Варианты плазминогена и плазмина

Варианты плазминогена и плазмина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к вариантам плазминогена и плазмина, содержащим одну или несколько точечных мутаций в каталитическом домене, которые снижают или предотвращают аутокаталитическую потерю протеазной активности плазмина. Также раскрыты композиции, применения и способы применения указанных вариантов плазминогена и плазмина.

Предпосылки изобретения

Активация зимогена плазминогена приводит к образованию фибринолитически/тромболитически активной сериновой протеиназы - плазмина. Активация эндогенного плазминогена может быть запущена или усилена введением активатора плазминогена, такого как урокиназа, стрептокиназа, стафилокиназа или tPA или любого их варианта. При активации белок плазминоген протеолитически расщепляется до тяжелой цепи, содержащей 5 доменов типа “двойная петля”, и легкой цепи, содержащей каталитический домен. Обе цепи скрепляются вместе посредством 2 дисульфидных связей. После активации в результате аутолитического расщепления удаляется N-концевой сегмент из тяжелой цепи (78 аминокислот плазмина человека; 77 аминокислот бычьего плазмина), и тяжелая цепь бычьего плазмина может быть дополнительно аутокаталитически расщеплена между доменами типа “двойная петля” 3 и 4, таким образом давая в результате бычий мидиплазмин (Christensen et al. 1995, Biochem J 305, 97-102). Активация плазминогена до плазмина, запущенная с помощью расщепления R561-V562 пептидной связи в плазминогене человека, вызывает большое конформационное изменение в легкой цепи, где указанное изменение приводит к стимуляции, или активации, каталитической триады внутри указанной легкой цепи. Бактериальные активаторы плазминогена, такие как стрептокиназа и стафилокиназа, формируют комплекс с плазминогеном, и без расщепления пептидной связи R561-V562 плазминогена каталитический сайт плазминогена активируется посредством конформационных изменений при образовании комплекса активатор-плазминоген (механизмы активации плазминогена подытожены, например, в разделе Введение Terzyan et al. 2004; Proteins 56: 277-284).

Поскольку активаторы плазминогена действуют как непрямые тромболитические средства, то альтернативно было предложено применение плазмина самого по себе в качестве непосредственного фибринолитического/тромболитического средства. Такое непосредственное применение, однако, затрудняется из-за того факта, что плазмин, подобно многим протеазам, подвергается аутокаталитическому протеолитическому распаду, который подчиняется кинетике второго порядка в отношении ингибирования продукта (Jespersen et al. 1986, Thrombosis Research 41, 395-404).

В начале 1960-х было установлено, что плазмин может быть стабилизирован в кислом pH или, альтернативно, в нейтральном pH при условии присутствия такой аминокислоты, как лизин. Тем не менее, сообщалось, что имело место аутолитическое расщепление после Lys104, Arg189 и Lys622 (нумерация относительно Lys-плазмина) даже если плазмин хранили при pH 3,8 (WO 01/36608). При хранении плазмина при еще более низком pH, равном 2,2, не-аутолитическое кислотное расщепление происходит между Asp-Pro (D-P) в положениях Asp62, Asp154 и Asp346 (WO 01/36608). Это иллюстрирует, что pH может быть понижен до точки, где больше не возникает очевидный аутокаталитический распад, но в которой фактором дестабилизации становится кислотный гидролиз. Отсутствует информация в WO 01/36608 в отношении того, что пептидные связи в плазмине являются чувствительными к (аутокаталитическому) гидролизу при нейтральном pH. Известные стабилизаторы плазмина включают глицерин, достаточно высокую ионную силу, фибриноген и ε-аминокапроновую кислоту (EACA), как раскрывается Jespersen et al. (1986, Thromb Res 41, 395-404). Лизин и лизиновые производные (такие как EACA и транексамовая кислота) и p-аминометилбензойная кислота (PAMBA) являются некоторыми дополнительными известными стабилизаторами (Uehsima et al. 1996, Clin Chim Acta 245, 7-18; Verstraete 1985, Drugs 29, 236-261). В патенте США №4462980 сообщалось об образовании плазминовых агрегатов, которые вносили свой вклад в распад плазмина, несмотря на хранение в кислотных условиях. Решение этой проблемы было представлено в патенте США №4462980 посредством добавления полигидроксидного соединения. Другие способы стабилизации плазмина включают добавление олигопептидных соединений (например, патент США №5879923). Альтернативно, каталитический сайт плазмина может быть обратимо блокирован посредством дериватизации, например, ацилирования (европейский патент № EP 0009879). В качестве способа стабилизации фермента также было предложено пегилирование плазмина (WO 93/15189).

