Внеклеточный домен тирозинкиназного рецептора, связывающий аллостерический ингибитор

Внеклеточный домен тирозинкиназного рецептора, связывающий аллостерический ингибитор

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к внеклеточному домену, связывающему аллостерический ингибитор, где указанный связывающий домен происходит из тирозинкиназного рецептора, один раз пронизывающего мембрану. Более конкретно, изобретение относится к внеклеточному домену, происходящему из тирозинкиназного рецептора, т.е. рецептора фактора роста фибробластов (FGFR), рецептора фактора роста сосудистого эндотелия (VEGFR) или рецептора фактора роста из тромбоцитов (PDGFR). Изобретение дополнительно относится к применению этого домена для идентификации сходных доменов во внеклеточной части других тирозинкиназных рецепторов и к способу скрининга для идентификации аллостерического ингибитора.

Рецепторы клеточной поверхности представляют собой мишени для большинства имеющихся лекарств (Overington, et al., 2006). Исторически в программах поиска лекарств доминировали попытки разработать антагонисты, которые конкурируют за связывание с эндогенными лигандами в ортостерических сайтах. Напротив, труднее идентифицировать лекарства, которые связываются с аллостерическими сайтами, т.е. доменами, топографически отличными от доменов, используемых ортостерическими лигандами (если мишень представляет собой рецептор) или субстратами (если мишень представляет собой фермент), и модулируют активность белка. Однако в последние годы наблюдается рост количества аллостерических модуляторов, идентифицированных для управляемых лигандами каналов и рецепторов, сопряженных с G-белками (GPCRs) (Christopoulos, 2002; Kenakin, 2010). Неожиданно оказалось, что до сих пор не идентифицированы аллостерические низкомолекулярные вещества, являющиеся модуляторами рецепторных тирозинкиназ (RTKs), узнающих ростовые факторы, несмотря на тот факт, что это надсемейство рецепторов имеет огромные биологическую важность и медицинское значение и, несмотря на тот факт, что аллостерические лекарства могут предоставить особые терапевтические преимущества по сравнению с традиционными ортостерическими лигандами, включая более высокую безопасность и/или избирательность. К настоящему времени большинство способов лечения, направленных на RTKs, сфокусировано либо на моноклональных антителах, узнающих лиганды в виде ростовых факторов, либо на низкомолекулярных химических соединениях, прямо ингибирующих тирозинкиназную активность рецепторов.

Среди других одной областью, которая может получить существенные преимущества от более эффективных и/или селективных низкомолекулярных ингибиторов RTK, является область лечения с помощью антиангиогенных лекарств. Антиангиогенные агенты, направленные на VEGF, продлевают выживаемость онкологических больных, но их общий успех ограничен внутренней резистентностью, избеганием за счет приобретенной устойчивости и, по меньшей мере, в доклинических моделях, стимуляцией метастазирования. Было высказано предположение, что сочетанная терапия с дополнительными антиангиогенными агентами может помочь преодолеть эти проблемы. Фактор 2 роста фибробластов (FGF)-2, первый идентифицированный ангиогенный фактор, является привлекательным кандидатом для лекарства. Действительно, было показано, что сигнализация через FGFR связана с раковыми и воспалительными заболеваниями (Shin et al., 2006; Eswarakumar et al., 2005; Malemud et al., 2007; Carmeliet, 2005), вносит вклад в изменение опухолевого ангиогенеза (Presta et al., 2005; Kubo et al., 2002; Shine et al., 2006; Lavine et al., 2006) и оберегает васкуляризацию опухолей, а также способствует ее восстановлению после лечения ингибиторами VEGF (Casanovas et al., 2005). Несмотря на это, семейство FGF не привлекало существенного внимания при разработке антиангиогенных лекарств частично из-за обилия членов этого семейства из 18 лигандов и 4 FGFRs (Eswarakumar et al., 2005; Beenken and Mohammadi, 2009; Cenni et al., 2005; Bossard et al., 2004; Compagni et al., 2000). Также селективные ингибиторы тирозинкиназы FGFR не были одобрены для клинического использования (Dimitroff et al., 1999; McDermott et al., 2005).

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Неожиданно изобретатели нашли, что с помощью высокопроизводительного скрининга в сочетании с химической оптимизацией может быть идентифицирован первый перорально активный низкомолекулярный аллостерический ингибитор RTK, а именно FGFR. Это соединение названо SSR128129 (аббревиатура «SSR») (фиг.3).

