ID NO: 12. Кроме того, «левая половина экзона 4» означает левую пол-область внутри экзона 4 гена HIS1, которая была амплифицирована с помощью ПЦР, используя праймер, имеющий последовательность оснований SEQ ID NO: 13, и праймер, имеющий последовательность оснований SEQ ID NO: 14. Кроме того, на фигуре стрелки указывают на размеры, составляющие 100 п.о., 200 п.о. и 500 п.о.

Фиг. 17 является представлением в схематическом виде для иллюстрации результата сравнения структуры гена HIS1 Nipponbare с таковыми соответствующих генов Momiroman и Takanari.

Фиг. 18 является представлением в схематическом виде для иллюстрации результата сравнения структуры гена HIS1 Nipponbare с таковой соответствующего гена Kasalath.

Фиг. 19 является представлением для сравнения аминокислотных последовательностей белков, кодируемых геном HIS1 и гомологичным ему геном (геном HSL1), и иллюстрации гомологии.

На фиг. 20 представлены диаграммы для иллюстрации характеров экспрессии в тканях с генного локуса (хромосомы 2), в котором расположен ген HIS1, и с генного локуса (хромосомы 6), в котором расположен гомологичный ген (ген HSL1: Os06g0176700/Os06g0178500).

Фиг. 21 представляет собой филогенетическое дерево для иллюстрации того, что ген HIS1 и гомологичный ген относятся к генам, специфическим для растений Poaceae (однодольных растений). Примите к сведению, что на фигуре «HSL» является сокращением «подобного HIS1», указывающим на гомологичный ген HIS1.

На фиг. 22 представлена фотография для иллюстрации устойчивости к ингибитору 4-HPPD (бензобициклону) рекомбинантного риса (Kanto 239), в который был введен ген (HSL1; AK241948), обладающий высокой степенью гомологии с геном HIS1. Примите к сведению, что на фигуре «Kanto 239» указывает на результат для Kanto 239 (дикого типа), а «23-1», «23-21» и «23-25» указывают на результаты для Kanto 239 (рекомбинантного риса), содержащего введенный в него гомологичный ген (AK241948).

Описание вариантов осуществления

Агент для придания растению устойчивости к ингибитору 4-HPPD

Агент для придания растению устойчивости к ингибитору 4-HPPD настоящего изобретения характеризуется тем, что он включает ДНК или вектор, содержащий встроенную в него ДНК, кодирующую белок, обладающий силой придать растению устойчивость к ингибитору 4-HPPD, (которая ниже может называться ДНК устойчивости настоящего изобретения).

В настоящем изобретении «ингибитор 4-HPPD» означает агент для ингибирования функционирования 4-HPPD (4-гидроксифенилпируватдиоксигеназы) (ингибитор 4-HPPD). Как представлено на фиг. 1, ингибитор 4-HPPD ингибирует функционирование 4-HPPD и тем самым опосредованно ингибирует систему синтеза каротиноидов и является причиной разрушения хлорофилла с осветлением и увяданием растения насмерть. В настоящем изобретении примеры «ингибитора 4-HPPD» включают ингибиторы 4-HPPD типа трикетонов, такие как бензобициклон (BBC), мезотрион, тефурилтрион, темботрион и 2-(2-нитро-4-трифторметилбензоил)циклогексан-1,3-дион (NTBC), и ингибиторы 4-HPPD типа пиразолов, такие как пиразолат, бензофенап и пиразоксифен. Ингибитором 4-HPPD, устойчивость к которому придают растению с использованием ДНК устойчивости настоящего изобретения, являются предпочтительно ингибиторы 4-HPPD типа трикетонов, такие как BBC, мезотрион, тефурилтрион, темботрион и NTBC; особенно предпочтительно - BBC.

Примите к сведению, что, хотя компоненты гербицидов, такие как ингибиторы 4-HPPD, описанные выше, являются совершенно разными соединениями, гербициды можно подразделить на несколько групп на основе механизма действия, как указано далее (см. "From Pesticides to Agrobioregulators - disease, pest, and weed controls at present and in the future", Japan, CMC Publishing Co., Ltd., January 2010).

