Новые композиции и их применение

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к модифицированным полипептидам остеопонтина, и может быть использовано в косметологии и медицине. Получают модифицированный остеопонтин, в котором RGD домен инактивирован. Изобретение позволяет эффективно стимулировать рост волос у млекопитающего. 8 н. и 61 з.п. ф-лы, 6 ил., 9 табл., 4 пр.

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к агентам для стимулирования роста волос у млекопитающих. В частности, предлагаются композиции, содержащие модифицированный полипептид остеопонтин, и их применение в фармацевтике и косметологии для стимулирования роста волос у млекопитающих (включая человека).

Уровень техники

Рост волос представляет собой циклический процесс, который протекает в три стадии: анагена (фаза активного роста), катагена (фаза дистрофических изменений в волосе) и телогена (фаза функционального покоя). После фазы функционального покоя волокно старого волоса выпадает и на его месте растет новый волос как часть повторяющегося цикла.

Алопеция, или выпадение волос, наблюдается как у мужчин, так и у женщин и связана с многочисленными причинами включая старение, изменение гормонального фона, стресс, химиотерапию. При перечисленных состояниях все больше волос остаются в стадии телогена, что приводит к постепенному уменьшению длины и диаметра волосяного волокна и в конечном итоге к частичному или полному облысению.

Известны различные типы выпадения волос, включая гнездную алопецию, андрогенетическую алопецию, анагеновое выпадение волос, самоиндуцированное выпадение волос, телогеновое выпадение волос, рубцовую алопецию. Гнездная алопеция, которая, как полагают, является аутоиммунным заболеванием, начинается с выпадения волос, в результате чего на волосистой части головы образуются округлые участки. Гнездная алопеция включает умеренное очаговое выпадение волос на волосистой части головы, а также выпадение волос на всей волосистой части головы, которое известно как тотальная алопеция, и выпадение волос как на волосистой части головы, так и на других частях тела (универсальная алопеция). Андрогенетическая алопеция наблюдается как у мужчин, так и у женщин и обусловлена наследственной предрасположенностью, старением и изменением уровня андрогенных гормонов. Причиной андрогенетической алопеции является повышенная андрогенная стимуляция, которая отрицательно сказывается на состоянии волосяных фолликулов. Повышенная андрогенная стимуляция может быть связана, помимо прочих механизмов, с повышенной активностью 5-альфа-редуктазы, фермента, который превращает тестостерон в дигидротестостерон. Анагеновая алопеция представляет собой выпадение волос в результаты неблагоприятного действия химических веществ или иониздрующего излучения, например у больных, которые получают лучевую или химиотерапию по поводу онкологического заболевания. Самоиндуцированное выпадение волос обусловлено сознательным или неосознаваемым повреждением волос. К двум известным типам самоиндуцированного выпадения волос относятся трихотилломания, когда человек постоянно выдергивает у себя волосы, и тракционная алопеция, которая связана с определенной прической, например «конским хвостом» или косами, которые постоянно тянут волосы. Под телогеновой алопецией понимают стрессовое выпадение волос, обусловленное такими состояниями, как хирургическое вмешательство, рождение ребенка, прерывание беременности. К другим причинам телогеновой алопеции относятся прием пероральных контрацептивов и других рецептурных средств, нарушение функции щитовидной железы, сахарный диабет, системная красная волчанка и психоэмоциональный стресс. К рубцовой алопеции относится выпадение волос при инфекционных и воспалительных заболеваниях волосяных фолликулов и выпадение волос в результате ожогов и других травм.

Выпадение волос - это широко распространенное заболевание, которое рассматривается некоторыми как косметологическая патология, и часто вызывает подавленное эмоциональное состояние. В связи с этим лечение алопеции представляет важную проблему. Испытано множество композиций, созданных для стимулирования роста волос, например, способствующих наступлению или продлению анагена. Примеры таких композиций включают: активаторы калиевых каналов, такие, как миноксидил (Regaine RTM., Pharmacia Corp.) и диазоксид; ингибиторы 5-альфаредуктазы, например финастерид (Propecia RTM., Merkand Co.), и иммунодепрессант циклоспорин А.

