Штамм анаэробных бактерий clostridium tyrobutyricum - продуцент масляной кислоты и способ микробиологического синтеза масляной кислоты с использованием этого штамма

Штамм анаэробных бактерий clostridium tyrobutyricum - продуцент масляной кислоты и способ микробиологического синтеза масляной кислоты с использованием этого штамма

Реферат

Штамм анаэробных бактерий Clostridium tyrobutyricum - продуцент масляной кислоты и способ микробиологического синтеза масляной кислоты с использованием этого штамма.

Группа заявляемых изобретений относится к биотехнологии, в частности, к производству масляной кислоты путем ферментации углеводосодержащего сырья микроорганизмами и представляет собой штамм анаэробных бактерий Clostridium tyrobutyricum, продуцирующий масляную кислоту и устойчивый к ее повышенным концентрациям (до 2 об. % включительно), а также способ микробиологического синтеза масляной кислоты с использованием этого штамма, позволяющий синтезировать масляную кислоту практически без побочных продуктов ферментации (селективность до 100%)).

Масляная кислота (С₃Н₇СООН) - четырехуглеродная монокарбоновая кислота, которую широко применяют в различных отраслях промышленности для производства пластмасс, пластификаторов, ПАВ, лаков, духов, фармацевтических препаратов, кормовых добавок, а также в качестве вкусового компонента в кормовых продуктах (Dwidar et al., 2012). В ряде публикаций приведены сведения о противоопухолевой активности масляной кислоты (Hamer et al., 2008). Это соединение используют также для производства этилбутирата и бутилбутирата, которые после химической конверсии могут служить в качестве топлива (Dwidar et al., 2012). Масляная кислота является субстратом для получения бутанола - перспективного топлива нового поколения.

В промышленных масштабах масляную кислоту получают путем каталитического окисления масляного альдегида или бутанола; последний, в свою очередь, синтезируют из пропилена (Dwidar et al., 2012). Химический синтез из указанных нефтепродуктов применяют главным образом из-за приемлемой себестоимости производства и доступности исходных материалов.

Другой способ получения масляной кислоты - ферментация углеводосодержащего сырья с использованием маслянокислых бактерий. В настоящее время микробиологический способ синтеза масляной кислоты привлекает все больше внимания из-за доступности сырья - сахаров, получаемых из возобновляемой растительной биомассы, и необходимости защиты окружающей среды от загрязнения продуктами химического синтеза (Аблаев и др., 2014).

Однако производство масляной кислоты ферментативным путем с использованием существующих промышленных штаммов бактерий рода Clostridium экономически невыгодно. Главными причинами этого являются:

- невысокая производительность штаммов, обусловленная их чувствительностью к конечному продукту ферментации - масляной кислоте, и

- синтез в процессе ферментации значительного количества побочных продуктов, наличие которых в конечном продукте повышает стоимость его очистки, так как снижает степень конверсии субстрата в целевой продукт.

Ключевой путь биосинтеза масляной кислоты у бактерий рода Clostridium сопряжен с жизненно важными процессами поддержания внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса и генерации энергии. Вмешательство в функционирование данного пути с нарушением его сложных взаимосвязей в ряде случаев приводит к резкому ухудшению физиологических характеристик соответствующих мутантных штаммов (Liu et al., 2006; Cai et al., 2014).

Применение методов генной инженерии в целях модификации метаболических путей бактерий рода Clostridium представляет собой непростую задачу, поскольку биохимия маслянокислого брожения штаммоспецифична и генетика специфичности недостаточно изучена. Сведений о штаммах, синтезирующих масляную кислоту без побочных продуктов, обнаружить не удалось.

В статье (Zhu et al., 2005) изложен способ увеличения выхода масляной кислоты через блокирование образования уксусной кислоты путем инактивации гена фосфотрансацетилазы. Полученые мутантные штаммы С. tyrobutyricum (АТСС 25755) синтезировали 35,2 г/л масляной кислоты против 20,2 г/л у штамма дикого типа, и коэффициент конверсии 0,78 против 0,68 мол/мол соответственно. Образование побочного продукта - уксусной кислоты у этих штаммов не было полностью исключено.

Такой же подход применен для гена ацетаткиназы на штамме С. tyrobutyricum (АТСС 25755) (Liu et al., 2006). Мутантный штамм растет медленнее исходного, однако производит на 23,5% больше масляной кислоты.

