Нуклеинокислотные и аминокислотные последовательности аденовируса обезьян, векторы, содержащие указанные последовательности, и их применение

Нуклеинокислотные и аминокислотные последовательности аденовируса обезьян, векторы, содержащие указанные последовательности, и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к новым аденовирусным штаммам с улучшенной серопревалентностью. В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам аденовирусных капсидных белков, таких как гексон, пентон и фибер ("fiber") и их фрагменты, и к полинуклеотидам, кодирующим эти полипептиды. Предлагаются также вектор, содержащий выделенный полинуклеотид изобретения, аденовирусы, содержащие выделенные полинуклеотиды или полипептиды изобретения, и фармацевтическая композиция, содержащая указанные вектор, аденовирус, полипептид и/или полинуклеотид. Изобретение относится также к применению выделенных полинуклеотидов, выделенных полипептидов, вектора, аденовирусов и/или фармацевтической композиции для терапии или профилактики заболевания.

Предшествующий уровень техники

Аденовирусы (Ads) составляют большое семейство вирусов с двунитевой ДНК, обнаруженных у земноводных, птиц и млекопитающих; они имеют лишенную оболочки икосаэдрическую капсидную структуру (Straus, Adenovirus infections in humans; The Adenoviruses, 451-498, 1984; Hierholzer et al., J. Infect. Dis., 158: 804-813, 1988; Schnurr and Dondero, Intervirology., 36: 79-83,1993; Jong et al., J. din. Microbiol., 37: 3940-3945: 1999). В отличие от ретровирусов, аденовирусы способны трансдуцировать многочисленные типы клеток некоторых видов млекопитающих, включая как делящиеся, так неделящиеся клетки, не встраиваясь при этом в геном клетки хозяина.

Вообще говоря, аденовирусная ДНК в типичных случаях очень стабильна и остается эписомальной (например, внехромосомной) за исключением тех случаев, когда произошла трансформация или опухолегенез. К тому же аденовирусные векторы могут размножаться с высокими выходами в строго определенных производственных системах, которые легко приспособить к крупномасштабному фармацевтическому производству композиций клинического назначения. Эти характеристики и их хорошо изученная молекулярная генетика делают рекомбинантные аденовирусные векторы подходящими кандидатами для применения в качестве носителей вакцин. Создание рекомбинантных аденовирусных векторов может базироваться на использовании пакующей клеточной линии, способной комплементировать функции аденовирусных генных продуктов, которые были либо делегированы, либо рекомбинированы для подавления генетической функции.

В настоящее время два хорошо изученных серотипа аденовируса человека подгруппы С (т.е. hAd2 и hAd5) широко используются в качестве источников вирусного каркаса для большинства аденовирусных векторов, применяемых для генной терапии. Дефектные по репликации векторы аденовируса человека тестировались также на пригодность в качестве носителей вакцин для доставки множества иммуногенов, полученных от множества возбудителей инфекции. Исследования, проведенные на подопытных животных (например, на грызунах, собаках и приматах, кроме человека), показывают, что рекомбинантные репликационно-дефектные векторы аденовируса человека, несущие трансгены, кодирующие иммуногены, а также другие антигены, вызывают как гуморальный, так и клеточно-опосредованный иммунный ответ на трансгенный продукт. Исследователи сообщают об успешном применении векторов аденовируса человека в качестве носителей вакцин в экспериментальных системах, не предназначенных для человека, либо в соответствии с протоколами иммунизации, использующими высокие дозы рекомбинантных аденовирусных векторов, которые, как прогнозируется, вызывают иммунные ответы, либо в соответствии с протоколами иммунизации, которые предусматривают последовательное введение аденовирусных векторов, полученных от различных серотипов, но несущих такой же трансгенный продукт, в качестве буст иммунизации (Mastrangeli et al., Human Gene Therapy, 7: 79-87 (1996)).

