Варианты плазминогена и плазмина

Варианты плазминогена и плазмина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к вариантам плазминогена и плазмина, содержащим одну или несколько точечных мутаций в каталитическом домене, которые снижают или предотвращают аутокаталитическую потерю протеазной активности плазмина. Также раскрыты композиции, применения и способы применения указанных вариантов плазминогена и плазмина.

Предпосылки настоящего изобретения

Активация зимогена плазминогена приводит к образованию фибринолитически/тромболитически активной сериновой протеиназы - плазмина. Активация эндогенного плазминогена может быть запущена или усилена введением активатора плазминогена, такого как урокиназа, стрептокиназа, стафилокиназа или tPA, или любого их варианта. При активации белок-плазминоген протеолитически расщепляется до тяжелой цепи, содержащей 5 доменов “двойная петля”, и легкой цепи, содержащей каталитический домен. Обе цепи удерживаются вместе посредством 2 дисульфидных связей. После активации в результате аутолитического расщепления происходит удаление N-концевого сегмента из тяжелой цепи (78 аминокислот плазмина человека; 77 аминокислот бычьего плазмина), и тяжелая цепь бычьего плазмина может быть дополнительно аутокаталитически расщеплена между доменами “двойная петля” 3 и 4, таким образом давая в результате бычий мидиплазмин (Christensen et al. 1995, Biochem J 305, 97-102). Активация плазминогена до плазмина, запущенная с помощью расщепления пептидной связи R561-V562 в плазминогене человека, вызывает большое конформационное изменение в легкой цепи, причем указанное изменение приводит к стимуляции или активации каталитической триады внутри указанной легкой цепи. Бактериальные активаторы плазминогена, такие как стрептокиназа и стафилокиназа, формируют комплекс с плазминогеном, и без расщепления пептидной связи R561-V562 плазминогена каталитический сайт плазминогена активируется посредством конформационных изменений при образовании комплекса активатор-плазминоген (механизмы активации плазминогена подытожены, например, в разделе Введение Terzyan et al. 2004; Proteins 56: 277-284).

Поскольку активаторы плазминогена действуют как непрямые тромболитические средства, то альтернативно было предложено применение плазмина самого по себе в качестве непосредственного фибринолитического/тромболитического средства. Такое непосредственное применение, однако, затрудняется из-за того факта, что плазмин, подобно многим протеазам, подвергается аутокаталитическому протеолитическому распаду, который характеризуется кинетикой уравнения реакции второго порядка при условии ингибирования продукта (Jespersen et al. 1986, Thrombosis Research 41, 395-404).

В начале 1960-х было установлено, что плазмин может быть стабилизирован в кислом pH, или, альтернативно, в нейтральном pH, при условии присутствия аминокислоты, такой как лизин. Тем не менее, сообщалось, что имело место аутолитическое расщепление после Lys104, Arg189 и Lys622 (нумерация относительно Lys-плазмина) даже если плазмин хранили при pH 3,8 (WO 01/36608). При хранении плазмина при еще более низком pH, равном 2,2, неаутолитическое кислотное расщепление происходит между Asp-Pro (D-P) в положениях Asp62, Asp154 и Asp346 (WO 01/36608). Это иллюстрирует, что pH может быть понижен до точки, где больше не возникает очевидный аутокаталитический распад, но в которой кислотный гидролиз становится фактором дестабилизации. Отсутствует информация в WO 01/36608 в отношении того, что пептидные связи в плазмине являются чувствительными к (аутокаталитическому) гидролизу при нейтральном pH. Известные стабилизаторы плазмина включают глицерин, достаточно высокую ионную силу, фибриноген и ε-аминокапроновую кислоту (EACA), как раскрывается Jespersen et al. (1986, Thromb Res 41, 395-404). Лизин и лизиновые производные (такие как EACA и транексамовая кислота) и p-аминометилбензойная кислота (PAMBA) являются некоторыми дополнительными известными стабилизаторами (Uehsima et al. 1996, Clin Chim Acta 245, 7-18; Verstraete 1985, Drugs 29, 236-261). В патенте США №4462980 сообщалось об образовании плазминовых агрегатов, которые вносили свой вклад в распад плазмина, несмотря на хранение в кислотных условиях. Решение этой проблемы было представлено в патенте США №4462980 посредством добавления полигидроксидного соединения. Другие пути стабилизации плазмина включают добавление олигопептидных соединений (например, патент США №5879923). Альтернативно, каталитический сайт плазмина может быть обратимо блокирован посредством дериватизации, например, ацилирования (европейский патент №EP 0009879). В качестве средства стабилизации фермента также было предложено пегилирование плазмина (WO 93/15189).