Как проиллюстрировано с помощью подробного исследования на основании активности SSR, SSR обладает способностью ингибировать все члены одного и того же семейства, представляющего семейство FGFRs. Как представлено в последующих примерах, SSR способен ингибировать активность FGFR1 (фиг.4 и 6), активность FGFR2 (фиг.8), активность FGFR3 (фиг.9) и активность FGFR4 (фиг.7). Таким образом, этот аллостерический ингибитор связывается с эволюционно консервативным аллостерическим сайтом FGFR, расположенным во внеклеточном домене рецептора, который является общим для различных членов TRKs. Этот консервативный сайт расположен в домене III FGFR (фиг.11). Связывание SSR со своим сайтом связывания индуцирует «избирательный антагонизм». Этот эффект подтверждается тем фактом, что связывание SSR с аллостерическим сайтом связывания ведет к конформационному изменению рецептора, особенно в выявленном фрустрированном домене. Вследствие избирательного антагонизма предлагается путь идентификации аллостерического ингибитора с помощью использования тестирующего скрининга на основе измерений путей фосфо-сигнализации, как описано ниже. С этого момента SSR является первым примером аллостерического ингибитора RTK.

Подтверждение направленности на такой сайт в FGFR и направленности на сходные сайты в других RTKs, таких как VEGFR2 и PDGFRβ, связано с важным практическим применением и должно привести к существенному терапевтическому преимуществу.

Различные аспекты этого изобретения проиллюстрированы в подробном описании изобретения и в последующих примерах.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте в изобретении предлагается аллостерический сайт связывания, происходящий из внеклеточного домена тирозинкиназного рецептора. Как применяется в настоящем описании, аллостерический сайт связывания обозначает сайт, с которым ингибитор, предпочтительно низкомолекулярное вещество, может связываться, не вызывая конкурентного ингибирования связывания лиганда с лигандсвязывающим сайтом рецептора. Как применяется в настоящем описании, «происходящий из» обозначает, что аллостерический сайт связывания состоит из части внеклеточного домена, но не включает полный внеклеточный домен. Предпочтительно, аллостерический сайт связывания составляет между 10 и 200 аминокислотами в длину, более предпочтительно между 10 и 100 аминокислотами, даже более предпочтительно между 20 и 50 аминокислотами, где указанные аминокислоты являются частью внеклеточного домена рецептора.

Как применяется в настоящем описании, низкомолекулярное вещество представляет собой вещество неполимерной природы, предпочтительно с молекулярной массой менее 1000 Да, более предпочтительно менее 900 Да, более предпочтительно менее 800 Да, более предпочтительно менее 700 Да, более предпочтительно менее 600 Да, даже более предпочтительно менее 500 Да.

Тирозинкиназный рецептор и рецепторная тирозинкиназа (RTK) применяются в объеме данного патента как эквивалентные формы. «Тирозинкиназный рецептор» используется для обозначения рецептора, в то время как «рецепторная тирозинкиназа» используется для более конкретного указания на киназную активность рецептора. Тирозинкиназные рецепторы известны специалисту в данной области техники и включают, но не ограничиваются этим, рецепторы EGF, инсулиноподобного фактора роста, PDGF, FGF, VEGF, HGF, Trk, AXL, LTK, TIE, ROR, DDR, PKT7, RYK, CCK4, семейства рецепторов Eph и MuSK. Предпочтительно указанный аллостерический сайт связывания происходит из внеклеточного домена TRK с Ig-доменом, включая AXL, FGFR, MuSK, PDGFR, PTK7, ROR, TIE и VEGFR…; даже более предпочтительно указанный аллостерический сайт связывания происходит из TRK с прерывистым киназным доменом в цитоплазматическом домене; в предпочтительном варианте осуществления TRKs по изобретению представляют собой рецепторы фактора роста фибробластов или их гомологи, ортологи или паралоги.

«Гомологи» белка охватывают пептиды, олигопептиды, полипептиды, белки и ферменты, имеющие аминокислотные замены, делеции и/или вставки относительно интересующего немодифицированного белка и имеющие биологическую и функциональную активность, сходную с немодифицированным белком, из которого они произошли. «Ортологи и паралоги» охватываются эволюционными концепциями, используемыми для описания взаимоотношений предковых генов. Паралоги представляют собой гены тех же видов, которые произошли путем дупликации предкового гена; ортологи представляют собой гены различных организмов, которые произошли при видообразовании, и также происходят от общего предкового гена.

Такое аллостерическое связывание относится к SEQ ID NO: 1, принадлежащей к семейству FGFRs, более конкретно к FGFR2. Предпочтительно указанный аллостерический ингибиторный сайт включает SEQ ID № 1, даже более предпочтительно он состоит из SEQ ID № 1.

В другом аспекте в изобретении предлагается гомолог, паралог или ортолог аллостерического сайта связывания. Предпочтительно полипептидная последовательность этих гомологов, паралогов или ортологов имеет гомологию с SEQ ID NO.1, по меньшей мере, 70%, 80%, 90%, 95% или более.

В качестве примера, такие паралоги аллостерического сайта связывания присутствуют в семействе FGFRs.

Главным образом аллостерический сайт связывания по изобретению локализован в домене III FGFRs.

Таким же образом аллостерический сайт связывания VEGFR2 локализован в Ig-домене 6 рецептора в области, включающей лизин 609 и лизин 648.