Однако лечение известными композициями для стимулирования роста волос недостаточно эффективно и сопровождается нежелательными побочными эффектами. Например, к нежелательным побочным эффектам активаторов калиевых каналов, помимо прочих, относятся сердечнососудистые эффекты, финастерид небезопасен для беременных женщин или женщин, которые собираются забеременеть, а циклоспорин А подавляет иммунную систему. Кроме того, даже при местном применении для стимулирования роста волос, известные композиции для лечения алопеции часто вызывают нежелательный рост волос на других участках тела, например на лице у женщин. Эти недостатки известных композиций для лечения алопеции приводят к тому, что многие пациенты, страдающие алопецией, прибегают к ношению париков или накладных прядей волос, другие решаются на трансплантацию волос, которая является дорогостоящей операцией и не всегда дает желаемый эффект, а иногда, например у больных, получающих химиотерапию, просто невозможна.

В связи с изложенным выше необходимо искать новые способы стимулирования роста волос, применимые как с медицинской, так и с косметологической точки зрения.

Сущность изобретения

Первый объект настоящего изобретения касается композиции для стимулирования роста волос у млекопитающих, содержащей:

(a) модифицированный полипептид остеопонтин, в котором RGD-домен инактивирован; и

(b) фармацевтически и/или косметически приемлемый наполнитель, носитель или растворитель.

Таким образом, активный компонент композиции по изобретению является производным природного белка остеопонтина (то есть полипептид содержит аминокислотную последовательность, соответствующую модифицированному, например мутированному, варианту природного белка остеопонтина).

Остеопонтин, известный и как костный сиалопротеин I (BSP-1 или BNSP), протеин ранней активации Т-лимфоцитов (ЕТА-1),секретируемый фосфопротеин 1 (SPP1), 2аг и белок резистентности к риккетсиям, является продуктом экспрессии гена, который имеется в генетическом аппарате ряда млекопитающих.

Ген остеопонтина имеет семь экзонов, длину 5 тпо и у человека локализован на длинном плече хромосомы 4 в области 13 (4q13). Белок состоит примерно из 300 аминокислотных остатков и богат кислыми аминокислотами: 30-36% из них приходится на долю аспартата или глутамата. Остеопонтин имеет около 30 присоединенных углеводных остатков, включая 10 остатков сиаловой кислоты, которые присоединяются к белку в процессе посттрансляционной модификации в аппарате Гольджи.

Остеопонтин был впервые выявлен как новый сиалопротеин в остеокластах, заякоренных на минерализованном костном матриксе (Franzenand Heinegard, 1985, Biochem. J. 232(3)715-24). Название остеопонтин происходит от расположения белка в кости (osteo-) и от способности образовать мостик (-pons) между костными клетками и минеральной фазой. Секвенирование и последующее исследование структуры показало, что остеопонтин является гликопротеином с молекулярной массой 32 кДа, содержащим высококислую область, имеющую около десяти остатков аспартата, что, как полагают, обусловливает минералосвязывающие свойства остеопонтина. Кроме того, в средней части молекулы остеопонтина имеется домен прикрепления к клетке, содержащий последовательность R-G-D (Oldbergetal., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83(23):8819-23).

Остеопонтин постоянно экспрессируется в остеобластах и некоторых типах эпителиальных клеток, что обусловливает секрецию этого белка во многие жидкости организма. Кость является единственным типом ткани, в которой остеопонтин откладывается и из которой его можно получить в большом количестве. Экспрессию остеопонтина можно также индуцировать в гладкомышечных клетках сосудистой стенки, в различных типах раковых клеток и воспалительных клетках (в частности, в макрофагах и Т-лимфоцитах). Остеопонтину приписывают ряд важных клеточных функций, например функцию адгезии, пролиферации, миграции, анти-апоптоза и хемоаттрактации. Некоторые из перечисленных функций, как сейчас полагают, опосредуются RGD-доменом клеточной адгезии, который взаимодействует с различными интегринами, главным образом с αvβ3, но также αvβ1 и αvβ5 (см. обзор Scatena et al., 2007, Arterio. Thromb. Vasc. Biol. 27:2302-2309).

