Модифицированные связывающие белки, ингибирующие взаимодействие vegf-a рецептора

Модифицированные связывающие белки, ингибирующие взаимодействие vegf-a рецептора

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение касается модифицированных рекомбинантных белков, специфичных к VEGF-A, а также фармацевтических композиций, содержащих такие белки, и применения таких белков в лечении опухолей и заболеваний глаз.

Предпосылки создания изобретения

Ангиогенез, рост новых кровеносных сосудов из уже существующих сосудов, является ключевым процессом при некоторых патологических состояниях, в том числе росте опухолей и заболеваниях глаз, в частности при глазных неоваскулярных заболеваниях, таких как возрастная дегенерация желтого пятна (AMD) или диабетический макулярный отек (DME) (Carmeliet, P., Nature 438, 932-936, 2005). Факторы роста эндотелия сосудов (VEGFs) стимулируют ангиогенез и лимфангиогенез путем активации рецептора VEGF (VEGFR) тирозинкиназ в клетках эндотелия (Ferrara, N., Gerber, H.P. and LeCouter, J., Nature Med. 9, 669-676, 2003).

Семейство VEGF млекопитающих состоит из пяти гликопротеинов, носящих названия VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D (также известный как FIGF) и фактор роста плаценты (P1GF, также известный как PGF). Было показано, что VEGF-A является эффективной мишенью для антиангиогенной терапии (Ellis, L.M. and Hicklin, D.J., Nature Rev. Cancer 8, 579-591, 2008). Лиганды VEGF-A связываются с и активируют три структурно подобные типа III рецептора тирозинкиназ, которые называются VEGFR-1 (также известный как FLT1), VEGFR-2 (также известный как KDR) и VEGFR-3 (также известный как FLT4). Лиганды VEGF имеют отличительные особенности, присущие каждому из этих рецепторов тирозинкиназы, которые способствуют разнообразию их функций. В ответ на связывание лигандов VEGFR тирозинкиназы активируют сеть различных нисходящих сигнальных путей. VEGFR-1 и VEGFR-2 являются в первую очередь найденными на эндотелии сосудов, тогда как VEGFR-3 встречается в основном на лимфатическом эндотелии. У всех данных рецепторов есть внеклеточный домен, одна трансмембранная область и общий типичный элемент структуры последовательности тирозинкиназ, прерванной за счет домена вставки киназы. Совсем недавно нейропилин (NRP-1), первоначально определенный как рецептор для семейства семафорин/коллапсин нейрональных медиаторов ведения, был показан как изоформный специфический рецептор VEGF-A.

Различные изоформы VEGF-A, как известно, являются образованными альтернативным сплайсингом из восьми экзонов с VEGF-A геном. Все изоформы содержат экзоны 1-5 и терминальный экзон, экзон 8. Экзоны 6 и 7, которые кодируют гепарин-связывающие домены, могут быть включены или исключены. Это дает начало семейству белков, названных в соответствии с их аминокислотным порядковым номером: VEGF-A165, VEGF-A121, VEGF-A189 и так далее. Экзон 8, однако, содержит два 3' сайта сплайсирования в нуклеотидных последовательностях, которые могут быть использованы клеткой для создания двух семейств изоформ с одинаковой длиной, но отличающихся С-терминальными аминокислотными последовательностями (Varey, A.H.R. et al., British J. Cancer 98, 1366-1379, 2008). VEGF-Axxx ("XXX" обозначает порядковый номер аминокислоты зрелого белка), проангиогенное семейство изоформ, является созданным путем использования наиболее проксимальной последовательности в экзоне 8 (в результате включения экзона 8а). Совсем недавно описанные антиангиогенные VEGF-Axxxb изоформы создаются путем использования дистального сайта сплайсирования, 66 базовая точка далее за геном от проксимального сайта сплайсирования. Это в результате приводит к сплайсингу экзона 8а и продуцированию последовательности мРНК, которая кодирует VEGF-Axxxb семейство. VEGF-A165 является доминирующей проангиогенной изоформой и обычно избыточно экспрессируется в различных солидных опухолях человека. VEGF-A165b был первым из определенных экзон-8b-кодированных изоформ и было показано, что они имеют анти-ангиогенные эффекты (Varey et al., loc. cit; Konopatskaya, O. et al., Molecular Vision 12, 626-632, 2006). Это эндогенная ингибирующая форма VEGF-A, которая уменьшает VEGF-A, индуцировавшую пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток. Хотя он может связываться с VEGFR-2, VEGF-A165b, связывание в результате не приводит к фосфорилированию рецептора или активации нисходящих сигнальных путей.