Описан ряд вариантов плазмина, отличных от процессированных форм плазмина, и он включает химерный микроплазмин (WO 2004/045558) и варианты с точечной мутацией в сайте расщепления двух цепей (патент США №5087572) или в аминокислоте каталитической триады (Mhashilkar et al. 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90, 5374-5377; Wang et al., 2001, J Mol Biol 295, 903-914). Wang et al. (1995, Protein Science 4, 1758-1767 and 1768-1779) сообщали о широком ряде мутантов микроплазминогена по аминокислотным положениям 545, 548, 550, 555, 556, 558, 560-564, 585, 740 и 788. Двойной мутант, где цистеины в аминокислотных положениях 558 и 566 были заменены на серины, описан Linde et al. (1998, Eur J Biochem 251, 472-479). Takeda-Shitaka et al. (1999, Chem Pharm Bull 47, 322-328) приводят вариант плазмина с уменьшенной активностью, где изменение включает замену аланина в аминокислотном положении 601 на треонин. Все приведенные выше аминокислотные положения считаются относительно Glu-плазминогена, начиная с Glu в аминокислотном положении 1. Нерасщепляемый вариант плазминогена (расщепление между тяжелой и легкой цепью нарушено) описан в WO 91/08297. Dawson et al. (1994, Biochemistry 33, 12042-12047) описывают уменьшенную аффинность для стрептокиназы варианта Glu-плазминогена с Glu вместо Arg в положении 719 (R719E). Jespers et al. (1998, Biochemistry 37, 6380-6386) получили при сканировании по Ala ряд полученных с помощью фагового дисплея моносайтовых мутантов микроплазминогена H569A, R610A, K615A, D660A, Y672A, R712A, R719A, T782A, R789A и обнаружили, что аргинин в положении 719 является ключевым для взаимодействия со стафилокиназой; мутант D660A не был дополнительно охарактеризован из-за очень низкой экспрессии; только мутант R719A был дополнительно получен в растворимой форме. Ни один из мутантов не показал существенного изменения в протеолитической активности (субстрат S-2403). Jespers et al. (1998) также включили в их анализ мутанта с активным сайтом S741A; кристаллическая структура этого мутанта раскрыта в Wang et al. (2000, J Mol Biol 295, 903-914). В дальнейших попытках обнаружить сайты взаимодействия стрептокиназа/плазминоген, Terzyan et al. (2004, Proteins 56, 277-284) сообщали о ряде мутантов микроплазминогена (K698M, D740N, S741A) в уже мутированном окружении (R561A), последнее подавляло протеолитическую активацию плазминогена и, таким образом, подавляло образование активного микроплазмина (что будет затруднять изучение механизма контакт-активации комплекса стрептокиназа-микроплазминоген). Terzyan et al. (2004) дополнительно упоминают “произвольный” тройной мутант R561A/H569Y/K698M, функционально очевидно не отличающийся от двойного мутанта R561A/K698M. Wang et al. (2000, Eur J Biochem 267, 3994-4001) при изучении взаимодействия стрептокиназа/плазмин(плазминоген) получили набор мутантов микроплазминогена (аминокислоты 530-791 Glu-плазминогена) в Cys536Ala и Cys541Ser окружении. Эти мутанты включают мутацию R561A, которая описана выше (Terzyan et al. (2004)), а также двойные мутанты R561A/K698G, R561A/K698A и R561A/K698Q. В такое же C536A/C541S окружении были введены также отдельные мутации K698G и K698A, из которых K698G не была в дальнейшем охарактеризована из-за трудностей с очисткой. Описанные выше исследования были направлены на достижение лучшего понимания характеристик молекулы плазминогена/плазмина и не сообщают о какой-либо клинической пользе или преимуществе или предполагаемых клинических преимуществах мутантов плазминогена/плазмина. Peisach et al. (1999, Biochemistry 38, 11180-11188) добились успеха в определении кристаллической структуры микроплазминогена, содержащего мутации M585Q, V673M и M788L.