Описан ряд вариантов плазмина, отличных от процессированных форм плазмина, и он включает химерный микроплазмин (WO 2004/045558) и варианты с точечной мутацией в сайте расщепления двух цепей (патент США №5087572) или в аминокислоте каталитической триады (Mhashilkar et al. 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90, 5374-5377; Wang et al., 2001, J Mol Biol 295, 903-914). Wang et al. (1995, Protein Science 4, 1758-1767 and 1768-1779) сообщали о широком ряде мутантов микроплазминогена по аминокислотным положениям 545, 548, 550, 555, 556, 558, 560-564, 585, 740 и 788. Двойной мутант, где серин в аминокислотных положениях 558 и 566 были заменены на цистеины, описан Linde et al. (1998, Eur J Biochem 251, 472-479). Takeda-Shitaka et al. (1999, Chem Pharm Bull 47, 322-328) приводят вариант плазмина с уменьшенной активностью, где изменение включает замену аланина в аминокислотном положении 601 на треонин. Все приведенные выше аминокислотные положения считают относительно Glu-плазминогена, начиная с Glu в аминокислотном положении 1. Нерасщепляемый вариант плазминогена (расщепление между тяжелой и легкой цепью нарушено) описан в WO 91/08297. Dawson et al. (1994, Biochemistry 33, 12042-12047) описывают уменьшенную аффинность в отношении стрептокиназы у варианта Glu-плазминогена с Glu вместо Arg в положении 719 (R719E). Jespers et al. (1998, Biochemistry 37, 6380-6386) получили при сканировании по Ala ряд полученных с помощью фагового дисплея моносайтовых мутантов микроплазминогена H569A, R610A, K615A, D660A, Y672A, R712A, R719A, T782A, R789A, и обнаружили, что аргинин в положении 719 является ключевым для взаимодействия со стафилокиназой; мутант D660A не был дополнительно охарактеризован из-за очень низкой экспрессии; только мутант R719A был дополнительно получен в растворимой форме. Ни у одного из мутантов не наблюдали существенного изменения протеолитической активности (субстрат S-2403). Jespers et al. (1998) также включили в свой анализ мутанта с активным сайтом S741A; кристаллическая структура этого мутанта раскрыта в Wang et al. (2000, J Mol Biol 295, 903-914). В дальнейших попытках обнаружить сайты взаимодействия стрептокиназа/плазминоген, Terzyan et al. (2004, Proteins 56, 277-284) сообщали о ряде мутантов микроплазминогена (K698M, D740N, S741A) в уже мутированном окружении (R561A), причем последний подавлял протеолитическую активацию плазминогена и, таким образом, подавлял образование активного микроплазмина (что будет затруднять изучение механизма контакта-активации комплекса стрептокиназа-микроплазминоген). Terzyan et al. (2004) дополнительно упоминают “произвольного” тройного мутанта R561A/H569Y/K698M, очевидно функционально не отличающегося от двойного мутанта R561A/K698M. Wang et al. (2000, Eur J Biochem 267, 3994-4001) при изучении взаимодействия стрептокиназы/плазмина (плазминогена) получили набор мутантов микроплазминогена (аминокислоты 530-791 Glu-плазминогена) в Cys536Ala и Cys541Ser окружении. Эти мутанты включают мутацию R561A, которая описана выше (Terzyan et al. (2004)), а также двойные мутации R561A/K698G, R561A/K698A и R561A/K698Q. В такое же C536A/C541S окружение также были введены отдельные мутации K698G и K698A, из которых K698G не была в дальнейшем охарактеризована из-за трудностей с очисткой. Описанные выше исследования были направлены на достижение лучшего понимания характеристик молекулы плазминогена/плазмина и не сообщали о какой-либо клинической пользе, или благоприятном эффекте, или предполагаемых клинических преимуществах мутантов плазминогена/плазмина. Peisach et al. (1999, Biochemistry 38, 11180-11188) добились успеха в определении кристаллической структуры микроплазминогена, содержащего мутации M585Q, V673M и M788L.