В последние годы обнаружено, что остеопонтин обладает сильно выраженной цитокиновой активностью и модулирует деятельность нескольких типов клеток, которые участвуют в воспалительном процессе и иммунном ответе. Целый ряд функций, приписываемых остеопонтину, остаются неизученными и не поддаются объяснению одиночной RGD-последовательностью, связывающей клетки. Объяснение было найдено, когда был идентифицирован и затем функционально промаркирован пептид из одиннадцати аминокислотных остатков в молекуле остеопонтина R145-G-D-S-L-A-Y-G-L-R-S155 (последовательность SEQ ID NO: 122), соответствующий аминокислотам 144-154 идентификационного кода Ρ10923 консорциума UniProt. Помимо известного R145-G-D147 сайта, опосредующего связывания с αvβ3 интегрином, были выявлены две дополнительные важные области в молекуле остеопонтина, а именно: высокоспецифичный сайт расщепления тромбина, то есть R154-S155, и скрытый сайт связывания интегрина, то есть S148-L-A-Y-G-L-R154 (SEQ ID NO: 123), которая связывается с α9β1 интегрином (см. работу Scatena et al, цитированную выше). Идентифицирована также дополнительная связывающая область для α4β1 (см. работу Scatena et al, цитированную выше).

Характерная особенность полипептида, производного остеопонтина, в композиции по изобретению состоит в том, что RGD домен, который присутствует в природном остеопонтине, инактивирован и не функционирует (во всяком случае частично). Например, инактивация RGD домена может предупредить связывание производного полипептида остеопонтина с одним или более интегрином, который связывается с природным белком остеопонтина.

Таким образом, «модифицированный полипептид остеопонтина» мы включаем в полипептид, соответствующий модифицированной форме природного белка остеопонтина, в котором RGD домен является нефункциональным (по меньшей мере частично), а также его фрагментам и вариантам, которые сохраняют способность стимулировать рост волос «полноразмерного» модифицированного остеопонтина. Например, нефункционирующий RGD домен модифицированного полипептида остеопонтина может быть неспособен связываться с αvβ3 интегрином (см. работу Scatena et al., цитированную выше).

Предпочтительно использовать природный белок остеопонтин млекопитающих, например человека.

Модифицированные полипептиды остеопонтина, присутствующие в композиции по изобретению, обладают способностью стимулировать рост волос млекопитающих.

В одном варианте осуществления изобретения полипептид способен стимулировать рост волос человека

В другом варианте осуществления изобретения полипептид способен стимулировать рост волос in vivo.

Еще в одном варианте осуществления изобретения полипептид способен более эффективно стимулировать рост волос in vivo, чем дикий тип остеопонтина человека. Под выражением «более эффективно» в данном контексте подразумеваем более быстрое начало действия и/или более выраженный эффект при меньшей дозе и/или более выраженный максимальный эффект (например, появление большего количества новых волосяных фолликулов или большая плотность волос). В одном варианте осуществления изобретения полипептид способен стимулировать рост волос in vivo с более ранним началом действия и более высоким максимальным эффектом на рост волос по сравнению с диким типом остеопонтина человека, вводимого в той же дозе (см. Пример В).

Понятно, что специалисты в данной области могут вызывать рост волос, стимулируя имеющиеся волосяные фолликулы и/или индуцируя образование новых волосяных фолликулов.

Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения модифицированный полипептид остеопонтина способен стимулировать имеющиеся волосяные фолликулы (например, способствуя наступлению фазы анагена и/или сокращая стадию телогена, в результате чего остающиеся волосяные фолликулы становятся активными).

В еще другом варианте осуществления изобретения полипептид способен индуцировать образование новых волосяных фолликулов или индуцировать стволовые клетки, образующие такие фолликулы.