Существует несколько подходов к ингибированию VEGF-A сигнальной системы, в том числе нейтрализация лиганда или рецептора антител и блокирование активации VEGF-рецептора и сигнальной системы ингибиторами тирозинкиназы. Показано, что VEGF-направленная терапия является эффективной как ионотерапия при AMD, DME, почечно-клеточной карциноме и гепатоцеллюлярной карциноме исходя из того, что это является преимуществом только в сочетании с химиотерапией у пациентов с метастатическим колоректальным раком, не-мелкоклеточным раком легких и метастатическим раком молочной железы (Narayanan, R. et al., Nat Rev. Drug Discov. 5, 815-816, 2005; Ellis and Hicklin, в цитируемом месте).

Помимо антител, другие связывающие домены могут быть использованы для нейтрализации лиганда или рецептора (Skerra, A., J. Mol. Recog. 13,167-187,2000; Binz, H.K., Amstutz, P. and Pluckthun, A., Nat. Biotechnol. 23, 1257-1268, 2005). Один такой новый класс связывающих доменов основывается на сконструированных повторяющихся доменах (WO 02/20565; Binz, H.K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, М. Т., Briand, С., Forrer, P., Grutter, М. G., and Pluckthun, A., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004). WO 02/20565 описывает, как могут быть сконструированы большие библиотеки повторяющихся белков и их общее применение. Тем не менее, WO 02/20565 совсем не раскрывает выбор повторяющихся доменов со специфичностью связывания для VEGF-Аххх, ни конкретных мотивов повторяющейся последовательности повторяющихся доменов, которые специфически связываются с VEGF- Аххх.

Направленный VEGF-A с текущей доступной терапией не является эффективным у всех больных или для всех заболеваний (например, EGFR-экспрессирующего рака). Стало даже все в большей степени очевидным, что терапевтический эффект, связанный с VEGF-направленной терапией, является сложным и, вероятно, включает разнообразные механизмы (Ellis and Hicklin, цит. место). Например, существующие на рынке анти-VEGF лекарственные средства, такие как бевацизумаб (Авастин®) или ранибизумаб (Луцентис®) (смотри WO 96/030046, WO 98/045331 и WO 98/045332) или лекарственные средства, находящиеся в клинической разработке, такие как VEGF-Trap® (WO 00/075319) не делают различия между про- и анти-ангиогенными формами VEGF-A, таким образом они ингибируют обе формы. В результате, они ингибируют ангиогенез, но, кроме того, лишают здоровые ткани существенного фактора выживания, а именно VEGF-Axxxb, что в результате приводит к цитотоксичности и ограничивающим дозу побочным эффектам, которые, в свою очередь, ограничивают эффективность. Побочными эффектами, общими для существующих анти-VEGF терапий, являются желудочно-кишечные перфорации, кровотечения, артериальная гипертензия, случаи тромбоэмболии и протеинурия (Kamba, Т. and McDonald, D.M., Br. J. Cancer 96, 1788-95, 2007). Другое существующее на рынке анти-VEGF лекарственное средство для лечения AMD является пегаптанибом (WO 98/018480; Макуген®, зарегистрированная торговая марка компании Pfizer). Пегаптаниб является пегилированным анти-VEGF аптамером, одна молекулярная цепь нуклеиновой кислоты, которая специфично связывается с белком-мишенью. Для лечения неоваскулярной AMD существует достаточно доказательств того, что наблюдаемые результаты с Луцентис® превосходят те, что с Макуген®, и нет определенных доказательств, которые предполагают разницу в безопасности между препаратами. В результате, Макуген® не является часто используемым в терапии данного заболевания.

В целом, существует потребность в улучшенных анти-ангиогенных агентах для лечения рака и других патологических состояний.

Техническая проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, - определение новых анти-ангиогенных агентов, таких как повторяющиеся домены со специфичностью связывания с VEGF-Axxx, для улучшения лечения рака и других патологических состояний, например глазных болезней, таких как AMD или DME. Решение данной технической проблемы достигается путем обеспечения вариантов осуществления, представленных в формуле изобретения.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение касается рекомбинантных связывающих белков, которые содержат анкириновый повторяющийся домен и часть полиэтиленгликоля молекулярной массой не менее 5 кДа, в котором указанный анкириновый домен связывает VEGF-Axxx с K_d меньше 10^-9 М и ингибирует VEGF-Axxx связывание с VEGFR-2.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения часть полиэтиленгликоля связана с одним остатком Cys связывающего домена.