Были сконструированы вирусные векторы на основе человеческого аденовируса 5-го типа (Ad5) для различного применения в генной терапии и в качестве вакцин. Хотя векторы на основе Ad5 показывают очень высокую эффективность на животных моделях, в ходе их клинических испытаний было выявлено, что наличие у человека предсуществующего иммунитета против вируса Ad5 "дикого типа" снижает эффективность трансдукции генов. В частности, четкое снижение эффективности иммунизации было отмечено у субъектов с титрами нейтрализующих антител более 200, которые участвовали в клиническом испытании вакцины на основе векторов Ad5. Наиболее экстенсивная характеристика вакцины на основе векторов Ad5 была получена в ходе STEP-испытания вакцины против ВИЧ, проведенного фирмой Merck (Moore JP et al. Science. 2008 May 9; 320 (5877):753-5). Испытание вакцины базировалось на совместной инъекции 3-х векторов Ad5, экспрессирующих различные антигены ВИЧ, субъектам с высоким риском ВИЧ-инфекции для доказательства обоснованности концепции. Поразительно, но данные показали скорее повышение уровня инфицированности ВИЧ у вакцинированных субъектов с предсуществующим анти-Ad5 иммунитетом, чем защитный эффект. Хотя механизм этого парадоксального наблюдения еще не ясен, его результаты вызвали дополнительные вопросы о безопасности и эффективности векторов на основе аденовируса человеческого происхождения для применения в качестве вакцины для здоровых субъектов. Если суммировать все полученные на сегодняшний день результаты различных клинических испытаний вакцин и генной терапии, таких как испытания векторов Ad5, то все они свидетельствуют о возрастающей необходимости получения аденовируса, характеризующегося очень низким или полным отсутствием предсуществующего иммунитета у человека.

Краткое изложение сущности изобретения

В первом аспекте настоящего изобретения предложен выделенный полинуклеотид, который кодирует аденовирусный белок фибер или его функциональное производное и который выбирается из группы, состоящей из:

(a) полинуклеотида, кодирующего полипептид, который имеет аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO:14-19, 50 и 53;

(b) полинуклеотида, кодирующего функциональное производное полипептида согласно любой из SEQ ID NO:14-19, 50 и 53, в котором указанное функциональное производное содержит делецию, инсерцию и/или замену одного или более аминокислотных остатков, и

(c) полинуклеотида, кодирующего функциональное производное имеющее аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 85% идентична по всей своей длине любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO:14-19, 50 и 53.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который кодирует аденовирусный белок гексон или его функциональное производное и который выбирается из группы, состоящей из:

(a) полинуклеотида, кодирующего полипептид, который имеет аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO:20-25, 51 и 54;

(b) полинуклеотида, кодирующего функциональное производное полипептида согласно любой из SEQ ID NO:20-25, 51 и 54, в котором указанное функциональное производное содержит делецию, инсерцию и/или замену одного или более аминокислотных остатков, и

(c) полинуклеотида, кодирующего функциональное производное, имеющее аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 95% идентична по всей своей длине любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO:20-25, 51 и 54.

Предлагается также выделенный полинуклеотид, который кодирует аденовирусный белок пентон или его функциональное производное и который выбирается из группы, состоящей из:

(a) полинуклеотида, кодирующего полипептид, который имеет аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 26-31, 52 и 55;

(b) полинуклеотида, кодирующего функциональное производное полипептида согласно любой из SEQ ID NO: 26-31, 52 и 55, в котором указанное функциональное производное содержит инсерцию, вставку и/или замену одного или более аминокислотных остатков, и

(c) полинуклеотида, кодирующего функциональное производное, имеющее аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 85% идентична по всей своей длине любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 26-31, 52 и 55.

Изобретение относится также к полинуклеотиду, содержащему, по меньшей мере, один из выделенных полинуклеотидов согласно изобретению, как описано выше. Кроме того, изобретение предлагает выделенный аденовирусный капсидный полипептид, кодируемый выделенным полинуклеотидом согласно изобретению, или его функциональное производное.

В следующем аспекте изобретения предложен вектор, содержащий выделенный полинуклеотид согласно изобретению.

Предлагается также рекомбинантный аденовирус, предпочтительно репликационно-некомпетентный аденовирус, содержащий выделенный полинуклеотид согласно изобретению и/или, по меньшей мере, один выделенный аденовирусный капсидный полипептид согласно изобретению.

Следующим аспектом изобретения является композиция, содержащая адьювант и, по меньшей мере, один из следующих компонентов (i)-(iv):

(i) один или более выделенных аденовирусных капсидных полипептидов изобретения;

(ii) выделенный полинуклеотид по изобретению;

(iii) вектор по изобретению;

(iv) рекомбинантный вирус по изобретению

и, необязательно, фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Кроме того, изобретение относится к клетке, содержащей, по меньшей мере, один из следующих компонентов:

(i) один или более выделенных аденовирусных капсидных полипептидов изобретения;

(ii) выделенный полинуклеотид по изобретению;

(iii) вектор по изобретению;

(iv) рекомбинантный вирус по изобретению.