Природные белки остеопонтина в типичном случае содержат около 300 аминокислотных остатков. Однако для специалистов в данной области понятно, что модифицированные полипептиды остеопонтина, присутствующие в композициях по изобретению, могут иметь и другую длину цепи.

В типичном случае длина цепи полипептида меньше 500 аминокислотных остатков, например, меньше 400, 350, 340, 3330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 200, 150, 100, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или менее аминокислотных остатков.

В одном варианте осуществления изобретения длина цепи полипептида составила между 250 и 350 аминокислотных остатков, например между 280 и 300 аминокислотных остатков (например, 293 аминокислотных остатка).

В другом варианте осуществления изобретения длина цепи полипептида составила между 10 и 20 аминокислотными остатками, например между 12 и 18 аминокислотными остатками (например, 15 аминокислотных остатков).

Как было рассмотрено раньше, модифицированные полипептиды остеопонтина не имеют активной трипептидной последовательности «аргинин-глицин-аспартат», которая в норме присутствует в природных белках остеопонтина. Понятно, что данный RGD домен можно инактивировать целым рядом способов.

В одном варианте осуществления изобретения RGD домен в модифицированном полипептиде остеопонтина мутирован по одному или более аминокислотному остатку так, что содержит одну или более делецию, замену или вставку либо их сочетание по сравнению с природным белок остеопонтина.

Например, RGD домен может быть делетирован, по меньшей мере частично, так что аргинин, и/или глицин, и/или аспартат могут отсутствовать.

При другом варианте или в сочетании с вышеуказанным вариантом осуществления изобретения в RGD домене может оказаться замещенной одна или более аминокислота. Например, аргинин, и/или глицин, и/или аспартат могут быть замещены другой аминокислотой. Такие замены могут быть консервативными или неконсервативными.

Аналогично RGD домен может быть инактивирован комбинацией замен и делеций, включая

(a) замену остатка аргинина и делецию глицина и аспартата;

(b) замену аргинина и глицина и делецию аспартата (например, трипептид -RGD- может быть заменен дипептидной последовательностью -DI-):

(c) замену аргинина и аспартата и делецию глицина;

(d) делецию аргинина и аспартата и замену глицина.

В одном варианте осуществления изобретения трипептидная последовательность -RGD- замещена дипептидной последовательностью -DI-.

Не желая быть связанными теорией, отметим, что инактивация RGD последовательности может вызвать конформационные изменения в полипептиде остеопонтина (по сравнению с соответствующим природным белком остеопонтина), которые приводят к образованию или экспонированию нового сайта окружающей среде.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированный полипептид остеопонтина содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 (в которой подчеркнута область, включающая инактивированный RGD домен):

или ее фрагмента, варианта, производного или из слившейся последовательности (слияние упомянутого фрагмента, варианта или производного), которая сохраняет (по меньшей мере частично) способность стимулировать рост волос аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

Термин «аминокислота», используемый в описании, включает стандартные двадцать генетически закодированных аминокислот и их соответствующие стереоизомеры в «D» форме (по сравнению с природными «L» формами), омега-аминокислоты и другие природные аминокислоты, нетрадиционные аминокислоты (например, α,α-дизамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты и т.д.) и химические производные аминокислот (см. далее).

При специальном обозначении аминокислот, например, «аланин», «Ala» или «А» подразумевают как L-аланин, так и D-аланин, если особо не оговаривается иное. Другие, нетрадиционные, аминокислоты также могут быть подходящими компонентами полипептидов по изобретению, если полипептид сохраняет свои свойства и функциональную активность. Для продемонстрированных полипептидов каждый закодированный аминокислотный остаток там, где возможно, представлен одиночным буквенным символом, соответствующим тривиальному названию традиционной аминокислоты.

В соответствии с принятым соглашением аминокислотные последовательности, описываемые здесь, приводятся в направлении от N-конца к С-концу.

В типичных случаях модифицированные полипептиды остеопонтина, использованные в композициях по изобретению содержат L-аминокислоты или состоят из L-аминокислот.

В одном варианте осуществления изобретения полипептид может содержать или состоять из фрагмента аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее варианта.