Кроме того, изобретение касается фармацевтической композиции, содержащей один или более из указанных выше связывающих белков или молекул нуклеиновых кислот.

Кроме того, изобретение касается способа лечения рака и других патологических состояний, например глазных заболеваний, таких как AMD или DME, с использованием связывающих белков изобретения.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Специфический VEGF-A164 собаки связывания выбранных сконструированных анкириновых повторяющихся белков.

Взаимодействие выбранных клонов с VEGF-A164 (VEGF) собаки и отрицательным контрольным белком (MBP, Escherichia coli мальтоза связывающий белок) показывают с помощью сырого экстракта ИФА. Биотинилированные VEGF-A164 и MBP собаки были иммобилизованы на нейтравидине. Числа относятся к единичным DARPin клонам, выбранным в рибосоме, проявляемым по отношению к VEGF-A164 собаки или соответствующего VEGF-A165 человека.

А = Поглощение. Белые столбцы показывают связывание с VEGF-A164 собаки, черные столбцы показывают неспецифический фон связывания с MBP.

Фигура 2. Ингибирование разрастания сфероида с помощью выбранных DARPin.

Длина отростков при ингибировании сфероидного разрастания демонстрируется в присутствии различных концентраций (a) DARPin #30 (аминокислоты с 1 по 126 из SEQ ID NO:4), DARPin со специфичностью к VEGF-Axxx, или (b) DARPin NC, отрицательного контроля DARPin без специфичности к VEGF-Axxx.

Фигура 3. Специфическое распознавание VEGF-A изоформ.

Поверхностно-плазменный резонансный (SPR) анализ связывающих белков на VEGF-A изоформы.

(а) и (b): SPR анализ Авастин®. 250 нМ Авастина® был применен к проточной ячейке с иммобилизованными VEGF-A164 собаки (а) или VEGF-A164b собаки (b) в течение 100 секунд, с последующим промыванием буферным потоком.

(с) и (d): SPR анализ DARPin #27 (аминокислоты с 1 по 159 из SEQ ID NO:1). 250 нМ DARPin #27 применяли к проточной ячейке с иммобилизованными VEGF-A164 собаки (с) или VEGF-A164b собаки (г) в течение 100 секунд, с последующим промыванием буферным потоком.

РЕ = Резонансные единицы.

Фигура 4. Эффективное ингибирование VEGF-A165 человека в глазу кролика.

Сосудистые модели блокирования биохимического процесса мутацией на кроликах, чтобы показать эффективность DARPin в ингибировании VEGF-A165 человека в глазу по сравнению с Луцетисом®. В 1-й день либо PBS, DARPin #30 или Луцетисом® применяют путем инъекции в стекловидное тело в один глаз каждого кролика (обработанный глаз). На 4-й день или 30 день делали инъекции в стекловидное тело обоих глаз каждого кролика по 500 нг VEGF-A165 человека. Все глаза были оценены через 48 часов после инъекций VEGF-A165 путем измерения содержания флуоресцеина в стекловидном теле и сетчатке всех глаз через один час после внутривенного инъекционного введения флуоресцеина натрия.

R = отношение измеренного количества флуоресцеина в обработанном глазу/ необработанном глазу. Стандартные отклонения показаны с помощью величины погрешности. 4-PBS = соотношение через 4 дня после инъекции PBS (контроль); 4-D = соотношение через 4 дня после инъекции DARPin #30, 30-D = соотношение через 30 дней после инъекции DARPin #30, 4-L = соотношение через 4 дня после введения Луцетиса®; 30-L = соотношение через 30 дней после инъекции Луцетиса®.

Детальное описание изобретения

VEGF-A млекопитающих существует в виде двух семейств альтернативных сплайсированных изоформ: (i) про-ангиогенных "VEGF-Axxx" изоформ, образованных путем проксимального сплайсинга экзона 8 и (ii) анти-ангиогенных "VEGF-Axxxb" изоформ, образованных путем дистального сплайсинга экзона 8. Предпочтительно, связывающий домен в соответствии с изобретением является специфическим для про-ангиогенных VEGF-Axxx происхождения от собаки, кролика, обезьяны или человека. Более предпочтительно, связывающий домен в соответствии с изобретением является специфическим для про-ангиогенных VEGF-Axxx человеческого происхождения. Наиболее предпочтительно, связывающий домен в соответствии с изобретением является специфическим для VEGF-A165 человека.