Аллостерический сайт связывания присутствует также в PDGFRβ и локализован в области, расположенной вблизи трансмембранного участка, главным образом в Ig-домене 3, в области, включающей лейцин 383 и лизин 387. Предпочтительно связывание аллостерического ингибитора с аллостерическим сайтом связывания индуцирует избирательный антагонизм.

Применяемый в настоящем описании термин «избирательный антагонизм» обозначает, что для рецептора с несколькими нижележащими путями проведения сигнала не все пути задействованы или не все пути задействованы в одинаковой степени при связывании аллостерического ингибитора с аллостерическим ингибиторным сайтом связывания. В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, один нижележащий путь ингибирован, тогда как, по меньшей мере, один другой нижележащий путь не затронут.

Предпочтительно аллостерический сайт связывания по изобретению включает, предпочтительно по существу состоит, даже более предпочтительно состоит из фрустрированного домена.

Применяемый в настоящем описании термин «фрустрированный домен» обозначает домен белка или его фрагмента, который неоднозначно ориентирован на одну структурную конформацию; фрустрированные домены известны специалисту в данной области техники, и присутствие фрустрированных доменов определяется либо по неоднозначному ответу в одной программе предсказания вторичной структуры белка; либо по противоречию в предсказании между двумя различными программами предсказания вторичной структуры белка. Предпочтительно он определяется по противоречию в предсказании программой предсказания вторичной структуры белка и реальной структурой, определенной методом определения структуры белка, таким как кристаллизация и дифракция рентгеновских лучей. В качестве неограничивающего примера, противоречие может быть в указании на α-спираль в одном методе и на β-складку в другом методе. Белки являются минимально фрустрированными; однако, некоторые домены (называемые «фрустрированными доменами») индуцируют некоторую фрустрацию, и эти домены склонны индуцировать конформационные изменения белка.

В предпочтительном варианте осуществления указанный фрустрированный домен включает SEQ ID № 2, предпочтительно он состоит из SEQ ID № 2. Этот фрустрированный домен принадлежит к семейству FGFRs, особенно к FGFR2.

Другие фрустрированные домены могут быть идентифицированы, как указано выше.

В другом аспекте в изобретении предлагается использование аллостерического сайта связывания по изобретению для индукции избирательного антагонизма при связывании лиганда с сайтом связывания тирозинкиназного рецептора, в котором локализован аллостерический сайт связывания. В еще одном аспекте в изобретении предлагается использование аллостерического сайта связывания по изобретению для скрининга низкомолекулярных ингибиторов, полученных из случайной библиотеки, связывающихся с указанным сайтом.

В еще одном аспекте в изобретении предлагается способ идентификации аллостерического ингибиторного сайта связывания во внеклеточном домене тирозинкиназного рецептора, включающий скрининг на присутствие фрустрированных доменов в указанном внеклеточном домене. Способы скрининга фрустрированных доменов известны специалисту в данной области техники и пример такого способа описан в примере 8. В качестве неограничивающего примера фрустрированные домены определяют по неоднозначному ответу в одной программе предсказания вторичной структуры белка; предпочтительно по противоречию в предсказании между двумя различными программами предсказания вторичной структуры белка, даже более предпочтительно по противоречию в предсказании программой предсказания вторичной структуры белка и реальной структурой, определенной методом определения структуры белка, таким как кристаллизация и дифракция рентгеновских лучей. Программы предсказания вторичной структуры белка известны специалисту в данной области техники; в качестве неограничивающего примера такие программы описаны Rost (2003). Предпочтительно указанный фрустрированный домен расположен в непосредственной близости от указанного аллостерического сайта связывания; более предпочтительно он локализован не более чем на 20 аминокислот от границы сайта связывания, даже более предпочтительно не более чем на 10 аминокислот, даже более предпочтительно он примыкает к указанному сайту связывания, даже более предпочтительно он перекрывается с указанным сайтом связывания, наиболее предпочтительно он включен в сайт связывания. После идентификации возможных ингибиторных сайтов скрининг может быть завершен подтверждением функции возможного ингибиторного сайта путем создания соединений, таких как малые молекулы, малые пептиды, пептидомиметики, антитела или нанотела, которые связываются с сайтом и для которых может быть протестирована аллостерическая ингибиторная функция.

В другом аспекте в изобретении предлагается способ идентификации низкомолекулярного аллостерического ингибитора, связывающегося с аллостерическим сайтом связывания внеклеточного домена тирозинкиназного рецептора по изобретению, включающий сравнение двух различных репортеров, индуцируемых двумя различными нижележащими путями сигнализации в зависимости от активации указанного тирозинкиназного рецептора. Репортер представляет собой любой ген, белок или соединение, которое дает определяемый сигнал, и в качестве неограничивающего примера может представлять собой ген устойчивости к антибиотикам, ген токсина, приводящего к клеточной гибели, ген, кодирующий флуоресцентный белок, такой как GFR, или ген, кодирующий белок с ферментативной активностью, такой как бета-галактозидаза, или белок, который фосфорилируется или дефосфорилируется, ацетилируется или дезацетилируется или конформация которого изменяется. В случае репортерного гена кодирующую последовательность помещают под контроль подходящего промотора, т.е. промотора, который индуцируется в результате связывания лиганда с рецептором и последующей индукции пути для репортера; в случае двойного пути сигнализации требуется два различных промотора. В качестве неограничивающего примера при сравнении фосфорилирования белков в присутствии или в отсутствие аллостерического ингибитора можно получить различия в фосфорилировании из-за избирательного антагонизма, и эти различия в фосфорилировании могут быть использованы в качестве репортерных.