Nguyen и Chrambach (1981, Preparative Biochem 11, 159-172) сообщили о присутствии “минорного и неидентифицированного белкового компонента” размером 10,0 кДа, исходя из результатов SDS-PAGE в восстанавливающих условиях сырого коммерческого препарата активируемого урокиназой плазмина (Homolysin). Отличия в аутолизе плазмина человека в зависимости от pH были описаны детально Shi и Wu (1988, Thrombosis Research 51, 355-364). Ohyama et al. (2004, Eur J Biochem 271, 809-820) предложили применение нелизиновых аналоговых модуляторов плазминогена при лечении рака благодаря усилению аутопротеолиза плазмина такими соединениями, которые приводят к усиленному образованию ангиостатинов (в присутствии активатора плазминогена - урокиназы). В таблице 3 в Ohyama et al. (2004) приведены по меньшей мере 15 сайтов расщепления в плазмине, подвергнутом действию усиливающих аутопротеолиз соединений. При обсуждении результатов их наблюдений в свете ранее проведенных исследований можно предположить, что усиливающие аутопротеолиз соединения являются более или менее избирательно усиливающими протеолиз B/легкой цепи, поскольку при отсутствии усиливающих аутопротеолиз соединений был обнаружен минимальный распад как A/тяжелой, так и B/легкой цепи.

Ясно, что ни один из описанных выше способов/вариантов не решал проблему получения плазмина, стабилизированного на молекулярном уровне. Получение варианта плазмина (или соответствующего варианта плазминогена, из которого может быть получен плазмин) с каталитическим доменом, по сути являющимся устойчивым к аутокаталитическому распаду, будет значительным шагом вперед по направлению к эффективному и безопасному длительному хранению, а также по направлению к эффективному и безопасному терапевтическому применению плазмина, например при тромболитической терапии или при индукции заднего отслоения стекловидного тела или разжижения стекловидного тела глаза.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к выделенным вариантам плазминогена или вариантам плазмина, получаемым из них, или к выделенным вариантам плазмина, или протеолитически активным или обратимо неактивным производным любого из указанных вариантов плазминов, где указанные варианты содержат сайт активации и каталитический домен, отличающийся тем, что указанный каталитический домен содержит мутацию одной или нескольких аминокислот в положениях 1-4 каталитического домена плазмина человека или в положениях, соответствующих таковым в каталитическом домене плазмина, отличном от плазмина человека, где указанный каталитический домен плазмина человека начинается с аминокислоты валин в положении 1, которая является той же аминокислотой валин, которая находится в положении 562 Glu-плазминогена человека. Более конкретно, если указанный каталитический домен мутирован в положении 1, то (i) аминокислота в положении -1 по отношению к каталитическому домену плазмина представляет собой аргинин, лизин или другую аминокислоту, которая поддерживает функциональность сайта активации, (ii) аминокислота в положении 24 каталитического домена плазмина человека, или в соответствующем положении каталитического домена плазмина, отличного от плазмина человека, представляет собой метионин, и (iii) аминокислота в положении 1 мутирована в аминокислоту, отличную от глицина или пролина. Альтернативно, если указанный каталитический домен мутирован в положениях 1 и 2, то аминокислота в положении 24 каталитического домена плазмина человека или в соответствующем положении каталитического домена плазмина, отличного от плазмина человека, представляет собой метионин.

Мутация или мутации в вариантах плазминогена, вариантах плазмина или производных плазмина согласно настоящему изобретению уменьшают степень аутопротеолитического распада указанного варианта плазмина по сравнению со степенью аутопротеолитического распада плазмина дикого типа, которая, например, определена с помощью хромогенного анализа или анализа биологической активности к субстрату.

Вариантами плазминогена, вариантами плазмина или производными плазмина согласно настоящему изобретению могут быть следующие: Glu-плазминоген или Glu-плазмин, Lys-плазминоген или Lys-плазмин, мидиплазминоген или мидиплазмин, миниплазминоген или миниплазмин, микроплазминоген или микроплазмин, дельтаплазминоген или дельтаплазмин.

Варианты плазминогена, варианты плазмина или производные плазмина согласно настоящему изобретению представляют особый интерес для применения в качестве лекарственного препарата и необязательно могут быть включены и/или объединены в композиции, дополнительно содержащей по меньшей мере фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или вспомогательное средство. Такие композиции могут дополнительно содержать одно или несколько из антикоагулянта, тромболитического средства, противовоспалительного средства, противовирусного средства, антибактериального средства, противогрибкового средства, антиангиогенного средства, антимитотического средства, антигистамина или анестетика.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способам скрининга в отношении аутопротеолитически стабильных вариантов плазмина, причем указанные способы включают:

(i) получение варианта плазмина согласно настоящему изобретению и получение плазмина дикого типа,