Под словом «фрагмент» мы понимаем по меньшей мере шесть смежных аминокислот, принадлежащих аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, например, по меньшей мере 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291 или 292 последовательных аминокислотных остатка последовательности SEQ ID NO: 1.

Предпочтительно, чтобы фрагмент содержал или состоял из последовательности инактивированного RGD домена последовательности SEQ ID NO: 2, а именно:

DISLAYGLRS SEQ ID NO: 2

Например, фрагмент может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, соответствующей любой из SEQ ID NO: от 5 до 62.

В частности, в одном варианте осуществления изобретения полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5.

VDVPNGDISLAYGLR SEQ ID NO: 5 ["FOL-004"]

В другом варианте осуществления изобретения полипептид содержит или состоит из варианта аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее фрагмента.

Слово «вариант» означает, что в полипептиде не все 100% аминокислот такие же, как в последовательности SEQ ID NO: 1, то есть одна или более аминокислота последовательности SEQ ID NO: 1 должна быть мутированной. Например, полипептид может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 50% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, более предпочтительно на 60%, 70%, или 80%, или 85%, или 90% идентична указанной последовательности и особенно предпочтительно на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична указанной последовательности.

Степень идентичности в процентах определяется способами, хорошо известными специалистам в данной области, например, с помощью программы LALIGN (Huangand Miller, Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357), приведенной на сайте ExPASy

(bttp://www.ch.embnet.org/software/LALIGNform.html),

где используются следующие параметры: система глобального выравнивания, матрица BLOSUM62 штраф за внесение делеции 14, за продление делеции - 4.

При другом варианте идентичность последовательностей при сравнении двух полипептидов можно определить с помощью подходящих компьютерных программ, например программы GAP, разработанной группой компьютерной обработки генетической информации Висконсинского университета, при этом степень идентичности в процентах рассчитывают по отношению к полипептидам, аминокислотная последовательность которых оптимально выровнена.

Под словом «мутированный» мы подразумеваем, что изменен аминокислотный остаток в конкретном положении по сравнению с аминокислотным остатком в полипептиде, соответствующем SEQ ID NO: 1. Например, в конкретном положении аминокислотной последовательности может произойти делеция, замена или вставка одной или более аминокислоты. Специалистом в данной области ясно, что замена аминокислоты может быть консервативной или неконсервативной.

В другом варианте осуществления изобретения или в дополнение к нему аминокислоту в конкретном положении можно подвергнуть химической модификации (то есть использовать ее производное), о чем будет сказано далее.

В одном варианте осуществления изобретения вариант полипептида содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее фрагмента, в котором имеется консервативная замена одного или более аминокислотного остатка. Под «консервативной заменой» мы понимаем замену одной аминокислоты другой с аналогичными свойствами (размер, гидрофобность и т.д.), при которой функция полипептида существенно не изменяется. Так, «консервативной заменой» считается взаимная замена следующих аминокислот: Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gin; Ser, Thr; Lys, Arg; and Phe, Тут.

В предпочтительном варианте изобретения использован вариант полипептида, содержащий или состоящий из инактивированного RGD домена последовательности SEQ ID NO: 2, а именно:

DISLAYGLRS SEQ ID NO: 2.

Вариант полипептида может также содержать одну или более дополнительную аминокислоту, вставленную на N- или С-конце и/или в самой аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Например, полипептид может содержать или состоять из по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 дополнительных аминокислот на N-или С-конце или в самой последовательности.

В предпочтительном варианте изобретения этот вариант полипептида в естественных условиях не встречается.

В одном предпочтительном варианте изобретения модифицированный полипептид остеопонтина является видовым гомологом аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

Таким образом, полипептид может содержать или состоять из аминокислотной последовательности модифицированного белка человеческого остеопонтина или его фрагмента, в котором RGD домен инактивирован. Подходящая аминокислотная последовательность человеческого остеопонтина хорошо известна специалистам в данной области (см., например, номера поступлений ААА59974.1, ААС28619.1, ААА86886.1 в базе данных).