В предпочтительном варианте осуществления идентификация аллостерического ингибитора RTK может быть выполнена путем осуществления метода скрининга, включающего следующие стадии:

a) введения в контакт аллостерического сайта связывания RTK с кандидатным веществом для аллостерического ингибирования

b) измерения изменений, по меньшей мере, в двух нижележащих путях в зависимости от активации/ингибирования указанного тирозинкиназного рецептора,

c) сравнения изменений в состоянии, по меньшей мере, одного репортера, у которого, по меньшей мере, два различных нижележащих пути зависят от активации/ингибирования указанного тирозинкиназного рецептора,

где аллостерический ингибитор является идентифицированным, когда при наличии связывания лиганда с лигандсвязывающим доменом рецептора, по меньшей мере, один нижележащий путь ингибирован, тогда как, по меньшей мере, один другой нижележащий путь не затронут. Изменение в состоянии репортера зависит от используемого репортера и может представлять собой в качестве неограничивающего примера изменение фосфорилирования репортерного белка или переключение от отсутствия индукции к индукции гена (и наоборот). Предпочтительно указанное изменение в состоянии представляет собой изменение в состоянии фосфорилирования.

Предпочтительно изменения в нижележащих путях прослеживаются путем измерения изменений в путях фосфо-сигнализации, включая сигнальные пути ERK1/2 и PLCγ.

В другом варианте осуществления аллостерический модулятор FGF-Rs может быть идентифицирован при использовании аффинного скрининга на основе SEC-LC/MS, как описано ниже:

Метод SEC-LC/MS представляет собой аналитический метод, используемый для аффинного скрининга, состоящий из 2-компонентной системы, соединенной в режиме реального времени: хроматографии, исключающей по размеру, в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией для выделения с последующей ионизацией электрораспылением с использованием для детекции время-пролетной масс-спектрометрии.

Метод основан на способности некоторых соединений взаимодействовать с растворимыми полипептидами (включая пептиды, домены белков или полноразмерные белки). После смешивания пула низкомолекулярных соединений с интересующим пептидом комплекс пептид-лиганд индуцирует сдвиг массы, позволяющий разделить несвязанные и связанные низкомолекулярные соединения с помощью хроматографии, исключающей по размеру. Затем комплекс диссоциируют, и связываемые соединения отделяют от пептида и определяют с использованием LC/ESI-TOF высокого разрешения для точного измерения массы (например, с помощью масс-спектрометра Waters LCT Premier). Данные деконволюционного алгоритма позволяют идентифицировать связанные молекулы из данных анализа определения масс.

Для идентификации низкомолекулярных веществ аллостерических модуляторов FGFRs этот метод может быть применен к внеклеточному домену различных FGFRs, либо нативных, либо мутантных. Нативная форма позволяет определить всех участников связывания с внеклеточным доменом. Альтернативно, можно провести скрининг аллостерических модуляторов путем использования «открытой» формы спирали FGF-R2 в непосредственной близости к сайту связывания SSR. Указанная «открытая» форма может быть получена с помощью мутации Tyr328Arg-Ile329Lys, которая стабилизирует альфа-спираль, позволяя тем самым повысить чувствительность к связыванию SSR. Мутантный FGF-R2 затем используют для скрининга вместо WT FGF-R2. Сходная стратегия может быть использована для скрининга FGF-R1, -R3 или -R4 с мутациями аминокислот, соответствующими Tyr328 и Ile329 в FGF-R2. Мутантная форма с Tyr328Asp (FGF-R2) или других FGF-Rs с мутацией в соответствующих положениях может быть использована в качестве контроля. Действительно, SSR не способен связываться с FGF-R2, который мутирован с Tyr328Asp вблизи гидрофобного кармана. Следовательно, эта мутантная форма может быть использована для отбрасывания части соединений, которые не взаимодействуют с карманом FGF-R2, являющимся мишенью.

Во всех этих случаях данная стратегия ведет к идентификации низкомолекулярных соединений, способных связываться с карманом интересующего пептида, являющимся мишенью. На второй стадии оценивается влияние на сигнализацию в клетке. На основе путей фосфо-сигнализации, идентифицированных матрицей Proteome Profiler™ «набор с матрицей фосфокиназ человека» от R&D Systems, аллостерические модуляторы могут быть проверены с помощью ELISA (на белковых клеточных экстрактах или прямо на клетках) на их способность ингибировать действие FGF-2 на HUVEC на уровне фосфорилирования киназ (на PYK2, eNOS, p53, c-jun, AKT, CREB, Erk1/2) в отсутствие ингибирования не подверженных влиянию киназ, определенных по протеомному профилю.