(ii) сравнение аутопротеолитической стабильности вариантного плазмина и плазмина дикого типа, полученных на этапе (i), и

(iii) отбор по результатам этапа (ii) варианта, который сохраняет протеолитическую активность, и у которого аутопротеолитическая стабильность повышена по сравнению с аутопротеолитической стабильностью плазмина дикого типа.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способам получения варианта плазминогена согласно настоящему изобретению, при этом указанные способы включают следующие этапы:

(i) введение нуклеиновой кислоты, кодирующей плазминоген согласно настоящему изобретению, в подходящую клетку-хозяина, способную экспрессировать указанный плазминоген;

(ii) выращивание клетки-хозяина, полученной на этапе (i), в условиях и в течение времени, достаточных для экспрессии указанного плазминогена в указанной клетке-хозяине; и

(iii) сбор плазминогена, экспрессированного на этапе (ii).

Настоящее изобретение дополнительно относится к способам получения варианта плазмина согласно настоящему изобретению, при этом указанные способы включают следующие этапы:

(i) введение нуклеиновой кислоты, кодирующей плазминоген согласно настоящему изобретению, в подходящую клетку-хозяина, способную экспрессировать указанный плазминоген;

(ii) выращивание клетки-хозяина, полученной на этапе (i), в условиях и в течение времени, достаточных для экспрессии указанного плазминогена в указанной клетке-хозяине;

(iii) сбор плазминогена, экспрессированного на этапе (ii).

(iv) активация плазминогена из этапа (iii) до плазмина.

Настоящее изобретение также относится к выделенным последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим вариант плазминогена или вариант плазмина согласно настоящему изобретению, а также к рекомбинантному вектору, содержащему такую нуклеиновую кислоту. Клетки-хозяева, трансформированные вышеуказанной нуклеиновой кислотой или вектором, аналогично являются частью настоящего изобретения.

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ НА ФИГУРАХ

ФИГУРА 1. Аминокислотная последовательность с двойной нумерацией аминокислотных положений Glu-плазминогена дикого типа человека (1-791) и каталитического домена плазмина (1-230, аминокислотная последовательность и нумерация выделены жирным шрифтом). Микроплазминоген, используемый для демонстрации настоящего изобретения, начинается в положении аминокислоты 543 (нумерация относительно Glu-плазминогена). Домены типа “двойная петля” (полученные из информации, включенной в GenBank по номером доступа AAA36451) заключены в рамки и их аминокислотные последовательности напечатаны с заменой букв нормального шрифта на курсив. Аминокислоты каталитической триады обведены кружком.

ФИГУРА 2. Выравнивание аминокислотной последовательности белков плазминогена млекопитающих, полученных из GenBank. Выравнивание последовательностей проводили с помощью программного обеспечения COBALT (Constraint-based Multiple Alignment Tool; Papadopoulos & Agarwala, Bioinformatics 23:1073-79, 2007 доступного с сайта Национального центра биотехнологической информации (NCBI), с установками по умолчанию. ▼: обозначение начала Glu-плазминогена. Аминокислотная нумерация дана по отношению к плазминогену человека.

ФИГУРА 3. Изображение (x 10) заднего отслоения стекловидного тела, индуцированного через 5 дней после инъекции 30 нг варианта микроплазмина Val1Ile.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на результатах исследований влияния точечных мутаций в молекуле плазмина и, более конкретно, в каталитическом домене молекулы плазмина на аутопротеолиз. Пептидные связи, подверженные расщеплению плазмином, расположены на C-конце лизина или аргинина (Weinstein and Doolittle, 1972, Biochim Biophys Acta 258, 577-590). Приблизительно 10% (22 из 230) аминокислот каталитического домена плазмина (начиная с аминокислотного положения 562, валин, в Glu-плазминогене человека) представляют собой лизины или аргинины. Теоретически, все пептидные связи, С-концевые для этих лизинов и аргининов, независимо от структуры аминокислоты, С-концевой по отношению к указанному лизину или аргинину, в одной молекуле плазмина могут протеолитически расщепляться другой молекулой плазмина. Кроме того, теоретически, мутация любого одного или нескольких из этих лизинов или аргининов в аминокислоту, не являющуюся ни лизином, ни аргинином, может сделать молекулу плазмина более устойчивой к аутопротеолитическому распаду. Было доказано, что данная теория верна, как описано в международной патентной заявке № WO 2011/004011. Основанием для настоящего изобретения является неожиданное наблюдение, что мутация аминокислоты дикого типа, расположенной на N-конце каталитического домена, т.е. аминокислота в положениях 1-4 каталитического домена, в аминокислоту, отличную от аминокислоты дикого типа, значительно повышает устойчивость полученного мутантного плазмина к аутопротеолитическому распаду в сочетании с сохранением протеолитической способности мутантным плазмином.