Nguyen и Chrambach (1981, Preparative Biochem 11, 159-172) сообщили о присутствии “минорного и неидентифицированного белкового компонента” 10,0 кДа, исходя из результатов SDS-PAGE в восстанавливающих условиях неочищенного коммерческого препарата урокиназа-активированный плазмин (гомолизин). Отличия в аутолизе плазмина человека в зависимости от pH были описаны детально Shi и Wu (1988, Thrombosis Research 51, 355-364). Ohyama et al. (2004, Eur J Biochem 271, 809-820) предложили применение нелизиновых аналоговых модуляторов плазминогена при лечении рака благодаря усилению аутопротеолиза плазмина такими соединениями, которые приводят к усиленному образованию ангиостатинов (в присутствии урокиназного активатора плазминогена). В таблице 3 в Ohyama et al. (2004) приведено по меньшей мере 15 сайтов расщепления в плазмине, подвергнутом действию усиливающих аутопротеолиз соединений. При обсуждении их наблюдений в свете ранее проведенных исследований можно предположить, что усиливающие аутопротеолиз соединения являются более или менее избирательно усиливающими протеолиз B/легкой цепи, поскольку при отсутствии усиливающих аутопротеолиз соединений был обнаружен минимальный распад как A/тяжелой, так и B-цепи.

Ясно, что ни один из описанных выше способов/вариантов не решал проблему получения плазмина, стабилизированного на молекулярном уровне. Получение варианта плазмина (или соответствующего варианта плазминогена, из которого может быть получен плазмин) с каталитическим доменом, по сути устойчивым к аутокаталитическому распаду, будет значительным шагом вперед по направлению к эффективному и безопасному длительному хранению, а также по направлению к эффективному и безопасному терапевтическому применению плазмина, например при тромболитической терапии или при индукции заднего отслоения стекловидного тела или разжижения стекловидного тела глаза.

Краткое описание настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к выделенным вариантам плазминогена и полученным из него плазминам, или к выделенным вариантам плазмина, или к протеолитически активным или обратимо неактивным производным любого из указанных плазминов, которые отличаются тем, что:

(i) они содержат в своем каталитическом домене лизин или аргинин в положении Р и мутацию по меньшей мере одной аминокислоты в положении [P+/-n], где n равно 1, 2, 3, 4 или 5, и где аминокислота в положении [P+/-n] не является лизином и не является аргинином; и

(ii) мутация из (i) уменьшает степень аутопротеолитического распада указанного варианта плазмина по сравнению со степенью аутопротеолитического распада плазмина дикого типа, которая, например, определена с помощью хромогенного анализа или анализа биологической активности к субстрату.

Настоящее изобретение дополнительно относится к описанным выше вариантам плазминогена, вариантам плазмина или производным плазмина, содержащим в своем каталитическом домене мутацию по меньшей мере двух внутренних аминокислот:

- в положениях [P+/-n] и [P+/-n']; где n и n' равны 1, 2, 3, 4 или 5; где аминокислоты в положениях [P+/-n] и [P+/-n'] не являются лизином и не являются аргинином; и где n и n' отличаются друг от друга, если оба либо прибавлены, либо вычтены из P; или

- в положениях [P+/-n] и [P'+/-n]; где P' является большей величиной из P и P'; где аминокислота в положении P' является лизином или аргинином; где n равно 1, 2, 3, 4 или 5; где аминокислота в положении [P'+/-n] не является лизином и не является аргинином; и где, при наличии, исключены положения, перекрывающиеся между [P+n] и [P'-n];

и где мутация указанных по меньшей мере двух внутренних аминокислот уменьшает степень аутопротеолитического распада указанного варианта плазмина по сравнению со степенью аутопротеолитического распада плазмина дикого типа, которая, например, может быть определена с помощью хромогенного анализа или анализа биологической активности к субстрату.

Любой из вышеуказанных вариантов плазминогена, вариантов плазмина или производных плазмина могут дополнительно содержать мутацию любой одной или нескольких аминокислот лизин или аргинин каталитического домена, включая аминокислоты лизин или аргинин в любом из положений P и P', в аминокислоту, не являющуюся лизином, аргинином.

В любом из вышеуказанных плазминогенов, плазминов или производных плазмина указанная внутренняя аминокислота в положении P или P' может быть выбрана, в частности, из:

(i) лизина в положении 137 каталитического домена плазмина человека или соответствующего лизина или аргинина каталитического домена плазмина, отличного от плазмина человека;

(ii) лизина в положении 147 каталитического домена плазмина человека или соответствующего лизина или аргинина каталитического домена плазмина, отличного от плазмина человека; или

(iii) аргинина в положении 158 каталитического домена плазмина человека или соответствующего аргинина или лизина каталитического домена плазмина, отличного от плазмина человека;

где указанный каталитический домен плазмина человека начинается с аминокислоты валин в положении 1, которая является такой же аминокислотой валин, что встречается в положении 562 Glu-плазминогена человека.