Термин "белок" относится к полипептиду, в котором по меньшей мере часть полипептида имеет или способна приобретать определенное трехмерное расположение путем образования вторичных, третичных или четвертичных структур внутри и/или между его полипептидной(ыми) цепи(ями). Если белок содержит два или более полипептида, отдельные полипептидные цепи могут быть нековалентно или ковалентно связаны, например, за счет дисульфидной связи между двумя полипептидами. Часть белка, каждая из которых индивидуально имеет или способна приобрести определенное трехмерное расположение путем образования вторичных или третичных структур, называется "доменом белка". Такие домены белка хорошо известны практикующим квалифицированным специалистам в данной области из уровня техники.

Термин "рекомбинантный", как например в словосочетаниях рекомбинантный белок, рекомбинантный домен белка и тому подобных, означает, что указанные полипептиды продуцируются путем использования технологий рекомбинантных ДНК, хорошо известных практикующим квалифицированным специалистам в данной области из уровня техники. Например, рекомбинантные молекулы ДНК (например, продуцированные путем генного синтеза), кодирующие полипептид, могут быть клонированы в бактериальный экспрессионный плазмид (например, pQE30, Qiagen). Когда такой сконструированный рекомбинантный экспрессионный плазмид вводится в бактерии (например, Е. coli), эти бактерии могут продуцировать полипептид, кодируемый этой рекомбинантной ДНК. Соответственно, продуцированный полипептид называется рекомбинантным полипептидом.

Термин "полипептидная метка" относится к аминокислотной последовательности, присоединенной к полипептиду/белку, в котором указанную аминокислотную последовательность используют для очистки, обнаружения или нацеливания указанного полипептида/белка, или в котором указанная аминокислотная последовательность совершенствует физико-химическое поведение полипептида/ белка, или в котором указанная аминокислотная последовательность обладает эффекторной функцией. Отдельные полипептидные метки, фрагменты и/или домены связывающего белка могут быть связаны друг с другом непосредственно или через полипептидные линкеры. Данные полипептидные метки всецело хорошо известны в данной области из уровня техники и являются полностью доступными для квалифицированного специалиста в данной области с уровня техники. Примерами полипептидных меток являются небольшие полипептидные последовательности, например His, myc, FLAG или Strep-метки или фрагменты, такие как ферменты (например, ферменты, такие как щелочная фосфатаза), которые позволяют обнаружение указанного полипептида/белка, или фрагменты, которые могут быть использованы для маркирования (например, иммуноглобулины или их фрагменты) и/или как эффекторные молекулы.

Термин "полипептидный линкер" относится к аминокислотной последовательности, которая способна связывать, например, два белковых домена, полипептидную метку и белковый домен, белковый домен и неполипептидной фрагмент, такой как полиэтиленгликоль, или две метки последовательностей. Такие дополнительные домены, метки, неполипептидные фрагменты и линкеры известны квалифицированным специалистам в данной области из уровня техники. Список примеров приводится в описании патентной заявки WO 02/20565. Конкретными примерами таких линкеров являются глицин-серин-линкеры и пролин-треонин-линкеры переменной длины, предпочтительно указанные линкеры имеют длину от 2 до 24 аминокислот, более предпочтительно указанные линкеры имеют длину от 2 до 16 аминокислот.

В контексте настоящего изобретения термин "полипептид" относится к молекуле, состоящей из одной или нескольких цепей со сложной структурой, то есть две или более аминокислоты, связанные посредством пептидных связей. Предпочтительно, полипептид состоит из более чем восьми аминокислот, связанных посредством пептидных связей.