Настоящее изобретение относится к выделенным вариантам плазминогена или вариантам плазмина, получаемым из них, или к выделенным вариантам плазмина, или протеолитически активным или обратимо неактивным производным любого из указанных вариантов плазминов, где указанные варианты содержат сайт активации и каталитический домен, отличающийся тем, что указанный каталитический домен содержит мутацию одной или нескольких аминокислот в положениях 1-4 каталитического домена плазмина человека или в положениях, соответствующих таковым в каталитическом домене плазмина, отличном от плазмина человека, где указанный каталитический домен плазмина человека начинается с аминокислоты валин в положении 1, которая является той же аминокислотой валин, которая находится в положении 562 Glu-плазминогена человека. Более конкретно, если указанный каталитический домен мутирован в положении 1, то (i) аминокислота в положении -1 по отношению к каталитическому домену плазмина представляет собой аргинин, лизин или другую аминокислоту, которая поддерживает функциональность сайта активации, (ii) аминокислота в положении 24 каталитического домена плазмина человека, или в соответствующем положении каталитического домена плазмина, отличного от плазмина человека, представляет собой метионин, и (iii) аминокислота в положении 1 мутирована в аминокислоту, отличную от глицина или пролина. Альтернативно, если указанный каталитический домен мутирован в положениях 1 и 2, то аминокислота в положении 24 каталитического домена плазмина человека или в соответствующем положении каталитического домена плазмина, отличного от плазмина человека, представляет собой метионин. В частности, вышеуказанный вариант плазминогена, вариант плазмина или производное плазмина содержат мутацию аминокислоты валин в положении 1 каталитического домена в изолейцин.

Мутация или мутации в вариантах плазминогена, вариантах плазмина или производных плазмина согласно настоящему изобретению уменьшают степень аутопротеолитического распада указанного варианта плазмина по сравнению со степенью аутопротеолитического распада плазмина дикого типа, которая, например, определена с помощью хромогенного анализа или анализа биологической активности к субстрату.

Мутации, отличные от описанной или описанных выше, могут также присутствовать в каталитическом домене плазмина, как проиллюстрировано в разделе Примеры.

Вариантами плазминогена, вариантами плазмина или производными плазмина согласно настоящему изобретению могут быть следующие: Glu-плазминоген или Glu-плазмин, Lys-плазминоген или Lys-плазмин, мидиплазминоген или мидиплазмин, миниплазминоген или миниплазмин, микроплазминоген или микроплазмин, дельтаплазминоген или дельтаплазмин.

Мутацию аминокислоты в заданном положении в "аминокислоту, отличную от аминокислоты дикого типа" или в "аминокислоту, отличную от природной аминокислоты" рассматривают как изменение аминокислоты в указанном заданном положении плазминогена или плазмина дикого типа в любую аминокислоту, отличную от природной аминокислоты или аминокислоты дикого типа, в таком указанном заданном положении такого указанного плазминогена или плазмина дикого типа. Некоторые аспекты, касающиеся выбора мутаций, приведены далее.

Специалист в данной области сможет легко решить, в какую другую аминокислоту можно мутировать аминокислоту дикого типа. Такое решение может, но не обязательно должно, следовать критериям, таким как размер аминокислоты, заряд аминокислоты, полярность аминокислоты и/или индекс гидрофобности аминокислоты (смотри Таблицу 1). Более того, наличие кристаллической структуры плазминогена и микроплазмина (MMDB ID: 12717; PDB ID: 1DDJ; Wang et al., 2001, J Mol Biol 295, 903-914) значительно помогает определению мутантных аминокислот так, чтобы полученная мутантная молекула плазмина или плазминогена сохраняла протеолитическую активность. Кроме того, можно ожидать, что мутация аминокислоты дикого типа в заданном положении [P+/-n] и необязательно дополнительно в одном или нескольких из заданных положений P, P′, P′′ и т. д. в любую из аминокислот данной группы будет давать похожие результаты. На основе Таблицы 1, указанные данные группы могут быть обозначены следующим образом:

- гидрофобные алифатические аминокислоты: Met, Ile, Leu и Val

- гидрофобные ароматические аминокислоты: Phe

- гидрофильные кислые аминокислоты: Asp, Glu, Asn и Gln

- гидрофильные основные аминокислоты: Arg, Lys и His

- умеренно гидрофобные алифатические аминокислоты: Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Pro

- умеренно гидрофобные ароматические аминокислоты: Tyr и Trp.