Известен способ повышения продуктивности синтеза масляной кислоты бактериями рода Clostridium путем повышения методами метаболической инженерии их устойчивости к высоким концентрациям масляной кислоты. (US 20110151529). А именно методом инсерционного мутагенеза (US 20110151529) получены штаммы С. tyrobutyricum PAK-Em, PPTA-Em, HydEm, ACK-Tet и TAT-ACK-Tet с инактивированными генами фосфотрансацетилазы или ацетаткиназы. Оба мутанта росли медленнее штамма дикого типа, хотя уровень синтеза масляной кислоты у них повысился на 50% до 43.4 г/л при ферментации на глюкозе.

Предпочтительным для получения эффективных продуцентов масляной кислоты у бактерий рода Clostridium является использование методов ступенчатой селекции, позволяющих адаптивно отбирать в клетках штамма множественные мутации, в совокупности обеспечивающие накопление целевых модификаций.

Имеются сведения об устойчивых к масляной кислоте штаммах бактерий рода Clostridium, полученных путем мутагенеза. В частности, метод радиационного мутагенеза использован для улучшения штамма С. tyrobutyricum АТСС 25755 (Zhou et al., 2014). После облучения 2С6+-ионами клетки штамма приобрели устойчивость к росту на среде с концентрацией масляной кислоты 10,8 г/л, в то время как штамм дикого типа останавливал рост при концентрации 3,6 г/л. После облучения ионами с энергией 114 мегаэлектронвольт и дозе 40 Грей скорость роста культуры снизилась на 50%, а синтез масляной кислоты увеличился на 68% по сравнению со штаммом дикого типа.

Стратегия адаптивной лабораторной эволюции (направленной ступенчатой селекции) представляется удобным и естественным инструментом получения устойчивых штаммов, без применения методов генетической инженерии. Иммобилизация в реакторе с волоконным носителем позволила успешно отобрать штамм С. tyrobutyricum, устойчивый к более чем 30 г/л масляной кислоты, что в 29 раз превышает устойчивость штамма дикого типа (Zhu and Yang., 2003). Полученный штамм обладал в 1,5 раза большей скоростью роста, чем исходный. Ключевые ферменты метаболического пути биосинтеза масляной кислоты - фосфотрансбутилаза и бутират киназа у него также оказались более активными по сравнению с исходным штаммом С. tyrobutyricum АТСС 25755 - на 175% и 146%. Фермент АТФаза у этого штамма менее чувствителен к масляной кислоте и более устойчив к селективному ингибитору N,N′-дициклогексилкарбодиимиду. Устойчивость ферментной системы полученного штамма к масляной кислоте коррелировала с повышением доли насыщенных жирных кислот в мембранных фосфолипидах (74% у адаптированного против 69% у исходного штамма). Адаптированный с помощью реактора с волоконным носителем штамм отличался от исходного следующими характеристиками: существенно уменьшенным ингибирующим действием масляной кислоты на рост культуры, повышенной активностью цитоплазматических ферментов фосфотрансбутилазы и АТФазы и измененной морфологией клетки (Jiang et al., 2011).

Ближайшим аналогом заявляемого способа является способ микробиологического синтеза масляной кислоты с использованием штамма С. tyrobutyricum (Zhu and Yang., 2003), у которого методом адаптивной лабораторной эволюции в ферментере с иммобилизацией была повышена резистентность к высоким концентрациям масляной кислоты. Так, скорость роста при концентрации масляной кислоты в 20 г/л для адаптированного штамма равна 0,25 µ(h-¹), тогда как у исходного штамма С. tyrobutyricum АТСС 25755 составила 0,03 µ(h-¹). При ферментировании на глюкозе адаптированного штамма конечная концентрация масляной кислоты и уксусной кислоты составила 43,4 г/л и 8,4 г/л соответственно, в то время как исходный штамм производил 16,3 г/л и 3,6 г/л соответственно. В качестве источника углерода использовали глюкозу и ксилозу. При ферментировании на ксилозе с помощью адаптированного штамма конечная концентрация масляной и уксусной кислот в культуральной жидкости составила 37,3 г/л и 4,9 г/л соответственно.

Задача заявляемой группы изобретений расширить арсенал способов микробиологического синтеза масляной кислоты на основе бактерий Clostridium tyrobutyricum.