Следующий аспект изобретения касается применения выделенного аденовирусного капсидного полипептида изобретения; выделенного полинуклеотида изобретения; вектора изобретения; рекомбинантного аденовируса изобретения и/или композиции изобретения для терапии или профилактики заболевания.

Подробное описание изобретения

Прежде чем перейти к подробному описанию изобретения, необходимо подчеркнуть, что настоящее изобретение не ограничивается описанными здесь конкретными методиками, протоколами и реагентами, поскольку все они могут варьировать. Следует также иметь в виду, что употребляемая в описании терминология служит только цели описания частных вариантов осуществления изобретения и не имеет целью ограничить объем настоящего изобретения, который ограничивается только приложенной формулой изобретения. Если нет указания на что-либо иное, то все употребляемые здесь технические и научные термины имеют значения, общеизвестные специалисту в данной области техники.

Употребляемые в описании термины предпочтительно трактуются так же, как они описаны в "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)" [Многоязычный словарь биотехнологических терминов: рекомендации IUPAC (Международного Союза теоретической и прикладной химии)], Leuenberger, H.G.W, Nagel, В. и Kibl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland) и как они описаны в "Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications" [Фармацевтические вещества: синтез, патенты, применение], Axel Kleemann & Jurgen Engel, изд. Thieme Medical Publishing, 1999; the "Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals" [Merck-Индекс: Энциклопедия химических веществ, лекарственных препаратов и биологических веществ], изд. Susan Budavari et al., CRC Press, 1996, и the United States Pharmacopeia-25/National Formulary-20, опубл. the United States Pharmcopeial Convention, Inc., Rockville Md., 2001.

В нижеследующем подробном описании и формуле изобретения, если контекст не требует другого, слова включать, содержать ("comprise") и производные от них, такие как включает, содержит ("comprises") и включающий, содержащий ("comprising"), следует понимать как включение определенного признака, целого или стадии либо группы признаков, целого или стадий, а не исключение любого другого признака, целого или стадии либо группы признаков, целого или стадий. В нижеследующих параграфах различные аспекты изобретения раскрываются более подробно. Каждый раскрываемый аспект может комбинироваться с любым другим аспектом или аспектами, если четко не указано обратное. В частности, любой признак, описанный как предпочтительный или выгодный, может комбинироваться с любым другим признаком или признаками, описываемыми как предпочтительные или выгодные.

В тексте описания цитируется ряд документов. Каждый из документов (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и др.), независимо от того, упоминается он выше или ниже, включен в полном объеме в настоящую заявку в виде ссылки. Ничто здесь не должно быть истолковано как признание того, что изобретатели не вправе датировать такое раскрытие задним числом на основании изобретения предшествующего уровня техники.

Ниже дается толкование терминов, часто употребляемых в настоящем описании. Каждый из этих терминов в каждом случае его употребления в остальной части описания имеет значение, соответствующее его толкованию, и предпочтительные значения.

Вообще говоря, аденовирусный геном хорошо изучен. В общей организации аденовирусного генома отмечена определенная консервативность, заключающаяся в сходном позиционировании специфических открытых рамок считывания, например, в местах локализации Е1А, Е1В, Е2А, Е2В, Е3, Е4, LI, L2, L3, L4 и L5 генов каждого вируса. Каждый конец аденовирусного генома содержит последовательность, известную как обращенный концевой повтор (ITR), который необходимы для репликации вируса. Вирус содержит также вирус-кодируемую протеазу, которая необходима для процессинга некоторых из структурных белков, требующихся для продукции инфекционных вирионов. В основе описания структуры аденовирусного генома лежит порядок экспрессии вирусных генов после трансдукции клетки хозяина. Если говорить более конкретно, то вирусные гены относятся к ранним (Е) или поздним (L) генам в зависимости от того, когда происходит транскрипция - до или после начала репликации ДНК. В ранней фазе трансдукции Е1А, Е1В, Е2А, Е2В, Е3 и Е4 гены аденовируса экспрессируются для подготовки клетки хозяина к вирусной репликации. В поздней фазе инфекции экспрессия поздних генов L1-L5, которые кодируют структурные компоненты вирусных частиц, активируется.