Из них, и с целью мутации, Cys и Pro могут быть менее предпочтительными аминокислотами-заменителями аминокислот дикого типа плазмина или плазминогена из-за создания возможной свободной тиольной группы с помощью Cys или из-за более обширного нарушения белковой структуры с помощью Pro. Другие аминокислотные замены включают мутацию аминокислоты дикого типа в положении [P+/-n] и необязательно дополнительно в одном или нескольких положениях P, P', P” и т.д. каталитического домена плазмина (плазминогена) в неприродную или неканоническую аминокислоту или в аналоги аминокислот, такие как норлейцин, норвалин, орнитин или цитруллин (для более обширного списка, смотри, например, Hendrickson et al. 2004, Annu Rev Biochem 73, 147-176).

Таблица 1. Характеристики аминокислот.

Аминокислота	Полярность боковой цепи	Заряд боковой цепи(при pH 7)	Индекс гидрофобности
Аланин	Ala	A	неполярная	нейтральный	1,8
Аргинин	Arg	R	полярная	положительный	-4,5
Аспарагин	Asn	N	полярная	нейтральный	-3,5
Аспарагиновая кислота	Asp	D	полярная	отрицательный	-3,5
Цистеин	Cys	C	неполярная	нейтральный	2,5
Глутаминовая кислота	Glu	E	полярная	отрицательный	-3,5
Глутамин	Gln	Q	полярная	нейтральный	-3,5
Глицин	Gly	G	неполярная	нейтральный	-0,4
Гистидин	His	H	полярная	положительный	-3,2
Изолейцин	Ile	I	неполярная	нейтральный	4,5
Лейцин	Leu	L	неполярная	нейтральный	3,8
Лизин	Lys	K	полярная	положительный	-3,9
Метионин	Met	M	неполярная	нейтральный	1,9
Фенилаланин	Phe	F	неполярная	нейтральный	2,8
Пролин	Pro	P	неполярная	нейтральный	-1,6
Серин	Ser	S	полярная	нейтральный	-0,8
Треонин	Thr	T	полярная	нейтральный	-0,7
Триптофан	Trp	W	неполярная	нейтральный	-0,9
Тирозин	Tyr	Y	полярная	нейтральный	-1,3
Валин	Val	V	неполярная	нейтральный	4,2

Определение аминокислоты в последовательности плазмина (плазминогена), отличного от плазмина (плазминогена) человека, которая “соответствует” (т. е. определение “соответствующей” аминокислоты) аминокислоте в плазмине (плазминогене) человека, в первую очередь подразумевает выравнивание обеих аминокислотных последовательностей. Такое выравнивание может требовать некоторой оптимизации, такой как введение минорных гэпов в одну или обе выравниваемые последовательности, для получения наивысшей идентичности и гомологии. Во-вторых, аминокислота в плазмине (плазминогене), отличном от плазмина (плазминогена) человека, выравнивающаяся с аминокислотой в плазмине (плазминогене) человека, определяется и называется в данном документе как “соответствующая” аминокислота. На фигуре 2 в данном документе изображено такое выравнивание общедоступных последовательностей белка плазминогена млекопитающих и выделены аминокислоты, представляющие особый интерес для настоящего изобретения, в последовательности плазминогена человека (строка 1) вместе с соответствующими аминокислотами в последовательностях плазминогена, отличного от плазминогена человека (строки 2-18). Представляющими особый интерес аминокислотами Р, Р′ и т. д. являются Lys в положении 698 (положение 137 в каталитическом домене, смотри Фигуру 1), Lys в положении 708 (положение 147 в каталитическом домене, смотри Фигуру 1) и Arg в положении 719 (положение 158 в каталитическом домене, смотри Фигуру 1).