(I) Ингибирующие ацетил-КоА карбоксилазу (ACCase) гербициды

Эта группа гербицидов ингибирует ACCase, участвующую в первой стадии синтеза липидов, и ингибирует синтез клеточной мембраны, препятствуя росту растения. Гербициды, относящиеся к этой группе, далее подразделяют на гербициды (1) типа 4-арилоксифеноксипропионатов, (2) типа циклогександионоксимов и (3) типа дионов.

(II) Ингибирующие ацетолактатсинтазу (ALS) гербициды

Эта группа гербицидов, мишенью которой является ALS, ингибирует активность ALS и ингибирует синтез разветвленных аминокислот, препятствуя тем самым росту растения. Гербициды, относящиеся к этой группе, далее подразделяют на гербициды (1) типа сульфонилмочевин, (2) типа триазолинонов, (3) типа триазолопиримидинов, (4) типа пиримидинилсалицилатов и (5) типа имидазолинонов.

(III) Ингибирующие метаболизм 4-HPPD гербициды

Эта группа гербицидов ингибирует метаболизм 4-HPPD в пути метаболизма тирозина и опосредованно ингибирует систему синтеза каротиноидов растения с осветлением и увяданием растения насмерть. Гербициды, относящиеся к этой группе, далее подразделяют на гербициды (1) типа циклогександионов, (2) типа пиразолов, (3) типа бициклических соединений, (4) типа изоксазолов и (5) типа трикетонов. Кроме того, примеры гербицидов (1) типа циклогександионов включают производные бензоилциклогексан-1,3-диона. Примеры гербицидов (2) типа пиразолов включают пиразолат, бензофенап и пиразоксифен. Примеры гербицидов (3) типа бициклических соединений включают 3-замещенные производные бензоил-бицикло[4,1,0]гептан-2,4-диона. Примером гербицидов (4) типа изоксазолов является изоксафлутол. Примеры гербицидов (5) типа трикетонов включают BBC, мезотрион, тефурилтрион и темботрион.

(IV) Гербициды - ингибиторы фотопорфириноген IX-оксидазы (PPO)

Гербициды этой группы ингибируют синтез хлорофилла, разрушают клеточную мембрану и являются причиной гибели в результате увядания. Гербициды, относящиеся к этой группе, далее подразделяют на гербициды (1) типа дифенилового эфира, (2) типа диаллила и (3) типа пиразола.

(V) Ингибирующие элонгазу очень длинноцепочечных жирных кислот (VLCFAE) гербициды

Гербициды этой группы ингибируют ферменты системы биосинтеза очень длинноцепочечных жирных кислот, имеющих C20 или более, в системе биосинтеза липидов растения и приводят к увяданию растения насмерть.

(VI) Ингибирующие фитоендесатуразу (PDS) гербициды

Эта группа гербицидов ингибирует фермент PDS в пути биосинтеза каротиноидов и является причиной разрушения хлорофилла с осветлением и увяданием растения насмерть.

(VII) Ингибирующие PS II гербициды

Ингибиторы этой группы связываются с пластохиноном (PQ) и в результате ингибируют перенос электронов, в котором участвует PQ, с фотосистемы II (PS II) на фотосистему I (PS I), так что функция фиксации углерода в растении не может осуществляться, и растение подвергается увяданию насмерть.

(VIII) Гербициды - синтетические ауксины

Ингибиторы этой группы действуют подобно природному ауксину, который присутствует в растениях в низкой концентрации и регулирует рост растения, так что растение дифференцируется и растет анормально и в результате подвергается увяданию насмерть.

(IX) Ингибирующие EPSP-синтазу (EPSPS) гербициды

Ингибиторы этой группы связываются с EPSPS в пути шикимовой кислоты и ингибируют синтез EPSP. В результате биосинтез триптофана, фенилаланина и тирозина не происходит, и растение подвергается увяданию насмерть.