Задачу решают путем:

- получения методами мутагенеза и лабораторной адаптивной эволюции штамма бактерий Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-12465;

- разработки способа микробиологического синтеза масляной кислоты, предусматривающего культивирование до максимального накопления целевого продукта в анаэробных условиях штамма С. tyrobutyricum ВКПМ В-12465 в питательной среде, включающей источники азота и минеральные добавки, а в качестве источника углерода -глюкозу и ацетат аммония.

Получение заявляемого штамма состоит из двух этапов.

Этап 1. Получение УФ-индуцированных мутаций

Источником ультрафиолетового излучения служит бактерицидная лампа БУВ-15 (длина волны испускаемого излучения 254 нм, мощность 15 Вт). Для получения УФ-индуцированных мутаций клетки выращивают в течение 12-16 ч на твердой среде MSS следующего состава, мас. %:

глюкоза	2
дрожжевой экстракт	0,5
ацетат NH4	0,3
KH2PO4	0,1
MgSO4×7H2O	0,1
K2HPO4	0,08
цистеин-HCl	0,05
FeSO4×7H2O	0,005
пара-аминобензойная кислота	0,001
бактагар	1,5
вода	остальное

Стерильную глюкозу добавляют после автоклавирования среды, не содержащей сахаров. Для создания анаэробных условий чашки помещают в анаэростат, объемом 2 л, который продувают азотом. Через сутки, когда культура на чашках выросла, туда вносят 10 мл стерильной жидкой среды MSS и размешивают до образования клеточной суспензии. Открытые чашки с суспензией клеток помещают в ламинарный бокс на расстоянии 50 см от источника излучения на 5 мин. После облучения чашки немедленно помещают в анаэростат АЭ-01 (Ники МЛТ, Россия) и выдерживают в темноте в течение ночи.

Этап 2. Селекция штамма С. tyrobutyricum, устойчивого к повышенным концентрациям масляной кислоты

2 мл клеточной суспензии с чашек, полученных на Этапе 1, пересевают во флаконы для анаэробной ферментации общим объемом 120 мл с 50 мл жидкой средой MSS, дополнительно содержащей 1,2 об. % масляной кислоты.

Флаконы инкубируют при 30°С в течение нескольких суток, после чего отбирают те из них, в которых плотность культуры увеличилась. 5 мл полученной культуры анаэробно пересевают во флаконы с 50 мл жидкой средой MSS, содержащей 1,5% масляной кислоты и 2% глюкозы. Флаконы выдерживают в термостате при 30°С в течение нескольких суток, после чего отбирают те из них, в которых плотность культуры увеличилась. Таким же образом проводят ступенчатую адаптацию культур клеток к концентрации масляной кислоты в культуральной жидкости, составляющей 1,8 об. % и 2,0 об. %.

В результате проведения работы в соответствии с перечисленными этапами получен штамм С. tyrobutyricum, устойчивый к концентрациям масляной кислоты в жидкой среде до 2,0 об. % включительно, который депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов как С. tyrobutyricum ВКПМ В-12465.

Заявляемый штамм имеет следующие морфологические и физиолого-биохимические признаки.

Морфологические признаки

Грамположительные спорообразующие анаэробные бактерии имеют форму клостридий, подвижные. При микроскопировании клетки представляют собой закругленные на концах палочки со средним размером 1×6 мкм, одиночные, парные или собранные в короткие цепочки. Размер спор 0,5-1,0 мкм. На твердых агаризованных средах образуют колонии кремового цвета, пастообразные, слегка приподнятые в центре, с фестончатым краем 2-4 мм в диаметре.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм растет при температуре от 20 до 40°С (оптимум 30°С, рН 4.0-8.0) В качестве источника углерода утилизирует глюкозу, фруктозу и ксилозу. Не усваивает мальтозу, галактозу, арабинозу, целлобиозу, лактозу. В качестве источника азота использует минеральный азот в аммонийной форме, а также органический азот в виде пептона, аминокислот. Необходимыми факторами роста являются биотин и пара-аминобензойная кислота.

Принадлежность заявляемого штамма к виду С. tyrobutyricum подтверждена на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рДНК.

С. tyrobutyricum ВКПМ В-12465 устойчив к концентрациям масляной кислоты до 2,0 об. % включительно в жидкой среде и синтезирует масляную кислоту с высокой селективностью практически без образования побочных продуктов.