В нижеследующей таблице 1 приводится перечень последовательностей, упомянутых в настоящем изобретении.

Таблица 1
Обозначение/Штамм	SEQ ID NO:	Белок	Полинуклеотид
HIV (ВИЧ) gag	1		HIV (ВИЧ) gag
TLR9 агонист	2		TLR9 агонист
HVR7 праймер1	3		HVR7 праймер 1
HVR7 праймер2	4		HVR7 праймер2
HVR1-6fd	5		HVR1-6fd
HVR1-6rev	6		HVR1-6rev
PanAd1 левый конец P1	7		PanAd1 левый конец Р1
PanAd1 левый конец P2	8		PanAd1 левый конец Р2
PanAd1 правый конец P1	9		PanAd1 правый конец Р1
PanAd1 правый конец P2	10		PanAd1 правый конец Р2
pIX P1	11		pIXP1
pIX Р2	12		рIХР2
Аденовирус бонобо 1-го типа (PanAd1). Полный геном	13		Аденовирус бонобо 1-го типа (PanAd1). Полный геном
ChAd55	14	Фибер
ChAd73	15	Фибер
ChAd83	16	Фибер
ChAd146	17	Фибер
ChAd147	18	Фибер
PanAd1	19	Фибер
ChAd55	20	Гексон
ChAd73	21	Гексон
ChAd83	22	Гексон
ChAd146	23	Гексон
ChAd147	24	Гексон
PanAd1	25	Гексон
ChAd55	26	Пентон
ChAd73	27	Пентон
ChAd83	28	Пентон
ChAd146	29	Пентон
ChAd147	30	Пентон
PanAd1	31	Пентон
ChAd55	32		Фибер
ChAd73	33		Фибер
ChAd83	34		Фибер
ChAd146	35		Фибер
ChAd147	36		Фибер
PanAd1	37		Фибер
ChAd55	38		Гексон
ChAd73	39		Гексон
ChAd83	40		Гексон
ChAd146	41		Гексон
ChAd147	42		Гексон

PanAd1	43		Гексон
ChAd55	44		Пентон
ChAd73	45		Пентон
ChAd83	46		Пентон
ChAd146	47		Пентон
ChAd147	48		Пентон
PanAd1	49		Пентон
PanAd2	50	Фибер
PanAd2	51	Гексон
PanAd2	52	Пентон
PanAd3	53	Фибер
PanAd3	54	Гексон
PanAd3	55	Пентон
PanAd2	56		Фибер
PanAd2	57		Гексон
PanAd2	58		Пентон
PanAd3	59		Фибер
PanAd3	60		Гексон
PanAd3	61		Пентон
Аденовирус бонобо 2-го типа (PanAd2). Полный геном	62		Аденовирус бонобо 2-го типа (PanAd2). Полный геном
Аденовирус бонобо 3-го типа (PanAd3). Полный геном	63		Аденовирус бонобо 3-го типа (PanAd3). Полный геном
Ad5 E4 ORF6-кодирующая последовательность	64		Ad5 E4 ORF6-кодирующая последовательность
ChAd83 полный геном	65		ChAd83 полный геном

В контексте описания термин "выделенный" относится к молекуле, не содержащей, в основном, других молекул, с которыми она может связываться естественным образом. Таким образом, выделенная молекула - это молекула, которая не содержит других молекул, способных естественным образом взаимодействовать или контактировать с ней в организме живого животного, т.е. вне экспериментальных условий.

В контексте описания термины "белок", "пептид", "полипептид", "пептиды" и "полипептиды" употребляются взаимозаменяемо. Эти термины относятся как к встречающимся в природе пептидам, например, к встречающимся в природе белкам, так и к синтезированным пептидам, которые могут включать встречающиеся в природе или не встречающиеся в природе аминокислоты. Пептиды могут быть химически модифицированными путем модификации боковой цепи или свободного амино- или карбоксильного конца встречающейся или не встречающейся в природе аминокислоты. Такая химическая модификация включает введение дополнительных химических веществ, а также модификацию функциональных групп в боковых цепях аминокислоты, например, гликозилирование. Пептид является полимером, предпочтительно содержащим, по меньшей мере, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или, по меньшей мере, 100 аминокислот, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 8 или, по меньшей мере, 30 аминокислот. Поскольку раскрываемые в описании полипептиды и белки имеют аденовирусное происхождение, предпочтительно, чтобы молекулярная масса выделенного полипептида или белка, используемого в изобретении, не превышала 200 кДа.