Термин «полимерный фрагмент» относится или к белковому полимерному фрагменту или небелковому полимерному фрагменту. "Белковый полимерный фрагмент" предпочтительно представляет собой полипептид, который не образует стабильной третичной структуры, в то же время не образует более чем на 10% (предпочтительно, не более чем на 5%, также предпочтительно, не более чем на 2%, еще более предпочтительно, не более 1%, и наиболее предпочтительно необнаруживаемые количества, как определено с помощью размерной эксклюзионной хроматографии (гель-хроматографии SEC)) олигомеров или агрегатов в процессе хранении при концентрации около 0,1 мМ в PBS при комнатной температуре в течение одного месяца. Такие белковые полимерные фрагменты протекают при средней (кажущейся) молекулярной массе в SEC, которая является более высокой, чем их эффективная молекулярная масса, когда используются глобулярные белки как стандарты молекулярной массы для SEC. Предпочтительно, средняя молекулярная масса указанных белковых полимерных фрагментов, определенных с помощью SEC, является в 1,5х, 2х или 2,5х выше, чем их эффективная молекулярная масса, рассчитанная по их аминокислотной последовательности. Также предпочтительно, средние молекулярные массы указанных небелковых полимерных фрагментов, определенных с помощью SEC, является в 2х, 4х или 8х выше, чем их эффективная молекулярная масса, рассчитанная исходя из их молекулярного состава. Предпочтительно, более чем 50%, 70% или даже 90% аминокислот указанного белкового полимерного фрагмента не образуют стабильных вторичных структур при концентрации около 0,1 мМ в PBS при комнатной температуре, как это определено путем измерений кругового дихроизма (КД). Наиболее предпочтительно, указанный белковый полимер показывает типичные в ближней УФ КД-спектры случайной конформации спирали. Такие анализы КД хорошо известны квалифицированным специалистам в данной области из уровня техники. Также предпочтительными являются белковые полимерные фрагменты, которые состоят из более чем 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 или 800 аминокислот. Примерами белковых полимерных фрагментов являются XTEN® (зарегистрированный товарный знак Амуникс, WO 07/103515) полипептиды или полипептиды, содержащие остатки пролина, аланина и серина, как описано в WO 08/155134. Такие белковые полимерные фрагменты могут быть ковалентно связаны, например, со связывающим доменом изобретения путем образования генетических слитых полипептидов с использованием стандартных технологий клонирования ДНК, с последующей их стандартной экспрессией и очисткой. Примеры связывающих белков, содержащих повторяющиеся домены, связывающие VEGF-Axxx и такой белковый полимерный фрагмент, представлены в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:4. Положения аминокислот с 1 по 159 в SEQ ID NO:1 соответствуют повторяющемуся домену, и положения аминокислот с 161 до 1'025 в SEQ ID NO:1 соответствуют белковому полимерному фрагменту. Положения аминокислот с 1 по 126 в SEQ ID NO:4 соответствуют повторяющемуся домену, и положения аминокислот с 131 по 640 в SEQ ID NO:4 соответствуют белковому полимерному фрагменту.

Полимерный фрагмент изобретения может варьировать в широких пределах молекулярной массы (то есть от примерно 1 кДа до примерно 150 кДа). Предпочтительно, полимерный фрагмент имеет молекулярную массу по меньшей мере 2, 5, 10, 20, 30, 50, 70 или 100 кДа.

Предпочтительно, указанный полимерный фрагмент является связанным посредством полипептидного линкера со связывающим доменом. Примерами таких полипептидных линкеров являются аминокислоты с 1 по 8 из SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:9.

Примерами небелковых полимерных фрагментов являются гидроксиэтилкрахмал (HES), полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль или полиоксиалкилен. Термин "ПЭГилированный" означает, что ПЭГ-фрагмент ковалентно связан, например, с полипептидом данного изобретения. Примерами повторяющихся белков, содержащих полипептидный линкер между повторяющимся доменом и С-терминальным Cys остатком, пригодным для связывания небелкового полимерного фрагмента, являются SEQ ID NO:2, 3, 5, 6 и 7.

В конкретном варианте осуществления изобретения ПЭГ фрагмент или какой-либо другой небелковый полимер может, например, связывать тиол цистеина посредством малеимидного линкера с цистеином, который соединен посредством пептидного линкера с N- или С-концом связывающего домена, как описано в данном документе (например, SEQ ID NO:3).

Термин "связывающий белок" относится к белку, содержащему один или более связывающих доменов и один или более полимерные фрагменты, как далее объясняется. Предпочтительно, указанный связывающий белок содержит до четырех связывающих доменов. Более предпочтительно, указанный связывающий белок содержит до двух связывающих доменов. Наиболее предпочтительно, указанный связывающий белок содержит только один связывающий домен. Кроме того, какой-либо такой белок может содержать дополнительные белковые домены, которые не являются связывающими доменами, мультимеризационными фрагментами, полипептидными метками, полипептидными линкерами и/или одним Cys остатком. Примерами мультимеризационных фрагментов являются константные области тяжелой цепи иммуноглобулина, которые спариваются, чтобы обеспечить функциональные Fc домены иммуноглобулина и лейциновые зипперы или полипептиды, содержащие свободный тиол, который образует межмолекулярные дисульфидные связи между двумя такими полипептидами. Единственный Cys остаток может быть использован для сопряжения других фрагментов с полипептидами, например, путем использования малеимидной химии, хорошо известной квалифицированному специалисту в данной области из уровня техники.