Способ микробиологического синтеза масляной кислоты в общем виде

Для получения посевного материала аликвоту споровой культуры С. tyrobutyricum ВКПМ В-12465 объемом 2 мл засевают на чашки с твердой средой MSS, содержащей 2% глюкозы. Чашки инкубируют в анаэростате (АЭ-01 (Ники МЛТ, Россия) либо в анаэробном боксе при 30°С. Контроль морфологических свойств культур проводят через 48-72 ч роста. Отбирают типичные колонии (не менее 10 штук) засевают во флаконы для анаэробной ферментации, содержащие 20 мл жидкой среды следующего состава (мас. %): KH₂PO₄ - 0,1, K₂HPO₄ - 0,08, MgSO₄·7H₂O - 0,1, FeSO₄·7H₂O - 0,005, пара-аминобензойная кислота - 0,001, дрожжевой экстракт - 0,5, цистеин - 0,05, ацетат аммония - 0,3, глюкоза - 2, вода - остальное, и выращивают при 30°С в течение 72-144 ч. В процессе культивирования проводят периодическое определение количества масляной кислоты и побочных продуктов ферментации в культуральной жидкости.

На основании результатов ферментации отбирают наиболее продуктивный клон и размножают его путем посева на 10 флаконов для анаэробной ферментации, содержащих 50 мл жидкой среды MSS, содержащей 2% глюкозы. Клетки выращивают при 30°С в течение 72-144 ч. Затем проводят микроскопию мазка. Флаконы с типичной по морфологии культурой хранят в холодильнике при температуре 4°С в течение 3-х месяцев и используют в качестве рабочей партии при выращивании посевного материала, а также для закладки на хранение.

Для выращивания посевного материала проводят засев анаэробных флаконов, содержащих 50 мл жидкой среды MSS, содержащей 2% глюкозы, рабочей культурой в количестве 1-4 мл. Клетки выращивают при 30°С в течение 24 ч. Посевной материал используют для засева ферментационной среды MSS.

Периодическая ферментация во флаконах

Во флаконы для анаэробной ферментации общим объемом 100 см³, содержащие 50 мл жидкой ферментационной среды MSS, содержащей 6% глюкозы, вносят 5,0 об. % посевного материала. Ферментацию проводят в течение 144 ч при 37°С в статических, строго анаэробных условиях.

Ферментация в ферментере с подпиткой

Для процесса биосинтеза масляной кислоты используют трехлитровый ферментер КФ 103/4, оборудованный для анаэробного процесса.

Процесс биосинтеза проводят при температуре (37±1)°С, поддерживая рН 7.0±0,1, продолжительность биосинтеза составляет 144 ч. Процесс ферментации проводят с подпиткой глюкозой путем добавления 60%-ной глюкозы в количестве 1/10 от объема культуры на 72 и 108 ч культивирования.

Для контроля над процессом брожения пробы ферментационной жидкости отбирают сразу после засева и по истечении каждых суток культивирования. В пробах определяют уровень накопления масляной кислоты и побочных продуктов ферментации, остаточные сахара.

Количество синтезированной масляной кислоты и побочных продуктов ферментации определяют методом газовой хроматографии.

Клетки биомассы удаляют центрифугированием при 5000 g, а надосадочную жидкость исследуют.

Для этого используют хроматограф «Shimadzu» GC-17A (Япония), оснащенный автосэмплером AOC-20i, пламенно-ионизационным детектором и капиллярной колонкой Agilent (длина 30 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,25 мкм) («Supelco», США). В качестве газа-носителя используют азот, температура 260°С. Сбор и обработку данных проводят с помощью пакета программ «Мультихром» на основе персонального компьютера. Измерения проводят в трех повторностях. Предел количественного обнаружения не должен превышать 100 мг/л.

Уровень синтеза масляной кислоты заявляемым способом достигает 27 г/л.

Изобретение проиллюстрировано фиг. 1.

Фиг. 1 Схема метаболизма маслянокислых бактерий: 1) гидрогеназа; 2) фосфотрансацетилаза; 3) ацетаткиназа; 4) тиолаза; 5) фосфотрансбутирилаза; 6) бутираткиназа; 7) КоА-трансфераза; 9) кротоназа; 10) бутирил-КоА-дегидрогеназа; 11) глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа; 12) бутиральдегиддегидрогеназа; 13) бутанолдегидрогеназа; 14) лактатдегидрогеназа; 15) ферредоксин-оксидоредуктаза; 16) L(+)-β-оксибутирил-КоА-дегидрогеназа; 17) ацетальдегиддегидрогеназа; 18) алкогольдегидрогеназа.