Термин "вектор" в контексте описания включает любые векторы, известные специалисту в данной области техники, такие как плазмидные векторы, космидные векторы, фаговые векторы, такие как фаг лямбда, вирусные векторы, такие как аденовирусные (Ad) векторы (например, не реплицирующиеся векторы Ad5, Ad11, Ad26, Ad35, Ad49, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 и ChAd82 или репликационно-компетентные векторы Ad4 и Ad7, известные из предшествующего уровня техники (например, из WO 2005/071093 А2)), векторы аденоассоциированных вирусов (AAV) (например, AAV 5-го типа), векторы альфавирусов (например, вируса Венесуэльского лошадиного энцефалита (VEE), вируса Синдбис (SIN), вируса леса Семлики (SFV) и VEE-SIN химеры), векторы герпес-вируса, векторы вируса кори, векторы вируса оспы (например, вируса осповакцины), модифицированного вируса осповакцины Ankara (MVA), NYVAC (выделенного из штамма Copenhagen осповакцины) и векторы вируса оспы птиц (avipox): векторы вируса оспы канареек (ALVAC) и вируса оспы пернатой дичи (FPV)); векторы вируса везикулярного стоматита, вирусоподобные частицы или споры бактерий. Термин "вектор" включает также векторы экспрессии, векторы для клонирования и векторы, пригодные для генерации рекомбинантных вирусов в клетках хозяина.

Термин "экспрессионная кассета" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая содержит, по меньшей мере, одну нуклеинокислотную последовательность, которая должна быть экспрессирована, а также последовательности, контролирующие ее транскрипцию и трансляцию. Замена экспрессионной кассеты заставляет вектор, в который она встроена, направлять экспрессию другой последовательности или комбинации последовательностей. Благодаря тому, что сайты рестрикции предпочтительно конструируются так, чтобы они располагались на концах 5′ и 3′, кассета может легко встраиваться, удаляться или заменяться другой кассетой. Предпочтительно экспрессионная кассета включает цис-регулирующие элементы для эффективной экспрессии данного гена, такие как промотор, сайт инициации и/или сайт полиаденилирования, что подробно описывается ниже.

Термин "антитело" относится как к моноклональным, так и к поликлональным антителам, т.е. к любому белку-иммуноглобулину или его части, способной связывать антиген или гаптен. Антигенсвязывающие части могут быть получены методом рекомбинантных ДНК или ферментативным либо химическим расщеплением интактных антител. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающие части включают: Fab, Fab′, F(ab′)₂, Fd, Fv, dAb и варианты участка, определяющего комплементарность (CDR), одноцепочечные антитела (scFv), химерные антитела, гуманизированные антитела, димерные антитела и полипептиды, которые содержат, по меньшей мере, часть антитела, достаточную для придания полипептиду специфических антигенсвязывающих свойств.

Введение иммуногена/антигена для индуцирования/генерирования иммунного ответа у млекопитающего в контексте настоящего изобретения обозначается термином "прайминг", а введение иммуногена/антигена для усиления иммунного ответа на указанный иммуноген/антиген, например, конкретный патоген (такой как вирион или вирусный патоген, антиген патогенной бактерии или опухолевый антиген) у млекопитающего обозначается термином "бустинг". Выражение "гетерологичный прайм-буст" означает, что вектор для индуцирования/генерирования иммунного ответа (прайминг) у млекопитающего и вектор для усиления иммунного ответа (бустинг) у млекопитающего различны. "Гетерологичный прайм-буст" целесообразен в том случае, если организм субъекта, например, пациента, наработал антитела против первого вектора и требуется бустинг.Поэтому в предпочтительном варианте осуществления гетерологичного прайм-буста могут использоваться два разных аденовируса, например, для вакцинации и/или для генной терапии. В этом контексте первый и второй аденовирусы будут достаточно разными, если образование антител, индуцируемое в ходе прайминга первым аденовирусом, не препятствует прониканию более 70% или предпочтительно более 80% частиц второго аденовируса, введенного для бустинга, в ядро клеток животного, которое подверглось праймингу и бустингу.