Предпочтительно, указанный связывающий белок содержит до четырех полимерных фрагментов. Более предпочтительно, указанный связывающий белок содержит до двух полимерных фрагментов. Наиболее предпочтительно, указанный связывающий белок содержит только один полимерный фрагмент.

Также предпочтительно, указанный связывающий белок имеет среднюю молекулярную массу по меньшей мере 70, 100, 200, 300, 500 или 800 кДа, когда анализировали при концентрации 0,1 мМ в PBS при комнатной температуре с помощью SEC, с использованием глобулярных белков как стандартов молекулярной массы.

Термин «связывающий домен» означает белковый домен, демонстрирующий один и тот же "изгиб" (трехмерное расположение), как и белковый скаффолд и имеющий предопределенное свойство, как определено ниже. Такой связывающий домен может быть получен путем рациональных или, чаще всего, комбинаторных методов белковой инженерии, которые известны квалифицированному специалисту в данной области из уровня техники (Skerra, 2000, цит. месте; Binz et al., 2005, цит. месте). Например, связывающий домен, имеющий предопределенное свойство, может быть получен способом, который включает следующие стадии: (а) получение разнообразной коллекции белковых доменов, демонстрирующих один и тот же изгиб, как и белковый скаффолд, как далее определено ниже, и (б) скрининг указанной разнообразной коллекции и/или отбор из указанной разнообразной коллекции, чтобы получить по меньшей мере один белковый домен, имеющий указанное предопределенное свойство. Разнообразная коллекция белковых доменов может быть обеспечена несколькими методами в соответствии со скринингом и/или используемой система отбора и может включать использование методов, хорошо известных квалифицированному специалисту в данной области из уровня техники, таких как отображение фагов или рибосомный дисплей.

Термин "белковый скаффолд" означает белок с открытыми областями поверхности, в которых аминокислотные включения, замещения или удаления являются весьма приемлемыми. Примерами белковых скаффолдов, которые могут быть использованы для создания связывающих доменов настоящего изобретения, являются антитела или их фрагменты, такие как одноцепочечные Fv или Fab фрагменты, белок А из Staphylococcus aureus, билиновый связывающий белок из Pieris brassicae или другие липокалины, анкириновые повторяющиеся белки или другие повторяющиеся белки и фибронектин человека. Белковые скаффолды известны квалифицированным специалистам в данной области из уровня техники (Binz et al., 2005, цит. место; Binz et al., 2004, цит. мест.).

Термин "предопределенное свойство" относится к свойству, такому как связывание с мишенью, блокирование мишени, активация мишень опосредованной реакции, ферментативная активность, и связанные с ними дополнительные свойства. В зависимости от типа требуемого свойства квалифицированный специалист сможет определить формат и необходимые стадии для проведения скрининга и/или отбора связывающего домена с требуемым свойством. Предпочтительно, предопределенным свойством является связывание с мишенью.

Предпочтительно, связывающий белок данного изобретения не является антителом или его фрагментом, таким как Fab или ScFv фрагментами. Антитела и их фрагменты хорошо известны квалифицированному специалисту в данной области из уровня техники.

Также предпочтительно, связывающий домен данного изобретения не содержит иммуноглобулиновую складку, как такой, что присутствует в антителах и/или фибронектиновом домене типа III. Иммуноглобулиновая складка является общей для всей-β белковой складки, которая состоит из двухслойного сэндвича около 7 антипараллельных β-нитей, расположенных в двух β-листах. Иммуноглобулиновые складки хорошо известны квалифицированному специалисту в данной области из уровня техники. Например, такие связывающие домены, содержащие иммуноглобулиновую складку, описаны в WO 07/080392 и WO 08/097497.

Кроме того, предпочтительно, связывающий домен данного изобретения не содержит иммуноглобулин-подобный домен, которые найдены в VEGFR-1 или VEGFR-2. Такие связывающие домены описаны в WO 00/075319.

Предпочтительным связывающим доменом является связывающий домен, имеющий анти-ангиогенного эффекты. Анти-ангиогенный эффект связывающего домена может быть определен путем анализа, как хорошо известно квалифицированному специалисту в данной области из уровня техники, такого как анализ прорастания HUVEC сфероидов, описанного в примере 2.

Кроме того, предпочтительным является связывающий домен, содержащий от 70 до 300 аминокислот, в частности от 100 до 200 аминокислот.