Бутирил-КоА может быть преобразован в бутират двумя путями: 1) под действием фосфотрансбутирилазы и бутират киназы; при этом на стадии бутираткиназы образуется АТФ; 2) с помощью фермента бутирил-КоА:ацетат-КоА трансферазы, который переносит КоА от бутирил-КоА на ацетат, формируя бутират и ацетил-КоА. При этом бутират может синтезироваться в том числе и за счет реутилизации ацетата из среды с помощью бутирил-КоА:ацетат-КоА трансферазы.

Изобретение подтверждено следующими примерами.

Пример 1. Получение заявляемого штамма С. tyrobutyricum ВКПМ В-12465

Штамм С. tyrobutyricum ВКПМ В-9615 получен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Чувствительность штамма ВКПМ В-9615 к действию масляной кислоты в концентрациях, не превышающих 5 г/л, установлена с помощью тестирования на жидкой среде MSS, содержащей дополнительно масляную кислоту.

С целью получения УФ-индуцированных мутаций клетки штамма С. tyrobutyricum ВКПМ В-9615 подвергали воздействию УФ-излучения, после чего проводили адаптацию к повышенным концентрациям масляной кислоты в среде. В результате получен заявляемый штамм С. tyrobutyricum ВКПМ В-12465, синтезирующий масляную кислоту с высокой селективностью (до 100%) и устойчивый к концентрации до 2 об. % включительно масляной кислоты в жидкой среде.

Пример 2. Синтез масляной кислоты с использованием штамма С. tyrobutyricum ВКПМ В-12465 в периодической ферментации на среде с глюкозой

При периодической ферментации во флаконах для анаэробного культивирования максимальное содержание масляной кислоты в культуральной жидкости штамма С. tyrobutyricum ВКПМ В-12465 наблюдают на 120 ч культивирования на среде MSS, содержащей 60 г/л глюкозы и 3 г/л ацетата аммония. Оно составляет 11,4 г/л, что в 2,6 раза превышает уровень синтеза масляной кислоты исходным штаммом С. tyrobutyricum В-9615 (4,4 г/л). Штамм С. tyrobutyricum ВКПМ В-12465 синтезирует масляную кислоту, аккумулируя при этом ацетат из питательной среды. Помимо масляной кислоты штамм в качестве побочного продукта заявляемый штамм синтезирует в незначительных количествах (0,3 г/л) этанол.

Пример 3. Синтез масляной кислоты с использованием штамма С. tyrobutyricum ВКПМ В-12465 на среде с глюкозой в ферментере с подпиткой

При ферментации в ферментере с подпиткой для анаэробного культивирования максимальное содержание масляной кислоты в культуральной жидкости штамма С. tyrobutyricum ВКПМ В-12465 наблюдают на 96 ч культивирования на среде MSS, содержащей 60 г/л глюкозы и 3 г/л ацетата аммония. Оно составляет 27 г/л, что в 6,13 раза превышало уровень синтеза масляной кислоты исходным штаммом В-9615 (4,4 г/л). Штамм С. tyrobutyricum ВКПМ В-12465 производил исключительно масляную кислоту, аккумулируя при этом ацетат из питательной среды. Синтеза бутанола, ацетона, этанола не наблюдалось.

Таким образом, в заявляемых результатах впервые продемонстрирована возможность синтеза бактериями С. tyrobutyricum масляной кислоты в качестве единственного продукта ферментации при условии использования в средах для культивирования в качестве источников углерода глюкозы и ацетата аммония.

Штамм С. tyrobutyricum ВКПМ В-12465 получен путем комбинации методов УФ-мутагенеза и лабораторной адаптивной эволюции. Вследствие повышения устойчивости к токсичному конечному продукту - масляной кислоте с 0,5 об. % у исходного штамма С. tyrobutyricum ВКПМ В-9615 до 2 об. % включительно у штамма С. tyrobutyricum ВКПМ В-12465 удалось поднять уровень синтеза масляной кислоты с 4,4 г/л у исходного штамма С. tyrobutyricum ВКПМ В-9615 до 11,4 г/л в условиях периодической ферментации штамма С. tyrobutyricum ВКПМ В-12465 и до 27 г/л в условиях ферментации штамма С. tyrobutyricum ВКПМ В-12465 в 3 л ферментере с подпиткой глюкозой.