Сходный подход может быть использован для других RTKs: после идентификации одного или более фрустрированных доменов во внеклеточном домене рецептора, указанный фрустрированный домен может быть использован в подходе SEC-LC/MS для идентификации связывающихся соединений в области фрустрированного домена. Затем может быть протестировано действие связывающегося соединения на путь сигнализации с использованием подхода картирования фосфо-белков, как описано выше, или любой другой репортерной системы пути.

В еще одном аспекте в изобретении предлагается низкомолекулярное соединение, связывающееся с аллостерическим сайтом связывания, называемое также «аллостерическим ингибитором» по изобретению, и/или идентифицированное способом по изобретению.

«Соединение» обозначает любое химическое или биологическое соединение, включая простые или сложные, органические или неорганические молекулы, пептиды, пептидомиметики, белки, антитела, углеводы, нуклеиновые кислоты или их производные.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1: A/Эксперимент с количественной ПЦР на HUVEC выявил экспрессию только FGFR1 и FGFR4. B/Анализом ОТ-ПЦР идентифицированы изоформы FGFR1β и FGFR4. FGFR1 представлен в формате варианта IIIc (C).

Фиг.2: Клетки BaF/3, трансфецированные FGFR1βIIIc-hMpI, способны пролиферировать, когда вставленный FGFR активирован. Только FGF4 (A) способен индуцировать FGFR1βIIIc, тогда как FGF19 не способен (B).

Фиг.3: Демонстрация соединения SSR

Фиг.4: Исследование активности SSR по пролиферации клеток эндотелия. A/Только FGF2 и FGF4 стимулируют пролиферацию HUVEC, демонстрируя, что FGFR1 управляет пролиферацией в этих клетках. B/SSR ингибирует индуцируемую FGF2 пролиферацию HUVEC, демонстрируя антагонистическое действие SSR на FGFR1. C/В эндотелиальных клетках жировых телец крыс (REPEC), трансфецированных FGFR1, FGF2 индуцировал аутофосфорилирование FGFR1, которое только частично ингибировалось SSR даже при высоких дозах. D/Это ингибирование не обусловлено конкурентным действием SSR на связывание FGF2 в PAEC, трансфецированных FGFR1, или в HUVEC.

Фиг.5: A/Связывание FGF1, флуоресцентно меченного lumio (FGF1-lumio), с очищенным ECD FGFR2 без Fc-метки (FGFR2∂123) по измерению скорости ротации в качестве параметра анизотропии. Не наблюдается прямой конкуренции между SSR и FGF1-lumio. B/SSR не способен ингибировать мультимеризацию FGFR2 или C/димеризацию FGF2.

Фиг.6: Исследование активности SSR в отношении хемотаксиса миграции эндотелиальных клеток. A/Только FGF2 и FGF4 стимулируют миграцию HUVEC, указывая на то, что FGFR1 управляет пролиферацией этих клеток. B/SSR ингибирует индуцируемую FGF2 хемотаксическую миграцию HUVEC в соответствии со своим антагонистическим действием на FGFR1.

Фиг.7: Исследование активности SSR на эндотелиальных клетках в отношении ангиогенеза in vitro. A/Только FGF2 и FGF19 стимулируют ангиогенез HUVEC, указывая на то, что FGFR4 контролирует данную стадию дифференцировки этих клеток. B/SSR ингибирует индуцируемый FGF2 ангиогенез HUVEC in vitro в соответствии со своим антагонистическим действием на FGFR4.

Фиг.8: Исследование активности SSR в отношении пролиферации и миграции PANC02. Клетки PANC02 пролиферируют (A) или мигрируют (B) при стимуляции FGF7 с VEGF или без него, предполагая зависимость системы от FGFR2IIIb. SSR ингибирует индуцируемую FGF7 пролиферацию PANC02 и индуцируемую FGF7+VEGF миграцию клеток, что демонстрирует его способность ингибировать FGFR2IIIb.

Фиг.9: Исследование активности SSR в отношении пролиферации клеток B9 миеломы. A/FGF1 индуцирует пролиферацию клеток B9 миеломы через FGFR3, а SSR ингибирует эту стимуляцию, указывая на то, что SSR способен блокировать FGFR3. B/Тем не менее, SSR не способен ингибировать пролиферацию клеток B9, трансфецированных аутоактивированным мутантным FGFR3 (с конститутивно фосфорилированным киназным доменом). Эти результаты демонстрируют внеклеточное действие SSR.

Фиг.10: Тест на миграцию HUVEC, в котором SSR не способен существенно ингибировать клеточную миграцию, индуцируемую различными факторами роста, такими как IGF, PDGF-BB, EGF или PIGF. SSR является специфичным для FGFR и блокирует только индуцируемую FGF миграцию HUVEC.