Например, модифицированный полипептид остеопонтина может содержать или состоять из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 (в которой подчеркнута область, содержащая инактивированный RGD домен,)

или ее фрагмента, варианта, производного или слитой последовательности (слитая последовательность указанного фрагмента, варианта или производного), которые сохраняют стимулирующую рост волос активность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения фрагмент или вариант аминокислотной последовательности содержит или состоит из инактивированного RGD домена последовательности SEQ ID NO: 4, а именно:

DISVVYGLRS SEQ ID NO: 4.

Например, фрагмент или вариант полипептида могут содержать или состоять из аминокислотной последовательности, соответствующей любой из SEQ ID NO: от 63 до 120 (о чем подробнее говорится ниже).

В, частности, в одном варианте осуществления изобретения полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63:

В еще одном варианте осуществления изобретения модифицированный пептид остеопонтина состоит из или содержит производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или 3 или фрагмент, вариант или слитую последовательность.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения производная аминокислотная последовательность содержит или состоит из инактивированной последовательности RGD домена SEQ ID NO: 3 или 4.

Например, полипептид может содержать или состоит из производного аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или 63.

Химические производные одной или более аминокислоты можно получить в реакциях, воздействуя на боковую функциональную группу. Такие производные включают, например, молекулы, в которых к свободной аминогруппе присоединен гидрохлорид, р-толуолсульфонильные группы, карбоксибензоксигруппы, t-бутилоксикарбонильные группы, хлорацетильные группы или формильные группы. Можно получить производные за счет свободной карбоксильный группы путем образования солей, метилового или этилового сложного эфира либо других типов сложных эфиров и гидразидов. За счет свободных гидроксильных групп можно получить О-ацил или О-алкил производные. В качестве химических производных включаются и пептиды, которые содержат природные производные двадцати стандартных аминокислот. Например, 4-гидроксипролин может заменить пролин, 5-гидроксилизин может заменить лизин, 3-метилгистидин может заменить гистидин, гомосерин может заменить серин и орнитин может заменить лизин. Производные включают также пептиды, содержащие одну или более вставку или делецию, если необходимая функциональная активность пептида сохраняется. Другие производные включают модификации, полученные путем амидирования, ацилирования аминоконцевой группы (например, ацетилирования или амидирования тиогликолевой кислотой), амидирования концевой карбоксильной группы (например, в реакции с аммиаком или метиламином) и другие подобные модификации концевой группы.

Специалистам в данной области ясно, что можно использовать и пептидомиметики, которые имитируют конформацию и свойства модифицированных полипептидов остеопонтина, описанных выше. Таким образом, в понятие «полипептид» мы включаем пептидомиметики, которые обладают стимулирующей рост волос активностью полипептида SEQ ID NO: 1.

Например, полипептиды по изобретению включают только молекулы, в которых аминокислотные остатки соединены пептидной (-CO-NH-) связью, а также молекулы, в которых пептидная связь реверсирована. Такие ретроинвертированные пептидомиметики можно создать способами, известными специалистам в данной области, например способом, описанным в статье Meziere et al.(1997) J. Immunol.159, 3230-3237, включенной в настоящее описание путем ссылки. Этот способ позволяет создавать псевдопептиды, содержащие изменения, затрагивающие остов молекулы, а не ориентацию боковых цепей. Ретроинвертированные пептиды, содержащие вместо (-CO-NH-) пептидных связей (-NH-СО-) связи, значительно более устойчивы к протеолизу. В другом варианте осуществления изобретения полипептид по изобретению может быть пептидомиметиком, в котором один или более аминокислотный остаток связан -y(CH2NH)- связью вместо обычной амидной связи.

В еще другом варианте осуществления изобретения пептидная связь может вовсе отсутствовать при условии, что имеется линкерная часть, которая заполняет промежуток между атомами углерода аминокислотных остатков; предпочтительно, чтобы линкерная часть имела по существу такое же распределение заряда и по существу такую же планарность, как и пептидная группа.