Термин "репликационно-компетентный" рекомбинантный аденовирус (AdV) относится к аденовирусу, который способен реплицироваться в клетке хозяина в отсутствие любых рекомбинантных хелперных белков, содержащихся в клетке. Предпочтительно "репликационно-компетентный" аденовирус содержит следующие интактные или функционально существенные ранние гены: Е1А, Е1В, Е2А, Е2В, Е3 и Е4. Аденовирусы дикого типа, выделенные от конкретного животного, будут репликационно-компетентны в этом животном.

Термин "репликационно-дефектный" рекомбинантный AdV относится к аденовирусу, который не способен к репликации, поскольку он сконструирован таким образом, что содержит, по меньшей мере, одну функциональную делецию, т.е. делецию, которая нарушает функцию гена без его полного удаления, например, за счет введения искусственных стоп-кодонов, делеции или мутации активных сайтов или доменов взаимодействия, мутации или делеции регуляторной последовательности гена и др., либо с полным удалением гена, кодирующего генный продукт, являющийся существенным для вирусной репликации, например, один или более аденовирусных генов, выбранных из Е1, Е2, Е3 и Е4. Векторы рекомбинантного аденовируса шимпанзе по изобретению предпочтительно являются дефектными по репликации.

Термин "идентичность" или "идентичный" в контексте полинуклеотида, полипептида или последовательностей белков относится к количеству остатков в двух последовательностях, которые, будучи выровненными для максимального соответствия, являются идентичными. Если говорить более конкретно, то процент идентичности двух последовательностей (нуклеинокислотных или аминокислотных последовательностей) - это число точных соответствий между двумя выровненными последовательностями, деленное на длину более короткой последовательности и умноженное на 100. Инструменты выравнивания, которые могут использоваться для выравнивания двух последовательностей, хорошо известны специалисту в данной области техники и доступны, например, в Интернете, к примеру, ClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw) или Align (http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html). Выравнивание между двумя последовательностями может проводиться с использованием стандартных настроек: для Align EMBOSS::needle - предпочтительно: Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что может возникнуть необходимость введения пробелов в ту или другую последовательность для достижения удовлетворительного выравнивания. "Наилучшее выравнивание последовательностей" между двумя полипептидами определяется как такое выравнивание, которое дает наибольшее количество выровненных идентичных остатков.

Аденовирусы

Аденовирус (Ad) - это не имеющий оболочки, икосаэдрический вирус, который был идентифицирован у некоторых птиц- и млекопитающих-вирусоносителей. Аденовирусы человека (hAds) относятся к роду Mastadenovirus, который включает все известные вирусы человека и многие Ads животного (например, крупного рогатого скота, свиней, собак, грызунов, лошадей, обезьян и овец) происхождения. Аденовирусы человека в большинстве случаев подразделяются на шесть подгрупп (A-F) по ряду биологических, химических, иммунологических и структурных критериев, которые включают гемагглютинирующие свойства эритроцитов крыс и макак-резусов, гомологию ДНК, паттерн расщепления ферментами рестриктазами, процентное содержание G+C и онкогенность (Straus, 1984: в: The Adenoviruses, ed. H. Ginsberg, pp.451-498, New York: Plenus Press, and Horwitz, 1990; в: Virology, ed. B.N. Fields and D.M. Knipe, pp.1679-1721).

Аденовирусный вирион имеет икосаэдрическую симметрию и, в зависимости от серотипа, диаметр от 60 до 90 нм. Икосаэдрический капсид содержит три основных белка - гексон (II), основание пентона (III) и узловатый фибер (IV) (W.С. Russel, J. Gen. Virol., 81: 2573-2604 (2000)). Одним аспектом предсуществующего иммунитета, который наблюдается у человека, является гуморальный иммунитет, который может приводить к продукции и персистенции антител, специфичных к аденовирусным белкам. Гуморальный иммунный ответ, вызываемый аденовирусом, направлен главным образом против трех основных структурных белков - гексона, пентона и фибера.

Количество выявленных на сегодняшний день различных серотипов аденовируса человека составляет 51; все они сгруппированы в подгруппы на основе их гемагглютинирующих свойств и биофизических и биохимических критериев. Из опубликованных отчетов следует, что титры антител против множества серотипов являются общими (Dambrosio, Е. (1982) J. Hyg. (London) 89: 209-219) и что значительная часть титров показывает нейтрализующую активность.