Штамм С. tyrobutyricum ВКПМ В-12465 производит масляную кислоту, аккумулируя при этом ацетат из питательной среды, что позволяет предполагать, что бутират синтезируется из ацетата и бутирил-КоА в реакции, катализируемой КоА-трансферазой (реакция 7 на фиг. 1).

Таким образом, получен штамм Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-12465, устойчивый к концентрациям масляной кислоты в жидкой среде до 2,0 об. % включительно, и на основе этого штамма разработан микробиологический способ синтеза масляной кислоты, позволяющий синтезировать ее с высокой степенью селективности, практически без образования побочных продуктов при использовании в качестве источника углерода в средах для культивирования глюкозы и ацетата аммония.

У ближайшего аналога при ферментации на глюкозе адаптированного штамма С. tyrobutyricum конечная концентрация масляной кислоты составила 43,4 г/л, в то же время концентрация побочного продукта - уксусной кислоты составила 8,4 г/л.

Способность заявляемого штамма при культивировании заявляемым способом синтезировать исключительно масляную кислоту путем ферментации глюкозы, сопровождающейся утилизацией из питательной среды ацетата аммония, позволяет использовать в качестве субстратов для ферментации возобновляемое углеводосодержащее сырье.

Используемые источники информации

А.Р. Аблаев, М.В. Харина, О.В. Березина, С.В. Рыков, С.В. Яроцкий, В.М. Емельянов. Оценка эффективности биосинтеза масляной кислоты при культивировании бактерий Clostridium butyricum и Clostridium tyrobutyricum на средах, содержащих гидролизаты березового опила и свекловичного жома. Биотехнология. 2014, №4, с. 45-54

Cai L, Sutter Benjamin М, Li В, Tu Benjamin P. 2011. Acetyl-coA induces cell growth and proliferation by promoting the acetylation of histones at growth genes. Mol Cell 42:426-437.

Dwidar M, Park JY, Mitchell RJ, Sang BI. // The future of butyric acid in industry. // ScientificWorldJournal. 2012; 2012:471417.

Hamer HM, Jonkers D, Venema K, Vanhoutvin S, Troost FJ, Brummer RJ. // Review article: the role of butyrate on colonic function. // Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 2008; 27(2):104-119.

Jiang L, Wang J, Liang S, Cai J, Xu Z, Cen P, Yang S, Li S.// Enhanced butyric acid tolerance and bioproduction by Clostridium tyrobutyricum immobilized in a fibrous bed bioreactor. // Biotechnol Bioeng. 2011 Jan; 108(1):31-40.

Liu X, Zhu Y, Yang S-T (2006) Butyric acid and hydrogen production by Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755 and mutants. Enzyme Microb Technol 38:521-528;

Zhu Y and Yang ST. // Adaptation of Clostridium tyrobutyricum for enhanced tolerance to butyric acid in a fibrous-bed bioreactor. Biotechnol Prog. 2003 Mar-Apr; 19(2):365-72.

Zhu Yl, Liu X, Yang ST. // Construction and characterization of pta gene-deleted mutant of Clostridium tyrobutyricum for enhanced butyric acid fermentation. // Biotechnol Bioeng. 2005 Apr 20; 90(2): 154-66.

Zhou X, Lu XH, Li XH, Xin ZJ, Xie JR, Zhao MR, Wang L, Du WY, Liang JP.// Radiation induces acid tolerance of Clostridium tyrobutyricum and enhances bioproduction of butyric acid through a metabolic switch. // Biotechnol Biofuels. 2014 Feb 18;7(1):22.

1. Штамм анаэробных бактерий Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-12465 - продуцент масляной кислоты.

2. Способ микробиологического синтеза масляной кислоты, предусматривающий культивирование мутантного штамма анаэробных бактерий С. tyrobutyricum в анаэробных условиях в питательной среде, включающей источники углерода, азота и минеральные добавки, до максимального накопления целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют штамм по п. 1, а в качестве источника углерода 60 г/л глюкозы и 3 г/л ацетата аммония.