Понятно, что полипептид можно традиционно блокировать у N- или С-конца, чтобы сделать его устойчивым к экзопротеолитическому перевариванию.

Различные некодируемые или модифицированные аминокислоты, такие, как D-аминокислоты и N-метиламинокислоты, также используются для модификации полипептидов млекопитающих. Кроме того, предполагаемую биоактивную конформацию можно стабилизировать путем ковалентной модификации, например циклизации, или путем встраивания лактамовых или другого типа мостиков (см., например, работы Veber et. al, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA75:2636 и Thursell et al, 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm.Ill: 166, которые включены в описание в виде ссылки).

Частым вопросом при обсуждении многих методик синтеза является введение циклической части в пептид. Циклическая часть ограничивает конформационное пространство структуры пептида, что часто приводит к повышению специфичности пептида для конкретного биологического рецептора. Другое преимущество такой стратегии состоит в том, что введение циклической части в пептид может также привести к снижению чувствительности пептида к действию клеточных пептидаз.

Так, пример полипептида по изобретению содержит концевую аминокислоту цистеин. Такой полипептид может существовать в гетеродетной циклической форме за счет образования дисульфидной связи меркаптидными группами в концевых молекулах цистеина или в гомодетной форме при образовании амидной связи между концевыми аминокислотами. Как уже говорилось, циклизация небольших молекул пептидов с помощью дисульфидных или амидных связей между молекулами цистеина в N- и С-концевой области может преодолеть проблему низкой специфичности и короткого периода полужизни, иногда возникающую в случае линейных пептидов, за счет повышения устойчивости к протеолизу, а также повышения ригидности структуры, что может повысить специфичность соединения. Полипептиды, циклизованные за счет образования дисульфидных мостиков, имеют свободную амино- и карбоксильную группу, которая подвержена протеолитической деградации, в то время как пептиды, циклизованные за счет образования амидной связи между N-концевой аминогруппой и C-концевой карбоксильной группой, уже не содержат свободной амино- или карбоксильной группы. Таким образом, пептиды по изобретению могут связываться либо за счет пептидной C-N связи, либо за счет дисульфидной связи.

Настоящее изобретение никак не ограничивается способом циклизации пептидов, но охватывает пептиды, чья циклическая структура может быть достигнута любым подходящим способом синтеза. Так, гетеродетная связь может включать (но не ограничивается ими) дисульфидные, алкиленовые или сульфидные мостики. Способы синтеза циклических гомодетных пептидов и циклических гетеродетных пептидов включая дисульфидные, сульфидные и алкиленовые мостики описаны в патенте US 5643873, который включен в настоящее описание путем ссылки. Другие примеры способов циклизации включают циклизацию путем клик-химии, с помощью эпоксидов и реакции альдегид-амин, а также способов, описанных в патенте US 6008058, который включен в настоящее описание путем ссылки.

Такие концевые модификации применяются, как известно, для уменьшения подверженности протеиназному перевариванию и тем самым удлинения периода полужизни пептидов в растворах, особенно в биологических жидкостях, в которых могут присутствовать протеазы. Циклизация полипептидов выгодна и потому, что при ней образуются стабильные структуры и что циклические пептиды обладают биологической активностью.

Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения первый объект изобретения касается циклических полипептидов.

Однако в другом варианте осуществления изобретения рассматриваются линейные полипептиды.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированный полипептид остеопонтина содержит одну или более аминокислоту, модифицированную или производную, полученную путем пегилирования, амидирования, эстерификации, ацилирования, ацетилирования и/или алкилирования.

Специалистам в данной области понятно, что модифицированный полипептид остеопонтина можно гликозилировать по одной или более аминокислоте. Например, полипептид может сохранять одно или более место гликозилирования соответствующего «родительского» белка остеопонтина, к которому можно присоединить углеводную группу.

В еще одном варианте осуществления изобретения модифицированный полипептид остеопонтина содержит или состоит из слитых аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1 или 3 или из их фрагмента.

Например, полипептид может содержать слитые аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 5 или 63.

