2605595 - Антитела против g-csfr и их применение

Антитела против g-csfr и их применение

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к области биохимии. Предложены варианты антитела, связывающегося с человеческим рецептором гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (hG-CSFR). Также предложены композиция и способ лечения опосредованного G-CSF состояния у субъекта. Изобретение позволяет связываться с hG-CSFR с высокой аффинностью и нейтрализовать передачу сигналов G-CSF. 9 н. и 4 з. п. ф-лы, 4 ил., 3 табл., 6 пр.

Реферат

РОДСТВЕННАЯ ЗАЯВКА

В настоящей заявке заявляется приоритет по предварительной заявке на патент США 61/496351, озаглавленной «Антитела против G-CSFR и их применение», поданной 13 июня 2011 года, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка подана вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Полное содержание перечня последовательностей включено в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее описание относится к антителам, которые связываются с рецептором гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSFR), и их применению, например, в терапии.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) представляет собой основной регулятор продуцирования гранулоцитов. G-CSF продуцируется стволовыми клетками костного мозга, эндотелиальными клетками, макрофагами и фибробластами, а продуцирование инициируется воспалительными стимулами. G-CSF действует через рецептор G-CSF (G-CSFR), который экспрессируется на ранних миелоидных предшественниках, зрелых нейтрофилах, моноцитах/макрофагах, Т - и В-лимфоцитах и эндотелиальных клетках. Мыши с недостатком G-CSF или G-CSFR демонстрируют заметную нейтропению, показывая важность G-CSF в устойчивом гранулопоэзе. Однако G-CSF является несущественным для экстренного гранулопоэза, например, в ответ на инфекцию. G-CSF повышает продуцирование и высвобождение нейтрофилов, мобилизует гематоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники, а также модулирует дифференцировку, продолжительность жизни и эффекторные функции зрелых нейтрофилов. G-CSF также может оказывать влияние на макрофаги, включая увеличение количество моноцитов/макрофагов, усиление фагоцитарной функции и регуляцию продуцирования воспалительных цитокинов и хемокинов. Было также показано, что G-CSF мобилизует эндотелиальные клетки-предшественники и вызывает или ускоряет ангиогенез.

Хотя G-CSF используют терапевтически, например, для лечения нейтропении и/или для мобилизации гематопоэтических стволовых клеток, он также обладает негативным действием при некоторых состояниях, например, воспалительных состояниях и/или раке. Например, введение G-CSF обостряет ревматоидный артрит (RA), мышиный коллаген-индуцированный артрит (CIA) и модель пассивного переноса CIA на крысах. G-CSF также был обнаружен в сыворотке и синовиальной жидкости пациентов с RA. Более того, интерлейкин (IL)-l и фактор некроза опухоли a (TNFa), которые обнаружены в повышенных концентрациях у пациентов, страдающих от RA, вызывают продуцирование G-CSF человеческими синовиальными фибробластами и хондроцитами. Мыши с недостатком G-CSF резистентны к индуцированию острого и хронического воспалительного артрита.

Было также показано, что G-CSF играет роль в рассеянном склерозе (MS). Например, G-CSF усиливает адгезию в модели MS с аутореактивной линией Т-клеток к внеклеточному матриксу так же эффективно, как интерферон у и TNFa, которые, как известно, обостряют симптомы MS. Более того, мыши с недостатком G-CSF являются резистентными к развитию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ).

G-CSF и G-CSFR также связаны с раком, и исследования показывают, что этот сигнальный путь способствует резистентности к химиотерапии, росту, выживанию, инвазивности и метастазу различных видов рака. Более того, было показано, что G-CSF вызывает ангиогенез, важный процесс при развитии солидных опухолей.

Специалистам в данной области из вышеизложенного понятно, что в данной области существует необходимость в реагентах, которые снижают передачу сигналов G-CSF через G-CSFR. Иллюстративные агенты пригодны для применения в качестве терапевтических средств, например, для лечения или предупреждения G-CSF-опосредованного состояния.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения получили класс белков, содержащих связывающие сайты антитела (например. Fab и антитела), которые связываются с человеческим G-CSFR (hG-CSFR) и потенциально нейтрализуют передачу сигналов G-CSF, например, предотвращают образование гранулоцитов из клеток костного мозга CD34⁺ и/или предотвращают клеточную пролиферацию в ответ на G-CSF, и/или предотвращают нейтрофилию, вызванную введением G-CSF. Класс белков, установленный авторами настоящего изобретения, также перекрестно взаимодействует с G-CSFR яванского макака (cynoG-CSFR), что облегчает доклинические исследования этих белков. Класс белков, определенный авторами настоящего изобретения, связывается с hG-CSFR с высокой аффинностью. Класс белков, определенный авторами настоящего изобретения, представляет собой человеческие антитела, которые пригодны для лечения различных состояний.