“Плазмин”, также известный как фибринолизин или лизофибрин, представляет собой протеазу серинового типа, которая является результатом активации зимогена плазминогена. Активация является результатом протеолитического расщепления между аминокислотами 561 и 562 (нумерация относительно Glu-плазминогена человека). Плазмин несет тяжелую цепь, содержащую 5 доменов типа “двойная петля”, и легкую цепь, содержащую каталитический домен. Плазминоген может быть получен из плазмы крови, например, посредством аффинной к лизину хроматографии (Deutsch and Mertz, 1970, Science 170, 1095-1096). Процессинг молекулы плазмина (снаружи и/или внутри каталитического домена плазмина) возможен при условии, что каталитический домен остается функциональным, такой процессинг, таким образом, приводит к образованию “протеолитически активного производного” плазмина. В связи с этим, один или несколько из 5 доменов типа “двойная петля” могут быть удалены полностью или частично. Процессированные плазмины, в которых не достает одного или нескольких доменов типа “двойная петля” и/или не достает частей одного или нескольких доменов типа “двойная петля”, следовательно, рассматриваются согласно настоящему изобретению как примеры протеолитически активных производных плазмина. Примеры процессированных вариантов плазмина включают, но без ограничений, следующее: “мидиплазмин”, “миниплазмин”, “микроплазмин” и “дельта-плазмин”. Мидиплазмин, в основном, не содержит домены типа “двойная петля” 1-3 (например, Christensen et al., 1995, Biochem J 305, 97-102). Миниплазмин изначально получали путем ограниченного расщепления плазмина эластазой, и он, в основном, не содержит домены типа “двойная петля” 1-4 (например, Christensen et al., 1979, Biochim Biophys Acta 567, 472-481; Powell and Castellino, 1980, J Biol Chem 255, 5329). Миниплазмин был впоследствии получен рекомбинантно (WO 2002/050290). Микроплазмин изначально был получен путем инкубации плазмина при повышенном pH, и он, в основном, не содержит все домены типа “двойная петля” (например, WO 89/01336). Тогда как микроплазмин, полученный в результате инкубации плазмина при повышенном pH, содержит 30-31 карбокси-концевых аминокислот тяжелой цепи, рекомбинантно полученный вариант микроплазмина содержит 19 карбокси-концевых аминокислот тяжелой цепи (WO 2002/050290). Это иллюстрирует допустимую молекулярную изменчивость в данном семействе плазминов, таком как семейство микроплазминов (например, множество видов образуют семейство микроплазминов). Дельта-плазмин представляет собой рекомбинантную версию плазмина, в котором домен типа “двойная петля” 1 связан непосредственно с каталитическим доменом (WO 2005/105990). Вышеописанные процессированные варианты плазмина получают путем активации “мидиплазминогена”, “миниплазминогена”, “микроплазминогена” и “дельтаплазминогена”, соответственно. Для того чтобы быть активируемым, процессированный плазминоген должен содержать минимальное количество аминокислот линкера между доменом типа “двойная петля” (таким как домен типа “двойная петля” 5 у миниплазмина) и каталитическим доменом или С-концом каталитического домена в случае плазмина с удаленным в результате процессинга доменом типа “двойная петля” (смотри, например, Wang et al., 1995, Protein Science 4, 1758-1767). В контексте настоящего изобретения может быть необходимо, чтобы плазминоген содержал “интактный сайт активации”, который предполагает, что по меньшей мере аминокислоты 561 и 562 (относительно Glu-плазминогена человека; или соответствующие аминокислоты в плазминогене, отличном от плазминогена человека) являются такими, чтобы могла проходить активация/превращение плазминогена в плазмин, хотя возможно с различной кинетикой, как это происходит в плазмине дикого типа. В качестве альтернативы плазмину или его активному процессированному варианту в контексте настоящего изобретения можно использовать активируемый плазминоген или его процессированный вариант (смотри, например, EP 0480906; US 5304383; EP 0631786; US 5520912; US 5597800; US 5776452). “Плазминоген” относится к любой форме плазминогена, например, Glu-плазминогену или Lys-плазминогену (начинающихся с Arg в положении 68 или Lys в положениях 77 или 78). При использовании активируемого плазминогена или его активируемого процессированного варианта, активация до плазмина может быть отсрочена и будет, как правило, происходить после его контакта с органом, тканью или жидкостью организма, т.е. после введения субъекту. В еще одной альтернативе плазмином или его активным процессированным вариантом в контексте настоящего изобретения можно заменить активируемый плазминоген или его активируемый процессированный вариант совместно с активатором плазминогена (таким как тканевой активатор плазминогена (tPA), урокиназа, стрептокиназа или стафилокиназа или любой их вариант; смотри, например, US 6733750, US 6585972, US 6899877, WO 03/33019). В еще дополнительной альтернативе в контексте настоящего изобретения можно использовать смесь любого из следующего: (i) плазмин или его производное (ii) активируемый плазминоген или его активируемое производное, и, необязательно, (iii) активатор плазминогена (смотри, например, US 2004/0081643). Для того чтобы обеспечить стабильность плазмина (или плазминогена), его будут, как правило, хранить при пониженных температурах (например,+4 градуса Цельсия или -20 градусов Цельсия). Композицией для хранения может быть стабилизирующая композиция, такая как композиция с низким рН (pH 4 или ниже; полученная, например, с помощью 1 мМ - 250 мМ кислоты, такой как лимонная кислота, смотри, например, Castellino & Sodetz, 1976, Methods Enzymol 45, 273-286; WO 01/36608; WO 01/36609; WO 01/36611) или композиция с высоким содержанием глицерина (30-50% объемного содержания, например, Castellino & Sodetz, 1976, Methods Enzymol 45, 273-286), альтернативно в или совместно с одной или несколькими дополнительными композициями стабилизаторов, содержащими, например, аминокислоту (например, лизин или его аналог, такой как EACA или транексамовая кислота), сахар (например, маннит) или любой стабилизатор, который известен в данной области техники (например, дипептиды, WO 97/01631). В семейство “плазминов” дополнительно включено любое его активное производное (или активный процессированный вариант плазмина) или сходное производное активируемого плазминогена (или его активируемого процессированного варианта). Такие производные включают, например, меченый плазмин или плазминоген (или их процессированные варианты), такой как Tc⁹⁹-меченный плазмин (Deacon et al., 1980, Br J Radiol 53, 673-677) или пегилированный или ацилированный плазмин или плазминоген (или их процессированные варианты; EP 9879, WO 93/15189). Также можно использовать любую другую метку (радиоактивную, флюоресцентную и т.п.) для получения производного плазмина или плазминогена. Указанные производные дополнительно включают гибридные или химерные молекулы плазмина или плазминогена, содержащие, например, процессированный плазмин или плазминоген согласно настоящему изобретению, слитый, например, с фибрин-связывающей молекулой (такой как “двойная петля” 2 tPA, аполипопротеиновая “двойная петля”, пальцеобразный домен tPA или фибронектина или Fab домен фибрин-связывающего антитела).