Под «слитым» пептидом мы понимаем аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1 или 3 (или фрагмент либо вариант этих последовательностей), слитую с любым другим полипептидом. Например, указанный полипептид может слиться с таким полипептидом, как глутатион-8-трансфераза (GST) или белок А с целью облегчения очистки указанного полипептида. Примеры такого слияния хорошо известны специалистам в данной области. Аналогично указанный полипептид можно слить с олигогистидиновой меткой, такой, как His6 или эпитопом, распознаваемый антителами, в частности хорошо известным эпитопом Мус. В настоящем изобретении рассматриваются также пептиды, образовавшиеся в результате слияния с любым вариантом или производным указанного полипептида.

Слитый пептид может содержать часть, которая придает пептиду по изобретению желаемое свойство; например, такая часть может усиливать способность пептида стимулировать рост волос. Например, в одном варианте осуществления изобретения слитый пептид содержит альбумин человеческой сыворотки или аналогичный ему белок (как описано в заявке US 2009/0005312, данные которой включены в настоящее описание путем ссылки).

В другом варианте осуществления изобретения часть, которую сливают с пептидом, может быть липофильной молекулой или полипептидным доменом, который способен стимулировать захват полипептида клеткой, что известно специалистам в данной области.

В еще другом варианте осуществления изобретения модифицированный полипептид остеопонтина содержит или состоит из тандемных повторов аминокислотной последовательности. Например, полипептид может содержать или состоять из тандемных повторов SEQ ID NO: 2 и/или 4 (или их комбинаций), которые могут быть связаны друг с другом непосредственно или через вставочные аминокислотные остатки.

В другом варианте осуществления изобретения полипептид может содержать или состоять из тандемных повторов SEQ ID NO: 5 или 63.

Однако в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированный полипептид остеопонтина просто содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или 3. Например, полипептид может состоять из полипептида, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 1 или 3.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированный полипептид остеопонтина просто содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или 63. Например, полипептид может содержать или состоять из полипептида, соответствующего SEQ ID NO: 5 или 63.

Модифицированные полипептиды остеопонтина, подходящие для использования в композициях по изобретению, можно получить in vitro способами, основанными на экспрессии в клетках, хорошо известными специалистам в данной области (например, руководство см. Sambrook and Russell, 2000, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, New York, включенное в настоящее описание путем ссылки). Выбор вектора экспрессии и клетки-хозяина зависит от ряда факторов. Например, для гликозилирования модифицированного полипептида остеопонтина необходима экспрессирующая система млекопитающих.

Подходящие векторы экспрессии и клетки-хозяева имеются в продаже и доступны из многих источников.

Модифицированные полипептиды остеопонтина можно также синтезировать известными средствами, например, в виде жидко- и твердофазного синтеза (например, твердофазного синтеза t-Boc и BOB-SPPS).

Специалистам в данной области ясно, что настоящее изобретение также включает фармацевтически и косметически приемлемые соли присоединения кислоты или основания описанных выше модифицированных полипептидов остеопонтина. Для получения фармацевтически и/или косметически приемлемых солей присоединения кислоты упомянутых выше основных соединений по изобретению используются кислоты, которые образуют нетоксичные соли присоединения кислоты, то есть соли, содержащие фармацевтически и/или косметически приемлемые анионы, такие, как гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, нитрат, сульфат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, ацетат, лактат, цитрат, кислый цитрат, тартрат, битартрат, сукцинат, малеат, фумарат, глюконат, сахарат, бензоат, метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, пара-толуолсульфонат и памоат [то есть 1,1′-метилен-бис-(2-гидрокси-3 нафтоат)] и пр.

Фармацевтически и/или косметически приемлемые соли добавления основания также можно использовать для получения фармацевтически и косметически приемлемых солей модифицированных полипептидов остеопонтина. Химические основания, которые можно использовать в качестве реагентов для получения фармацевтически и/или косметически приемлемых основных солей настоящих соединений, имеющих кислотную природу, - это основания, которые образуют нетоксичные основные соли с такими соединениями. Такие нетоксичные основные соли включают (но не ограничиваю