Как уже упоминалось выше, рекомбинантные аденовирусы находят применение в генной терапии и в качестве вакцин. Вирусные векторы на основе аденовируса шимпанзе являются альтернативой использованию векторов аденовируса (Ad) человека для создания генетических вакцин (Farina SF, J Virol. 2001 Dec; 75(23): 11603-13.; Fattori Е, Gene Ther. 2006 July; 13(14): 1088-96). Аденовирусы, выделенные от шимпанзе, являются близкородственными с аденовирусами, выделенными от человека, о чем свидетельствует их эффективная репродукция в клетках человеческого происхождения. Однако коль скоро аденовирусы человека и шимпанзе являются "ближайшими родственниками", можно предположить, что между этими двумя видами вирусов существует серологическая перекрестная реактивность.

Это предположение подтвердилось, когда были выделены и охарактеризованы аденовирусы шимпанзе. Тем не менее, изоляты аденовируса шимпанзе показали пониженную перекрестную реактивность с общераспространенными серотипами эпитопов человеческого аденовируса. Поэтому аденовирус шимпанзе (также обозначенный в настоящем описании аббревиатурой "ChAd" [аденовирус обычного шимпанзе] и "PanAd" [аденовирус бонобо]) обеспечивает основу для снижения побочных эффектов, связанных с предсуществующим иммунитетом у человека к общераспространенным серотипам человеческих аденовирусов. Однако имеющий значение от низкого до среднего нейтрализующий титр антител против выделенных к настоящему времени аденовирусов шимпанзе обнаруживается в подгруппах человеческих сывороток, и, следовательно, все известные серотипы аденовирусов шимпанзе до некоторой степени все же нейтрализуются сыворотками крови человека.

В рамках настоящего изобретения сделано неожиданное открытие о возможности выделения новых штаммов аденовирусов шимпанзе, а именно ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAdl46, ChAd147, выделенных от шимпанзе обыкновенного (Pan troglodytes), и PanAd1, PanAd2 и PanAd3, выделенных от бонобо (Pan paniscus). Все эти новые штаммы не показывают определяемой серопревалентности у человека, т.е. эти аденовирусные штаммы составляют исключение из описанных к настоящему времени аденовирусов шимпанзе в силу того, что все протестированные человеческие сыворотки дали полностью негативные результаты на присутствие нейтрализующих антител. В этом контексте термин "нейтрализующее антитело" относится к антителу, которое связывается с эпитопом аденовируса и предотвращает возникновение продуктивной инфекции в клетке хозяина или предупреждает трансдукцию целевой клетки репликационно-некомпетентным вектором, экспрессирующим трансген, например, аденовирусная ДНК способна проникать в клетку хозяина. В то время как нейтрализующие антитела были выявлены ко всем аденовирусам шимпанзе, описанным в предшествующем уровне техники, новые типы аденовирусов ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, ChAd147 PanAd1, PanAd2 и PanAd3 характеризуются полным отсутствием у человека предсуществующего нейтрализующего антитела, направленного против указанных типов аденовирусов. Таким образом, эти аденовирусы являются ценным медицинским инструментом, который может использоваться, например, для иммунизации и/или генной терапии.

Как подробно рассматривается ниже, изобретение в одном аспекте предлагает новые последовательности аденовирусных капсидных белков, которые представляют большинство экспонированных на поверхности аденовирусных эпитопов, а именно гексона, пентона и фибера. Как уже упоминалось выше, в сыворотках крови человека не содержится нейтрализующих антител, специфичных к вирусам согласно изобретению. Таким образом, одним преимуществом вышеупомянутых новых последовательностей белков аденовируса шимпанзе - гексона, пентона и фибера - является то, что последовательности этих белков могут использоваться для усиления аденовирусов предшествующего уровня техники, сконструированных, например, для медицинских целей. Например, капсидные белки или их функциональные фрагменты согласно настоящему изобретению могут использоваться, например, для замены соответственно одного или более основных структурных капсидных белков или их функциональных фрагментов различных аденовирусов, например, аденовируса предшествующего уровня техники, для получения улучшенных рекомбинантных аденовирусов с пониженной серопревалентностью у человека. Поскольку новые аденовирусы изобретения, а также аденовирусы, переконструированные, как описано, при введении их человеку не будут сталкиваться со значительным ингибиторным иммунным ответом, их общая трансдукционная эффективность и инфективность усилятся. Это позволяет предположить, что такие улучшенные аденовирусы могут служить, например, более эффективными вакцинами, поскольку их проникновению в клетки хозяина и экспрессии антигенной кассеты не будет препятствовать любой значительный титр нейтрализующих антител. К тому же, как показано в примерах, активный иммунный ответ против HIV(BH4)-gag индуцировался даже у незараженных мышей, вакцинированных рекомбинантным HIV-gag-кодирующим аденовирусом, который содержит гексон, пентон и фибер ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2 или PanAd3 изолята. Иммунный ответ, индуцированный аденовирусами ChAd55-gag, ChAd73-gag, ChAd83-gag, ChAd146-gag, ChAd147-gag, PanAd1-gag, PanAd2-gag и PanAd3-gag, сравним с иммунным ответом, наблюдавшимся в случае наиболее активных векторов, сконструированных до настоящего времени на основе рекомбинантного человеческого Ad5 вектора предшествующего уровня техники, экспрессирующего HIV-gag белок [см. данные иммуноферментного спот-анализа (ELIspot assay) на фиг.5A, 5B, 5C].