Сравнение аутопротеолитической устойчивости (т.е. стабильности) плазмина дикого типа и вариантов плазмина или производных плазмина согласно настоящему изобретению может быть проведено сходным образом, как для сравнения протеолитической активности, например, при хромогенном анализе активности или анализе биологического субстрата на основе, например, фибрина, фибриногена фибронектина, желатина, ламинина или коллагена.

Для того чтобы определить аутопротеолитическую устойчивость, может быть определена константа скорости аутолиза. Предусматривается, что варианты плазмина согласно настоящему изобретению, включая плазмины, полученные из вариантов плазминогена согласно настоящему изобретению, или любое из производных плазмина согласно настоящему изобретению могут характеризоваться константой скорости аутолиза, которая является по меньшей мере на 5% или по меньшей мере на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% или 99,5% ниже константы скорости аутолиза плазмина дикого типа, или, альтернативно, константой скорости аутолиза, которая составляет не более 95% или не более 0,5%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% или 90% константы скорости аутолиза плазмина дикого типа. Для того чтобы определить указанный процент, расчет может быть произведен на основе абсолютных значений константы скорости аутолиза. Например, для микроплазмина дикого типа была определена константа скорости аутолиза 123 M^-1 с^-1, в то время как для варианта микроплазмина V1I была определена константа скорости аутолиза 33 M^-1 с^-1 (см. Примеры). Константа скорости аутолиза варианта V1I, следовательно, составляет 26,8% константы скорости аутолиза микроплазмина дикого типа.

Дополнительно, любой из вариантов плазмина согласно настоящему изобретению, включая плазмины, полученные из вариантов плазминогена согласно настоящему изобретению, или производные любого из указанных плазминов могут сохранять протеолитическую активность, отличную (выше или ниже) от протеолитической активности плазмина дикого типа, такой, которая определена с помощью, например, анализа хромогенной активности или анализа биологического субстрата на основе, например, фибрина, фибриногена, фибронектина, желатина, ламинина или коллагена.

Протеолитические активности вариантов плазмина согласно настоящему изобретению, включая плазмины, полученные из вариантов плазминогена согласно настоящему изобретению, или любое из производных плазмина согласно настоящему изобретению можно сравнить с протеолитической активностью плазмина дикого типа посредством каталитической константы k_кат, которая