Кроме того, предпочтительным является связывающий домен, лишенный свободного Cys остатка. Свободный Cys остаток не участвует в формировании дисульфидных связей. Еще более предпочтительным является связывающий домен, не имеющий какого-либо Cys остатка.

Предпочтительным связывающим доменом данного изобретения является повторяющийся домен или сконструированный повторяющийся домен, предпочтительно, как описано в WO 02/20565.

Особенно предпочтительным связывающим доменом является сконструированный анкириновый повторяющийся домен (Binz, Н.K. et al., 2004, цит. мест.), предпочтительно, как описано в WO 02/20565. Примеры сконструированных анкириновых повторяющихся доменов показаны в примерах.

Определения в дальнейшем для повторяющихся белков основываются на тех, что приведены в заявке на патент WO 02/20565. Кроме того, заявка на патент WO 02/20565 содержит общее описание особенностей повторяющегося белка, методов и применений.

Термин "повторяющиеся белки " относится к белку, содержащему один или более повторяющихся доменов. Предпочтительно, каждый из указанных повторяющихся белков содержит до четырех повторяющихся доменов. Более предпочтительно, каждый из указанных повторяющихся белков содержит до двух повторяющихся доменов. Наиболее предпочтительно, каждый из повторяющихся белков содержит только один повторяющийся домен. Кроме того, указанный повторяющийся белок может содержать дополнительные неповторяющиеся белковые домены, полипептидные метки и/или полипептидные линкеры.

Термин " повторяющийся домен" относится к белковому домену, содержащему две или более последовательных повторяющихся единицы (модуля), как структурные единицы, в которых указанные структурные единицы имеют одинаковую складку и складываются плотно, чтобы создать, например, сверхспиралевидные структуры, имеющие совместный гидрофобный центр.

Термины "сконструированный повторяющийся белок" и "сконструированный повторяющийся домен" относятся к повторяющемуся белку или повторяющемуся домену, соответственно, полученному как результат по методикам изобретения, описанный в заявке на патент WO 02/20565. Сконструированные повторяющиеся белки и сконструированные повторяющиеся домены являются синтетическими, а не полученными природным путем. Они являются созданными человеком белками или доменами, соответственно, полученными путем экспрессии соответствующих сконструированных нуклеиновых кислот. Предпочтительно, экспрессию осуществляют в эукариотических или прокариотических клетках, таких как бактериальные клетки, или путем использования бесклеточной in vitro экспрессионной системы.

Термин "структурная единица" относится к локально упорядоченной части полипептида, образованной трехмерными взаимодействиями между двумя или более сегментами вторичной структуры, которые находятся вблизи друг от друга вдоль полипептидной цепи. Такая структурная единица демонстрирует структурный мотив. Термин «структурный мотив» относится к трехмерному расположению элементов вторичной структуры, присутствующему по меньшей мере в одной структурной единице. Структурные мотивы хорошо известны квалифицированным специалистам в данной области из уровня техники. Структурные единицы сами по себе не являются способными приобретать определенное трехмерное расположение, однако их последовательное расположение, например как повторяющиеся модули в повторяющихся доменах, приводит к взаимной стабилизации соседних единиц, что в результате приводит к сверхспиралевидной структуре.

Термин "повторяющаяся единица" относится к аминокислотным последовательностям, содержащим повторяющиеся мотивы последовательности одного или более встречающихся в природе белков, в которых указанные "повторяющиеся единицы" встречаются в нескольких экземплярах и которые демонстрируют определенную топологию складывания, общую для всех указанных мотивов, определяющих складку белка. Примерами таких повторяющихся единиц являются повторяющиеся единицы броненосца, богатые лейцином повторяющиеся единицы, анкириновые повторяющиеся единицы, тетра-три-со-пептидные повторяющиеся единицы, HEAT повторяющиеся единицы и богатые лейцином вариантные повторяющиеся единицы. Встречающиеся в природе белки, содержащие две или более таких повторяющихся единицы, называют "встречающимся в природе повторяющимся белком". Аминокислотные последовательности отдельных повторяющихся единиц повторяющегося белка могут иметь значительное число мутаций, замещений, добавлений и/или удалений, когда сравниваются друг с другом, в то же время существенно сохраняя общую картину, или мотив, из повторяющихся единиц.

Предпочтительно, повторяющиеся единицы, использованные для вычитания повторяющихся мотивов последовательности, являются гомологичными повторяющимися единицами, полученными из повторяющихся доменов, которые выбирают на мишени, например, как описано в примере 1 и имеющими такую же специфичность к мишени.