Фиг.11: Исследования с помощью ЯМР, демонстрирующие связывание SSR с доменом III FGFR. A/1D- и STD-NMR анализ связывания SSR с внеклеточным доменом FGFR1. Насыщения не наблюдается с контрольным TNFR1α. B/1D-NMR анализ связывания SSR с различными доменами FGFR1 показывает, что спектры, получаемые с полноразмерным FGFR1 и с доменом II FGFR1 сходны, что предполагает сайт взаимодействия в домене III. C/Изотермическая калориметрия титрования, показывающая способность SSR связываться с FGFR2 и FGFR3. (D) Внеклеточный домен.

Фиг.12: Исследования с помощью ЯМР (A, C) и ITC (B), демонстрирующие, что SSR не способен взаимодействовать с FGF1 (A, B) и FGF2 (C). D/Не наблюдается вмешательства в связывание SSR с FGFR1 после добавления октасульфата сахарозы (SOS), миметиков гепарина, подтверждая, что SSR не взаимодействует с гепаринсвязывающим сайтом FGFR1.

Фиг.13: Моделирование in silico и мутагенез идентифицируют аллостерический сайт связывания для SSR в области аминокислоты Y328. Эксперименты ITC с внеклеточным доменом WT FGFR2 (A) демонстрируют взаимодействие между SSR и FGFR2. Это связывание не происходит, когда измерения выполняются с мутантом Y328D (B), это подтверждает, что мутация Y328D вызывает потерю чувствительности FGFR2 к связыванию SSR.

Фиг.14: Измерения с помощью инфракрасной спектроскопии на основе преобразования Фурье (FTIR) очищенного (A) FGFRδ23-WT, (B) FGFR2-δ23-His, (C) FGFR2-δ23-Tyr, (D) FGFR2-δ23-H/T (двойного мутанта H295L/Y328D) без или с 100 мкМ SSR (черная и серая линии, соответственно) идентифицировали конформационное изменение как в WT, так и в His295L мутанте, тогда как мутация Y328D вызывает потерю чувствительности FGFR2 к этому изменению.

Фиг.15: Анализ иммуноблоттингом активированной Erk1/2 после стимуляции FGF2 (05, нг/мл в течение 5 мин) в клетках HEK293, стабильно трансфецированных полноразмерным FGFR2-WT или -Y328D. Определенная денситометрией величина IC50 (среднее + ст.ош.ср.; три независимых эксперимента) показала, что мутантный рецептор FGFR2-Y328D (B) приблизительно в 5 раз менее чувствителен к ингибированию SSR по сравнению с FGFR2-WT (A).

Фиг.16: A/Анализ иммуноблоттингом действия SSR по сравнению с ингибитором SU5402 тирозинкиназы FGFR на клетки HEK, трансфецированные FGFR2, стимулированные FGF2. SU5402 ингибирует фосфорилирование PLCγ, FRS2 и Erk1/2, тогда как SSR не ингибирует путь PLCγ, что указывает на избирательный антагонизм SSR (B).

Фиг.17: Анализ иммуноблоттингом (A) действия SSR на индуцируемое FGF2 фосфорилирование AKT в HUVEC с соответствующей диаграммой количественной оценки (B). C/Этот эффект также количественно оценен с помощью ELISA на клетках, с антителами направленными против фосфо-AKT (Ser473). D/Этот эффект не зависит от отсутствия способности SSR конкурировать с FGF за связывание с FGFR.

Фиг.18: Идентификация предполагаемых фрустрированных зон в рецепторе VEGF-R2 с использованием компьютерной программы AGADIR и мутационного анализа. (A) Идентифицированы некоторые области, которые склонны подвергаться структурным изменениям (например, переходам из β-складки в α-спираль). (B) Два лизина (K609 и K648) выбраны для мутации в аспартат из-за их непосредственной близости к трансмембранному домену и из-за их наиболее отрицательного вклада в свойство образовывать спираль после мутации.

Фиг.19: Идентификация предполагаемых фрустрированных зон в рецепторе PDGF-Rβ с использованием компьютерной программы AGADIR и мутационного анализа. Мутации лизин387 в аспартат и лейцин383 в аспартат, очевидно, характеризуются наибольшим отрицательным вкладом в свойство образовывать спираль.

Фиг.20: Схематическое представление активации сигнальных путей с рецепторов VEGF-R2 и PDGF-Rβ через Erk1/2 и PLCγ. (A) Сигнализация через VEGFR2 после стимуляции VEGF и (B) сигнализация через PDGF-Rβ после стимуляции PDGF.