В частности, у плазминогенов, плазминов или производных плазмина по настоящему изобретению указанная аминокислота в положении [P+/-n] является аминокислотой глутамат в положении 138 каталитического домена плазмина человека или соответствующего аминокислотного остатка каталитического домена плазмина, отличного от плазмина человека.

Любой из вариантов плазминогена, вариантов плазмина или производных плазмина по настоящему изобретению может дополнительно отличаться тем, что его константа аутолиза составляет не более 95% от константы аутолиза плазмина дикого типа. Данный признак также может служить в качестве определения сниженного аутопротеолитического распада описанного выше варианта плазминогена или варианта плазмина по сравнению с аутопротеолитическим распадом соответствующего плазминогена или плазмина дикого типа.

Любой из вариантов плазминогена, вариантов плазмина или производных плазмина по настоящему изобретению может дополнительно отличаться тем, что каталитическая константа k_кат находится в диапазоне 10% - 200% от k_кат плазмина дикого типа.

Любой из вариантов плазминогена, вариантов плазмина или производных плазмина по настоящему изобретению может дополнительно отличаться тем, что его константа аутолиза составляет не более 95% от константы аутолиза плазмина дикого типа, и его каталитическая константа k_кат находится в диапазоне 10% - 200% от k_кат плазмина дикого типа.

Без какого-либо ограничения любой из перечисленных выше вариантов плазминогена, вариантов плазмина или производных плазмина по настоящему изобретению может быть одним из следующего: Glu-плазминоген или Glu-плазмин, Lys-плазминоген или Lys-плазмин, мидиплазминоген или мидиплазмин, миниплазминоген или миниплазмин, микроплазминоген или микроплазмин, дельтаплазминоген или дельтаплазмин.

Настоящее изобретение дополнительно относится к выделенным вариантам плазминогена, вариантам плазмина или производным плазмина, описанным выше, или комбинации любых из них для применения в качестве лекарственного препарата.

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим выделенный вариант плазминогена, вариант плазмина или производное плазмина, которые описаны выше, или комбинацию любых из них и по меньшей мере одно из следующего: фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или вспомогательное средство. Такая композиция может необязательно дополнительно содержать по меньшей мере одно из следующего: антикоагулянт, тромболитическое средство, противовоспалительное средство, противовирусное средство, антибактериальное средство, противогрибковое средство, антиангиогенное средство, антимитотическое средство, антигистамин или анестетик.

Настоящее изобретение также включает любое полезное применение выделенного варианта плазминогена, варианта плазмина или производного плазмина, которые описаны выше. Без какого-либо ограничения они включают следующее: индуцирование или стимулирование лизиса патологического отложения фибрина у субъекта, индуцирование заднего отслоения стекловидного тела глаза и/или индуцирование разжижения стекловидного тела глаза, облегчение хирургической витрэктомии глаза у субъекта, ферментное очищение раны поврежденной ткани субъекта, снижение циркулирующего фибриногена у субъекта, снижение уровней α2-антиплазмина у субъекта, снижение риска патологического отложения фибрина.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способам скрининга в отношении аутопротеолитически стабильных вариантов плазмина, причем указанные способы включают этапы следующего:

(i) мутирование аминокислоты в положении [P+/-n], где аминокислота в положении P является аргинином или лизином, и где n равно 1, 2, 3, 4 или 5;

(ii) определение аутопротеолитической стабильности мутанта, полученного из (i), например, определенной посредством хромогенного анализа или анализа биологической активности к субстрату;

(iii) сравнение аутопротеолитической стабильности мутанта, определенного в (ii), с аутопротеолитической стабильностью плазмина дикого типа; и

(iv) отбор из (iii) мутанта, который является аутопротеолитически более стабильным, чем плазмин дикого типа, в качестве аутопротеолитически стабильного варианта.

В вышеприведенном способе аминокислота в положении [P+/-n] предпочтительно не является лизином и не является аргинином.

В альтернативном способе скрининга в отношении аутопротеолитически стабильных вариантов плазмина указанный способ включает следующие этапы:

(i) мутирование аминокислоты глутамат в положении 138 каталитического домена плазмина человека или соответствующего аминокислотного остатка плазмина, отличного от плазмина человека, в аминокислоту, отличающуюся от природной аминокислоты,

(ii) определение аутопротеолитической стабильности мутанта, полученного из (i), например, определенной посредством хромогенного анализа или анализа биологической активности к субстрату, и

(iii) отбор из (ii) мутанта, который является аутопротеолитически стабильным, в качестве аутопротеолитически стабильного варианта плазмина;

где указанный каталитический домен плазмина человека начинается с аминокислоты валин в положении 1, которая является такой же аминокислотой валин, что встречается в положении 562 Glu-плазминогена человека.