В качестве примеров ДНК устойчивости настоящего изобретения последовательность оснований гипотетического гена (гена HIS1; Os02g0280700) железо/аскорбат-зависимой оксидоредуктазы, происходящего из Nipponbare, представлена в SEQ ID NO: 1, а аминокислотная последовательность белка, кодируемого этой ДНК, представлена в SEQ ID NO: 2.

Кроме того, в качестве другого примера ДНК устойчивости настоящего изобретения последовательность оснований гена (подобного HIS1 (HSL) 1 гена; Os06g0176700/Os06g0178500 (AK241948), происходящего из Nipponbare, представлена в SEQ ID NO: 16), а аминокислотная последовательность белка, кодируемого этой ДНК, представлена в SEQ ID NO: 17.

Одной формой ДНК устойчивости настоящего изобретения является ДНК, кодирующая белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (типично ДНК, включающая кодирующую область последовательности оснований SEQ ID NO: 1).

Кроме того, другой формой ДНК устойчивости настоящего изобретения является ДНК, кодирующая белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 (типично ДНК, включающая кодирующую область последовательности оснований SEQ ID NO: 16).

После получения информации о последовательности оснований такой ДНК на текущем уровне техники квалифицированные в данной области техники специалисты могли бы модифицировать последовательности оснований различными путями для получения гена с мутацией(ями), кодирующего белок, обладающий силой придать растению устойчивость к ингибитору 4-HPPD. Кроме того, в природе также последовательность оснований может подвергаться мутированию. Поэтому ДНК устойчивости настоящего изобретения включает ДНК, кодирующую белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 2 и 17, в которой одна или более аминокислот являются замещенными, делетированными, добавленными и/или вставленными, при условии, что кодируется белок, обладающий вышеописанной силой. Здесь термин «более» относится, как правило, к 50 аминокислотам или менее, предпочтительно 30 аминокислотам или менее, более предпочтительно 10 аминокислотам или менее и особенно предпочтительно нескольким аминокислотам или менее (например, 5 аминокислотам или менее, 3 аминокислотам или менее, 2 аминокислотам или менее, или 1 аминокислоте) во всей аминокислотной последовательности белка HIS1 или белка HSL1.

Кроме того, после получения конкретной ДНК устойчивости на текущем уровне техники квалифицированные в данной области техники специалисты могли бы использовать информацию о последовательности оснований ДНК для выделения гомологичного гена, который кодирует белок, обладающий силой придать растению устойчивость к ингибитору 4-HPPD, из растения того же или отличного вида. В качестве растения, из которого получают такой гомологичный ген, предпочтительными являются однодольные растения, а особенно предпочтительными являются растения Poaceae. Примеры растений Poaceae включают рис (например, устойчивые к ингибитору 4-HPPD культивары Nipponbare, Koshihikari, Kitaaoba, Akihikari, Akitakomachi, Fukuhibiki, Bekoaoba, Bekogonomi, Yumeaoba, Hokuriku 193, Leaf Star, Tachisugata, Kusanohoshi, Hoshiaoba, Nishiaoba, Tachiaoba, Makimizuho, Mogumoguaoba, Hamasari, Minamiyutaka), ячмень, сорго, кукурузу и т.п.

Примеры способа получения гомологичного гена включают методы гибридизации (Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98: 503, 1975) и методы с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Saiki, R. K., et al. Science, 230: 1350-1354, 1985, Saiki, R. K. et al. Science, 239: 487-491, 1988). Для выделения гомологичного гена, как правило, реакцию гибридизации выполняют в жестких условиях. Примеры жестких условий гибридизации включают условия 6 M мочевины, 0,4% SDS и 0,5×SSC; и условия гибридизации эквивалентной им жесткости. Можно ожидать, что при использовании условий большей жесткости, например, условий 6 M мочевины, 0,4% SDS и 0,1×SSC, будет выделяться ген с большей степенью гомологии. ДНК устойчивости настоящего изобретения включает ДНК, гибридизующуюся в жестких услов