Фиг.21: Определение фосфорилирования Erk1/2 в клетках HEK293, которые гиперэкспрессируют дикий тип или мутантные формы рецепторов VEGF-R2 или PDGF-Rβ c использованием иммуноблоттинга или теста SureFire. (A) Клетки HEK293 стабильно трансфецировали мышиным VEGF-R2 дикого типа и мутированным в K609D или K648D. После выращивания на минимальной среде и стимуляции без (0) или с (+) мышиным VEGF определяли фосфорилирование с помощью иммуноблоттинга. (B) Схематическое представление теста SureFire для определения фосфорилирования Erk1/2 (левая схема) или PLCγ (правая схема) в белковых экстрактах. (C) Данные AlphaScreen SureFire для суммарной или фосфорилированной Erk1/2 в клетках HEK293, трансфецированных PDGFRβ, после стимуляции 10% FBS, 1 или 50 нг/мл PDGF-BB или без стимуляции в качестве контроля (0).

ПРИМЕРЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ К ПРИМЕРАМ

Определение связывания с помощью STD-NMR

Внеклеточный домен (ECD; аминокислоты: 39-358) гена FGFR1 человека (P11362) амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали в вектор pETTEV E. coli (с N-концевой His-меткой, за которой следует сайт расщепления протеазой TEV) с использованием сайтов рестрикции Ndel и BamHI. Для продукции белка полученную плазмиду (pET FGFR1 D1D2D3) трансформировали в BL21(DE3) (Novagene) E. coli. Клетки выращивали при 37°С до достижения ОП₆₀₀ равной 0,6, и продукцию рекомбинантного белка индуцировали добавлением 1 мМ IPTG (изопропил-b-D-тиогалактопиранозида). После индукции в течение 4 часов клетки собирали и хранили при -80°С до использования. Осадок клеток (1 л культуры) размораживали и ресуспендировали в 50 мл буфера 1 (20 мМ трис/HCl, pH 7,5, 200 мМ NaCl), содержащего лизоцим (2 мг) и 40 Е бензоназы (Merck). Клетки разрушали обработкой ультразвуком, тельца включения (IB) осаждали центрифугированием (15000 g, 20 мин, 4°C), и полученный осадок промывали дважды буфером 1. Осадок IB растворяли в 20 мл денатурирующего буфера (6 М гуанидин-HCl, 20 мМ трис/HCl, pH 8,0, 200 мМ NaCl) в течение 40 минут при комнатной температуре. Нерастворимые остатки клеток удаляли центрифугированием (30000 g, 30 мин) и супернатант наносили на колонку Ni-NTA (Qiagen), предварительно уравновешенную буфером А, следуя рекомендациям производителя. ECD FGFR1 элюировали с колонки с использованием денатурирующего буфера с 500 мМ имидазолом. Фракции, содержащие ECD, объединяли и осуществляли повторную укладку с помощью моментального разведения солюбилизированного белка (фактор разведения 1:30) в 50 трис/HCl, pH 8,0, 250 мМ NaCl, 0,5 М L-аргинина, 2 мМ ЭДТА, 0,02% азида, с последующей инкубацией при осторожном перемешивании в течение 24 час при 4°С. Смесь с повторной укладкой центрифугировали при 30000 g в течение 20 мин, концентрировали с помощью мембраны YM10 (конечная концентрация белка 1 мг/мл) в ячейке с перемешиванием Amicon, диализовали против 25 мМ трис/HCl, pH 8,0, 2 мМ ЭДТА, 0,02% азида, наносили на колонку HiTrap Heparin HP 5 мл (GE Healthcare) и элюировали линейным градиентом от 0 до 2 М NaCl. Конечная очистка ECD FGFR1 достигалась хроматографией, исключающей по размеру, с использованием колонки Hi Load 26/60 75 pG (GE Healthcare), уравновешенной 25 мМ трис/HCl, pH 8,0, 200 мМ NaCl, 25 мМ L-аргинина, 2 мМ ЭДТА, 0,02% азида. FGF1 (аминокислоты: 16-155) и FGF2 (аминокислоты 9-155) и TNF-R1α экспрессировали и очищали. Структурная целостность ECD FGFR1 была продемонстрирована по его способности связываться с колонкой гепарина (смотри выше) и по образованию комплекса с FGF1. Образование комплекса анализировали с помощью хроматографии, исключающей по размеру, и последующего анализа на SDS-PAGE.

Все эксперименты по STD- и 1D-NMR осуществляли на BRUKER трехканальном DRX600 и на BRUKER четырехканальном DRX800 спектрометре при стандартной температуре 24,9°C и нормировали на внутренний стандарт 3-триметил-2,2,3,3-тетрадейтеропропионат-натриевую соль (TSP). Обычно образцы для ЯМР содержали 0,5 мл белка (20-300 мМ) в 25 мМ трис/HCl, pH 8,0, 200 мМ NaCl, 25 мМ L-аргинина, 2 мМ ЭДТА, 0,02% азида (в 95% H₂O/5% D₂O). Для белкового лиганда измерения спектров 1D STD NMR регистрировали с 1 мМ лиганда SSR128129E (100 мМ исходного раствора ДМСО) и 40 мМ белка со слабым 2s RF облучением отдельных резонансных метильных групп белка. Подавление воды осуществляли с использованием стандартной Bruker WATERGATE 3-9-19 последовательности. Данные ЯМР обрабатывали с использованием программы Bruker программного обеспечения xWin для ЯМР.