Любой из перечисленных выше способов скрининга может необязательно дополнительно включать этап, на котором определяют протеолитическую активность аутопротеолитически стабильного варианта плазмина.

Настоящее изобретение дополнительно включает способы улучшения стабильности при длительном хранении плазмин-содержащей композиции, при этом указанные способы включают этап определения аутопротеолитически стабильного варианта плазмина, способного храниться в течение длительного периода времени без существенной потери протеолитической активности.

Настоящее изобретение дополнительно включает способы получения варианта плазминогена по настоящему изобретению, при этом указанные способы включают этапы следующего:

(i) введение нуклеиновой кислоты, кодирующей плазминоген по настоящему изобретению, в подходящую клетку-хозяина, способную экспрессировать указанный плазминоген;

(ii) выращивание клетки-хозяина, полученной в (i), в условиях и в течение времени, достаточных для экспрессии указанного плазминогена в указанной клетке-хозяине; и

(iii) сбор плазминогена, экспрессированного в (ii).

Такие способы могут необязательно дополнительно включать этап (iv), на котором очищают плазминоген, собранный в (iii).

Настоящее изобретение аналогично включает способы получения варианта плазмина по настоящему изобретению, при этом указанные способы включают этапы следующего:

(i) введение нуклеиновой кислоты, кодирующей плазминоген по настоящему изобретению, в подходящую клетку-хозяина, способную экспрессировать указанный плазминоген;

(ii) выращивание клетки-хозяина, полученной в (i), в условиях и в течение времени, достаточных для экспрессии указанного плазминогена в указанной клетке-хозяине;

(iii) сбор плазминогена, экспрессированного в (ii);

(iv) активация плазминогена из (iii) до плазмина.

Такие способы могут дополнительно необязательно включать этап, на котором плазминоген, собранный в (iii), очищают до активации в (iv). Дополнительно, в любом способе получения варианта плазмина по настоящему изобретению активный плазмин, полученный в (iv), можно необязательно очистить. Также, дополнительно активный вариант плазмина, полученный согласно способу настоящего изобретения, можно необязательно дериватизировать и/или обратимо инактивировать.

Любой из вариантов плазминогена, вариантов плазмина или производных плазмина по настоящему изобретению предпочтительно получают в свободной, или растворимой, форме, например, не прикрепленной к поверхности хозяина (как, например, у фагового дисплея).

Настоящее изобретение дополнительно относится к выделенным последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим вариант плазминогена или вариант плазмина по настоящему изобретению. Рекомбинантные векторы, содержащие такие нуклеиновые кислоты, также являются частью настоящего изобретения, равно как и клетки-хозяева, трансформированные такой нуклеиновой кислотой или рекомбинантным вектором.

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ НА ФИГУРАХ

ФИГУРА 1. Аминокислотная последовательность с двойной нумерацией аминокислотных положений Glu-плазминогена дикого типа человека (1-791) и каталитического домена плазмина (1-230, аминокислотная последовательность и нумерация выделены жирным шрифтом). Микроплазминоген, используемый для демонстрации настоящего изобретения, начинается в аминокислотном положении 543 (нумерация относительно Glu-плазминогена). Домены “двойная петля” (полученные из информации, включенной в GenBank по номером доступа AAA36451) заключены в рамки и их аминокислотные последовательности напечатаны с заменой букв нормального шрифта на курсив. Аминокислоты каталитической триады обведены кружком.

ФИГУРА 2. Выравнивание аминокислотной последовательности белков плазминогена млекопитающих, полученных из GenBank. Выравнивание последовательностей проводили с помощью программного обеспечения COBALT (Constraint-based Multiple Alignment Tool (инструмент для множественного выравнивания с комплексной увязкой параметров); Papadopolous & Aagarwala, Bioinformatics, 23:1073-79, 2007), доступного с сайта Национального центра биотехнологической информации (NCBI) с установками по умолчанию. ▼: обозначение начала Glu-плазминогена. Аминокислотная нумерация дана по отношению к плазминогену человека.