Как упоминалось ранее, гуморальный иммунный ответ, индуцируемый аденовирусом, направлен главным образом против трех основных аденовирусных структурных белков - гексона, пентона и фибера; все эти белки имеют полипептидные последовательности, которые являются частью аденовирусного капсида и которые экспонируются на наружной поверхности вирусной частицы (см. также: Madisch I. et al., J. Virol. 2005 Dec; 79(24): 15265-76; а также: Madisch I. et al., J Virol. 2007 Aug; 81(15):8270-81; и Pichla-Gollon SL et al., J. Virol. 2007 Feb; 81(4): 1680-9).

Как видно из множественного выравнивания последовательностей, показанного на фиг.1, изоляты новых аденовирусов группы PanAd1, PanAd2, PanAd3, ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146 и ChAd147 согласно настоящему изобретению совместно используют очень схожие последовательности белка гексона. При выравнивании отмечены и гипервариабельные области (HVR), которые локализуются в петлях на верхней части молекулы гексона, лежащих на наружной поверхности вириона и занимающих большую часть его поверхности (см. Jophn J. Rux et al., J. of Virology, Sept. 2003, Vol.77, No.17). Взаимное сходство последовательностей других капсидных белков (фибера и пентона) новых аденовирусов шимпанзе показано соответственно на фиг.2 и 3. Предполагается, что все три структурных капсидных белка участвуют в снижении серопревалентности, и поэтому могут использоваться независимо друг от друга или в комбинации друг с другом для подавления аффиности аденовируса к предсуществующим нейтрализующим антителам, например, для создания рекомбинантного химерного аденовируса с пониженной серопревалентностью.

Таким образом, в первом аспекте изобретение предлагает выделенный полинуклеотид, который кодирует аденовирусный белок фибер или его функциональное производное и который выбирается из группы, состоящей из:

(a) полинуклеотида, кодирующего полипептид, который имеет аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO:14-19, 50 и 53, т.е. SEQ ID NO:14, 15, 16, 17, 18, 19, 50 или 53;

(b) полинуклеотида, кодирующего функциональное производное полипептида согласно любой из SEQ ID NO:14-19, 50 и 53, т.е. SEQ ID NO:14, 15, 16, 17, 18, 19, 50 или 53, в котором указанное функциональное производное содержит делецию, инсерцию и/или замену одного или более аминокислотных остатков, и

(c) полинуклеотида, кодирующего функциональное производное, имеющее аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или, по меньшей мере, на 99%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 85% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 99% идентична по всей своей длине любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO:14-19, 50 и 53, т.е. SEQ ID NO:14, 15, 16, 17, 18, 19, 50 или 53.

Под "аденовирусным белком фибер" имеется в виду белок, имеющий форму нити с узловым утолщением «Knobbed fiber» (IV), который содержится в аденовирусе. В предпочтительном варианте выделенный полинуклеотид, описанный в первом аспекте изобретения и в предпочтительных вариантах его осуществления, раскрываемых ниже, кодирует белок фибер или его функциональное производное, которое выполняет ту же функцию, что и фибер или его фрагмент в инфекционном аденовирусном вирионе. Таким образом, рекомбинантный аденовирус, содержащий указанный белок фибер или функциональное