Термин "повторяющийся мотив последовательности" относится к аминокислотной последовательности, которую выводят из одной или более повторяющихся единиц. Предпочтительно, указанные повторяющиеся единицы являются от повторяющихся доменов, имеющих специфичность связывания для такой же мишени. Термин " топология складывания" относится к третичной структуре указанных повторяющихся единиц. Топология складывания будет определяться участками аминокислот, образующих по меньшей мере части α-спирали или β-листов, или аминокислотными участками, образующими линейные полипептиды или петли, или какую-либо комбинацию α-спиралей, β-листов и/или линейных полипептидов/петель.

Термин «последовательный» относится к расположению, в котором повторяющиеся единицы или повторяющиеся модули располагаются в тандеме. В сконструированных повторяющихся белках существует по меньшей мере 2, как правило от около 2 до 6, в частности по меньшей мере, около 6, часто 20 или более повторяющихся единиц. В большинстве случаев, повторяющиеся единицы будут демонстрировать высокую степень идентичности последовательностей (те же самые аминокислотные остатки в соответствующих положениях) или сходство последовательностей (аминокислотные остатки, будучи разными, но имеющие сходные физико-химические свойства), и некоторые из аминокислотных остатков могут быть ключевыми остатками, строго сохраняющимися в различных повторяющихся единицах, найденных в белках, встречающихся в природе. Тем не менее, высокая степень изменчивости последовательности путем аминокислотных включений и/или удалений, и/или замещений между различными повторяющимися единицами, найденными в белках, встречающимися в природе, будет возможной до тех пор, пока сохраняется общая топология складывания.

Методы прямого определения топологии складывания повторяющихся белков с помощью физико-химических методов, таких как рентгеновская кристаллография, ЯМР-спектроскопия или КД-спектроскопия (кругового дихроизма), хорошо известны практикующим квалифицированным специалистам в данной области из уровня техники. Методы идентифицирования и определения повторяющихся единиц или повторяющихся мотивов последовательности или для идентифицирования семейств родственных белков, содержащих такие повторяющиеся единицы или мотивы, такие как поиск гомологии (BLAST и т.д.), являются хорошо установленными в области биоинформатики, а также хорошо известны практикующим специалистам в данной области из уровня техники. Стадия усовершенствования исходного повторяющегося мотива последовательности может включать повторяющийся процесс.

Термин "повторяющиеся модули" относится к повторяемым аминокислотным последовательностям сконструированных повторяющихся доменов, которые изначально являются производными от повторяющихся единиц повторяющихся белков, которые встречаются в природе. Каждый повторяющийся модуль, который входит в состав повторяющегося домена, является производным от одной или более повторяющихся единиц семейства или подсемейства встречающихся в природе повторяющихся белков, например семейства повторяющихся белков броненосцев или анкириновых повторяющихся белков.

"Повторяющиеся модули" могут включать положения с аминокислотными остатками, присутствующими во всех копиях соответствующих повторяющихся модулей ("фиксированные положения") и положения с различными или "рандомизированными" аминокислотными остатками («рандомизированные положения»).

Термин «кэппирующий модуль" относится к полипептиду, слитому с N- или С-терминальным повторяющимся модулем повторяющегося домена, в котором указанный кэппирующий модуль образует устойчивые третичные взаимодействия с указанным повторяющимся модулем, обеспечивая тем самым кэп, который защищает гидрофобный центр указанного повторяющегося модуля со стороны, которая не контактирует с последовательным повторяющимся модулем, от растворителя. Указанный N- и/или С-терминальный кэппирующий модуль может быть или может быть производным от, кэппирующей единицей или другим доменом, найденным в повторяющемся белке, который встречается в природе, расположенным рядом с повторяющейся единицей. Термин «кэппирующая единица» относится к встречающемуся в природе складчатому полипептиду, в котором указанный полипептид определяет специфическую структурную единицу, которая является N- или С-терминально слитой с повторяющейся единицей, в которой указанный полипептид образует устойчивые третичные взаимодействия с указанной повторяющейся единицей, обеспечивая тем самым кэп, который защищает гидрофобный центр указанной повторяющейся единицы с одной стороны, от растворителя. Такие кэппирующие единицы могут иметь сходства последовательности с указанным повторяющимся мотивом последовательности. Кэппирующие модули и кэппирующие повторяющиеся описаны в WO 02/020565. Например, N-терминальный кэппирующий модуль SEQ ID NO:2 кодируется посредством аминокислот от положения 1 до 32. Кром