ФИГУРА 3. SDS-PAGE-анализ в восстанавливающих условиях иллюстративного варианта микроплазмина E138Q. Левая дорожка: маркер молекулярного веса с указанием молекулярного веса. Дорожка 1: микроплазминоген E138Q до активации. Дорожка 2: микроплазмин E138Q, тот же материал, что и в дорожке 1, но после активации. Гель красили с помощью красителя кумасси бриллиантового голубого.

Детальное описание изобретения

Настоящее изобретение основано на результатах исследования механизмов, лежащих в основе естественной аутоинактивации протеолитической активности плазмина при нейтральном pH, исследования, для которого изобретатель сфокусировался на микроплазмине, который состоит, главным образом, из каталитического домена плазмина. Пептидные связи, подверженные расщеплению плазмином, расположены на C-конце лизина или аргинина (Weinstein and Doolittle, 1972, Biochim Biophys Acta 258, 577-590). Приблизительно 10% (22 из 230) аминокислот каталитического домена плазмина (начиная с аминокислотного положения 562, валин, в Glu-плазминогене человека) представляют собой лизины или аргинины. Теоретически, все пептидные связи, С-концевые для этих лизинов и аргининов, независимо от структуры аминокислоты, С-концевой по отношению к указанному лизину или аргинину, в одной молекуле плазмина могут протеолитически расщепляться другой молекулой плазмина. Кроме того, теоретически, мутация любого одного или нескольких из этих лизинов или аргининов в аминокислоту, не являющуюся лизином, аргинином, сделает молекулу плазмина более устойчивой к аутопротеолитическому распаду. Было доказано, что данная теория верна, как описано в международной патентной заявке №PCT/EP2010/059902 (WO 2011/004011). Основанием для настоящего изобретения является неожиданное наблюдение, что мутация аминокислоты дикого типа рядом с лизином или аргинином в каталитическом домене плазмина в аминокислоту, отличную от аминокислоты дикого типа, и без необходимости мутирования указанного лизина или аргинина, также значительно повышает устойчивость полученного мутантного плазмина к аутопротеолитическому распаду.

Один аспект настоящего изобретения, таким образом, относится к молекулам плазмина и к молекулам плазминогена, в частности, к молекулам плазминогена, которые являются активируемыми/могут потенциально быть активированы до плазмина, содержащим в своем каталитическом домене одну или несколько мутаций аминокислот, так чтобы пептидные связи, восприимчивые к аутопротеолитическому распаду в плазмине или плазминогене дикого типа, были менее восприимчивы или не восприимчивы к аутопротеолитическому распаду в молекулах плазмина и плазминогена - объектах настоящего изобретения.

Иными словами, настоящее изобретение относится к выделенным вариантам плазминогена и полученным из него плазминам, или к выделенным вариантам плазмина, или к протеолитически активным или обратимо неактивным производным любого из указанных плазминов, которые отличаются тем, что:

(i) они содержат в своем каталитическом домене лизин или аргинин в положении Р и мутацию по меньшей мере одной аминокислоты в положении [P+n] или [P-n] (далее обозначаемой как [P+/-n]) в аминокислоту, отличную от аминокислоты дикого типа (или в аминокислоту, отличную от природной аминокислоты или встречающейся в природе аминокислоты), где n равно 1, 2, 3, 4 или 5, и где аминокислота в положении [P+/-n] не является лизином и не является аргинином; и

(ii) мутация (ее наличие) из (i) уменьшает степень (или чувствительность к, или восприимчивость к, или подверженность к) аутопротеолитического распада указанного варианта плазмина по сравнению со степенью аутопротеолитического распада плазмина дикого типа, которая, например, может быть определена с помощью, например, хромогенного анализа или анализа биологической активности к субстрату (см. далее).

Таким образом, целью настоящего изобретения является получение выделенных вариантов плазмина (таких, как полученные из вариантов плазминогена) или протеолитически активных или обратимо неактивных производных любого из указанных плазминов, которые отличаются тем, что указанные варианты плазмина или их производные обладают более высокой устойчивостью/более устойчивы к аутопротеолизу по сравнению с плазмином дикого типа. Некоторые аспекты, касающиеся определения аутопротеолитической устойчивости/восприимчивости, приведены далее.

Мутацию аминокислоты в заданном положении в "аминокислоту, отличную от аминокислоты дикого типа" или в "аминокислоту, отличную от природной аминокислоты" рассматривают как изменение аминокислоты в указанном заданном положении плазминогена или плазмина дикого типа в любую аминокислоту, отличную от природной аминокислоты или аминокислоты дикого типа, в таком указанном заданном положении такого указанного плазминогена или плазмина дикого типа. Некоторые аспекты, касающиеся выбора мутаций, приведены далее.