Измерения с помощью изотермической калориметрии титрования (ITC)

Все калориметрические эксперименты осуществляли при 30°С с помощью калориметра титрования VP-ITC (MicroCal Inc., Northampton, MA), как описано ранее ⁴⁵. Титрования включали добавление 10 мкл аликвот 1,25 мМ SSR через вращающийся с перемешиванием шприц к ячейке с раствором, содержащим 1,407 мл 10-20 мкМ взаимодействующего белка (т.е. FGFR2^∂123, FGFR2^∂23 и их описанных мутантов и субдоменов, FGFR3^∂123, FGF1, FGF2 и фоллистатина (в качестве отрицательного контроля) с 4 мин интервалами. Поддерживалась постоянная скорость перемешивания 300 об/мин, и данные приводили в соответствие со стандартной моделью одного невзаимодействующего сайта с фиксированным n в виде 1,0, предоставленной MicroCal. Все измерения осуществлялись в 10 мМ HEPES pH 7,2, 150 мМ NaCl, и белки очищали, как описано ранее (Pellegrini et al., 2000). Мутагенез осуществляли, используя «набор для сайт-направленного мутагенеза» (Stratagene).

Измерения с помощью инфракрасной спектроскопии на основе преобразования Фурье

Измерения с помощью инфракрасной спектроскопии на основе преобразования Фурье осуществляли с использованием спектрометра Bruker Tensor 37 FT-IR, оснащенного проточной кюветой AquaSpec. Камеру для образцов термостатировали до 25°С, 100 спектров усредняли для хорошего отношения сигнала к шуму. Белки очищали, как описано выше. Сразу после гель-фильтрации белки диализовали в течение ночи в том же приготовленном буфере (10 мМ Hepes pH 7,2, 150 мМ NaCl) в присутствии или в отсутствие SSR. Образцы буфера для диализа использовали для вычитания фонового сигнала. Анализ осуществляли с использованием пакета компьютерных программ OPUS, предлагаемых Bruker. Интерпретацию результатов осуществляли, как описано {Barth, 2002 #60}.

Трансфекция HEK293 и исследования фосфорилирования Erk1/2,

PLCγ и FRS2

Клетки HEK293 были временно или стабильно трансфецированы (с использованием FuGENE 6, Roche) hFGFR2IIIca или hFGFR2IIIca-Y328D, клонированными в pcDNA3 (Invitrogen). Стабильно трансфецированные клетки выращивали в среде, содержащей G418 (400 мкг/мл). Перед стимуляцией клеткам давали голодать в DMEM в течение ночи (0% сыворотки), и их преинкубировали с SSR128128E в требуемой концентрации. Клетки затем стимулировали FGF2 (концентрация между 0,5-10 нг/мл) в течение 5 мин при 37°С с или без SSR или SU5402 в концентрации 1 мкМ. После промывания в ледяном забуференном фосфатом физиологическом растворе, содержащем ингибиторы фосфатазы (Roche), клетки лизировали в буфере RIPA (трис 30 мМ HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% тритон-X, 0,5% масс./об. дезоксихолат, содержащем ингибиторы фосфатаз и протеаз, как описано производителем (Roche)). Лизаты клеток центрифугировали при 12000 g в течение 10 мин, и супернатанты собирали. Белки разделяли на полиакриламидных гелях Novex (Invitrogen, Carlsbad, CA) и затем переносили на нитроцеллюлозные мембраны Hybond ECL (Amersham Pharmacia). После инкубации с 5% порошком нежирного молока в ЗФР мембраны инкубировали в течение ночи при 4°С со следующими антителами: фосфо-ERK1/2 (CST:9101), фосфо-FRS2 (CST:3861), фосфо-PLCγ (CST:2821) и FGFR2 (F0300, Sigma).

Пролиферация клеток BaF/3, трансфецированных FGFR:

Конструкты клеток BaF/3, используемые в этом эксперименте, подробно описаны в заявке WO2007/080325.

Количественная ПЦР в реальном времени

Суммарную РНК выделяли из HUVEC с использованием реагента тризола (Invitrogen, USA) и набора RNeasy (Qiagen, Germany), из которой затем получали кДНК с использованием набора Quantitect Reverse Transcription (Qiagen, Germany). Наборы праймеров и меченные красителем зонды FAM™ TaqMan® MGB (Eurogentec, Belgium) конструировали для человеческих FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4 и TBP, и реакции ПЦР осуществляли в системе быстрой ПЦР в реальном времени 7500 (ABI, Germany). Каждый образец анализировали в трех параллельных вместе с конкретными стандартами и без матричных контролей. Амплификации осуществляли при использ