В частности, указанная внутренняя аминокислота в положении P представляет собой лизин или аргинин. Как указано в данном документе ниже (если не указано иное), каталитический домен плазмина (также называемого в литературе "легкой цепью" или "В-цепью") будет нумероваться по отношению к плазмину человека, который начинается с валина в положении P=1, что является таким же, как валин в положении 562 Glu-плазминогена человека (смотри Фигуру 1). В данном контексте могут упоминаться два различных аминокислотных положения в каталитическом домене плазмина, которые далее называют [P+/-n] (с лизином или аргинином в положении P) и [P'+/-n] (с лизином или аргинином в положении P'), соответственно. Для полной ясности, положения P, P', [P+/-n], [P'+/-n] и т. д. выражены целыми числами. Положение [P+n], [P'+n] и т. д. имеет целочисленное значение P, P' и т. д., увеличенное на величину n (при этом n равно 1, 2, 3, 4 или 5); положение [P-n], [P'-n] и т.д. имеет целочисленное значение P, P' и т. д., уменьшенное на величину n (при этом n равно 1, 2, 3, 4 или 5); положение [P+/-n], [P'+/-n] и т. д. имеет целочисленное значение P, P' и т. д., увеличенное (+) или уменьшенное (-) на величину n (при этом n равно 1, 2, 3, 4 или 5). Таким образом, например, если [P+1]=20, то P=19, а [P-2]=17; или, например, если P'=49, то [P'-5]=44, а [P'+3]=52. Два различных аминокислотных положения в каталитическом домене плазмина могут быть также обозначены как, например, [P+/-n] и [P+/-n'], где как n, так и n' имеют значение 1, 2, 3, 4 или 5; и где n и n' отличаются друг от друга в случае, когда как n, так и n' либо прибавлены (+), либо вычтены (-). В последнем случае, если Р равно, например, 19, если как n, так и n' нужно прибавить, при этом, например, n = 1 и n' = 3, то [P+n] = 20 и [P+n'] = 22. Или, если n необходимо вычесть, а n' необходимо прибавить, при этом, например, n = n' = 1, то [P-n] = 18 и [P+n'] = 20.

Настоящее изобретение дополнительно относится к описанным выше вариантам плазминогена, вариантам плазмина или производным плазмина, содержащим в своем каталитическом домене мутацию в аминокислоты, отличные от аминокислот дикого типа (или в аминокислоты, отличные от природных аминокислот или от встречающихся в природе аминокислот), по меньшей мере двух внутренних аминокислот:

- в положениях [P+/-n] и [P+/-n']; где n и n' равны 1, 2, 3, 4 или 5; где аминокислоты в положениях [P+/-n] и [P+/-n'] не являются лизином и не являются аргинином; и где n и n' отличаются друг от друга, если оба либо прибавлены, либо вычтены из P; или

- в положениях [P+/-n] и [P'+/-n]; где P' является большей величиной из P и P'; где аминокислота в положении P' является лизином или аргинином; где n равно 1, 2, 3, 4 или 5; где аминокислота в положении [P'+/-n] не является лизином и не является аргинином; и где, при наличии, исключены положения, перекрывающиеся между [P+n] и [P'-n];

и где мутация (ее наличие) указанных по меньшей мере двух внутренних аминокислот уменьшает степень аутопротеолитического распада указанного варианта плазмина по сравнению со степенью аутопротеолитического распада плазмина дикого типа, которая, например, может быть определена с помощью хромогенного анализа или анализа биологической активности к субстрату.

Альтернативно, вариант плазминогена, вариант плазмина или производное плазмина по настоящему изобретению, таким образом, может содержать в своем каталитическом домене мутацию любого лизина или аргинина в любом положении, в том числе в одном или нескольких из положений P, P', P” и т. д., в аминокислоту, не являющуюся лизином, аргинином.

Специалист в данной области сможет легко решить, в какую другую аминокислоту можно мутировать аминокислоту дикого типа. Такое решение может, но не обязательно должно, следовать критериям, таким как размер аминокислоты, заряд аминокислоты, полярность аминокислоты и/или индекс гидрофобности аминокислоты (смотри Таблицу 1). Более того, наличие кристаллической структуры плазминогена и микроплазмина (MMDB ID: 12717; PDB ID: 1DDJ; Wang et al., 2001, J Mol Biol 295, 903-914) значительно помогает определению мутантных аминокислот, так что полученная мутантная молекула плазмина или плазминогена сохраняет протеолитическую активность. Кроме того, можно ожидать, что мутация аминокислоты дикого типа в заданном положении [P+/-n] и, в некоторых случаях, дополнительно в одном или нескольких из заданных положений P, P', P” и т. д. в любую из аминокислот данной группы будет давать похожие результаты. На основе Таблицы 1 указанные данные группы могут быть обозначены следующим образом:

- гидрофобные алифатические аминокислоты: Met, Ile, Leu и Val;

- гидрофобные ароматические аминокислоты: Phe;

- гидрофильные кислые аминокислоты: Asp, Glu, Asn и Gln;

- гидрофильные основные аминокислоты: Arg, Lys и His;

- умеренно гидрофобные алифатические аминокислоты: Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Pro;

- умеренно гидрофобные ароматические аминокислоты: Tyr и Trp.

Из них, и с целью мутации, Cys и Pro могут быть менее предпочтительными аминокислотами-заменителями аминокислот дикого типа плазмина или плазминогена из-за создания возможной свободной тиольной группы с помощью Cys или из-за более обширного нарушения белковой структуры с помощью Pro. Другие аминокислотные замены включают мутацию аминокислоты дикого типа в положении [P+/-n] и, в некоторых случаях, дополнительно в одном или нескольких из положений P, P', P” и т. д. каталитического домена плазмина(плазминогена) в неприродную или неканоническую аминокислоту или в аналоги аминокислот, такие как норлейцин, норвалин, орнитин или цитруллин (более обширный перечень смотри, например, в Hendrickson et al. 2004, Annu Rev Biochem 73, 147-176).

Таблица 1. Характеристики аминокислот

Аминокислота	Полярность боковой цепи	Заряд боковой цепи(при pH 7)	Индекс гидрофобности
Аланин	Ala	A	неполярная	нейтральный	1,8
Аргинин	Arg	R	полярная	положительный	-4,5
Аспарагин	Asn	N	полярная	нейтральный	-3,5
Аспарагиновая кислота	Asp	D	полярная	отрицательный	-3,5
Цистеин	Cys	C	неполярная	нейтральный	2,5
Глутаминовая кислота	Glu	E	полярная	отрицательный	-3,5
Глутамин	Gln	Q	полярная	нейтральный	-3,5
Глицин	Gly	G	неполярная	нейтральный	-0,4
Гистидин	His	H	полярная	положительный	-3,2
Изолейцин	Ile	I	неполярная	нейтральный	4,5
Лейцин	Leu	L	неполярная	нейтральный	3,8
Лизин	Lys	K	полярная	положительный	-3,9
Метионин	Met	M	неполярная	нейтральный	1,9
Фенилаланин	Phe	F	неполярная	нейтральный	2,8
Пролин	Pro	P	неполярная	нейтральный	-1,6
Серин	Ser	S	полярная	нейтральный	-0,8
Треонин	Thr	T	полярная	нейтральный	-0,7
Триптофан	Trp	W	неполярная	нейтральный	-0,9
Тирозин	Tyr	Y	полярная	нейтральный	-1,3
Валин	Val	V	неполярная	нейтральный	4,2

При тестовых условиях (непринудительный аутопротеолитический распад при нейтральном рН), которые описаны в международной патентной заявке № PCT/EP2010/059902, в каталитическом домене плазмина происходит ограниченное количество аутопротеолитических расщеплений. Эти расщепления происходили по лизину 137 каталитического домена плазмина человека, по лизину 147 каталитического домена плазмина человека и по аргинину 158 каталитического домена плазмина человека. Это, однако, не исключает возможности существования других пептидных связей, которые поддаются аутопротеолитическому расщеплению.

Таким образом, в отношении вариантов плазминогена, вариантов плазмина или производных плазмина по настоящему изобретению указанная внутренняя аминокислота в положении Р или Р' может быть выбрана из следующего:

(i) лизин в положении 137 каталитического домена плазмина человека или соответствующий лизин или аргинин плазмина, отличного от плазмина человека;

(ii) лизин в положении 147 каталитического домена плазмина человека или соответствующий лизин или аргинин плазмина, отличного от плазмина человека; и/или

(iii) аргинин в положении 158 каталитического домена плазмина человека или соответствующий лизин или аргинин плазмина, отличного от плазмина человека;

где указанный каталитический домен плазмина человека начинается с аминокислоты валин в положении 1, которая является такой же аминокислотой валин, что встречается в положении 562 Glu-плазминогена человека. Для ясности нумерации аминокислот в плазминогене человека и каталитическом домене плазмина человека в данном д