В настоящем описании представлен белок, содержащий антигенсвязывающий сайт антитела, причем указанный антигенсвязывающий сайт связывается с hG-CSFR и нейтрализует передачу сигналов G-CSF, и при этом указанный белок ингибирует рост колониеобразующих единиц -гранулоцитов (CFU-G) из клеток костного мозга CD34⁺, выращенных в присутствии G-CSF, со значением IC₅₀, по меньшей мере, около 0,2 нМ. Например, IC₅₀ составляет 0,1 нМ или менее, например, 0,09 нМ или менее, или 0,08 нМ или менее, или 0,07 нМ или менее, или 0,06 нМ или менее, или 0,05 нМ или менее. В одном примере, IC₅₀ составляет 0,04 нМ или менее. В другом примере, IC₅₀ составляет 0,02 нМ или менее. Способы оценки IC₅₀ белка в таком анализе описаны в настоящем документе. Например, IC₅₀ определяют в присутствии 10 нг/мл hG-CSF.

В одном примере, IC₅₀ определяют выращиванием клеток костного мозга CD34⁺ в присутствии 10 нг/мл фактора стволовых клеток и 10 нг/мл hG-CSF. Например, клетки выращивают в полутвердой клеточной культуральной среде. В одном примере, CFU-G подсчитывают через 14 дней выращивания.

В настоящем описании дополнительно или альтернативно представлен белок, содержащий антигенсвязывающий сайт антитела, причем указанный антигенсвязывающий сайт связывается с G-CSFR человека и яванского макака с одинаковой аффинностью и нейтрализует передачу сигналов G-CSF. Такие белки являются преимущественными, поскольку они облегчают доклинические исследования на млекопитающих, не являющихся человеком.

В одном примере, аффинность белка определяют с использованием биосенсора, например, резонансом поверхностного плазмона. Например, фиксируют лиганд-связывающую область или растворимый hG-CSFR, или растворимый cynoG-CSFR, или hG-CSFR-Fc, или cyno-G-CSFR-Fc, и определяют аффинность белка настоящего изобретения.

В настоящем изобретении дополнительно представлен белок, содержащий антигенсвязывающий сайт антитела, причем указанный антигенсвязывающий сайт специфически связывается с таким же эпитопом в hG-CSFR, который связывается С1.2 (содержащим вариабельную область тяжелой цепи (V_H), содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, и вариабельную область легкой цепи (V_L), содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO:3) или C1.2G (содержащим V_H, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO:4) и V_L, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO:5).

(ii) указанный белок нейтрализует передачу сигналов G-CSF; и (iii) степень связывания указанного белка с полипептидом SEQ ID NO:1, в котором аланин замещен любым из:

(a) аргинина в положении 287 SEQ ID NO:1;

(b) гистидина в положении 237 SEQ ID NO:1;

(d) тирозина в положении 172 SEQ ID NO:1;

(e) лейцина в положении 171 SEQ ID NO:1; или

(f) лейцина в положении 111 SEQ ID NO:1

ниже, чем степень связывания указанного белка с полипептидом SEQ ID NO:1.

В настоящем описании дополнительно или альтернативно представлен белок, содержащий антигенсвязывающий сайт антитела, причем (i) указанный белок конкурентно ингибирует связывание С1.2 (содержащего VH, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO:2) и V_L, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO:3) или C1.2G (содержащего V_H, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO:4) и V_L, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO:5) с hG-CSFR; (ii) указанный белок нейтрализует передачу сигналов G-CSF; и (iii) предпочтительно связывается с полипептидом SEQ ID NO:1 относительно его способности связываться с полипептидом SEQ ID NO:1, в котором аланин замещен любым из:

(a) аргинина в положении 287 SEQ ID NO:1;

(b) гистидина в положении 237 SEQ ID NO:1;

(d) тирозина в положении 172 SEQ ID NO:1;

(e) лейцина в положении 171 SEQ ID NO:1; или

(f) лейцина в положении 111 SEQ ID NO:1.

В настоящем описании дополнительно или альтернативно представлен белок, содержащий антигенсвязывающий сайт антитела, причем (i), указанный белок связывается с hG-CSFR; (Неуказанный белок нейтрализует передачу сигналов G-CSF; и (iii) степень связывания указанного белка с полипептидом SEQ ID NO:1, в котором аланин замещен любым из:

(a) аргинина в положении 287 SEQ ID NO:1;

(b) гистидина в положении 237 SEQ ID NO:1;

(d) тирозина в положении 172 SEQ ID NO:1;

(e) лейцина в положении 171 SEQ ID NO:1; или

(f) лейцина в положении 111 SEQ ID NO:1

ниже, чем степень связывания указанного белка с полипептидом SEQ ID NO:1.

В настоящем описании дополнительно или альтернативно представлен белок, содержащий антигенсвязывающий сайт антитела, причем (i), указанный белок связывается с hG-CSFR; (ii) указанный белок нейтрализует передачу сигналов G-CSF; и (iii) предпочтительно связывается с полипептидом SEQ ID NO:1 относительно его способности связываться с полипептидом SEQ ID NO:1, в котором аланин замещен любым из:

(a) аргинина в положении 287 SEQ ID NO:1;

(b) гистидина в положении 237 SEQ ID NO:1;

(d) тирозина в положении 172 SEQ ID NO:1;

(e) лейцина в положении 171 SEQ ID NO:1; или

(f) лейцина в положении 111 SEQ ID NO:1.

В одном примере, степень связывания белка с полипептидом, содержащим замещение аланина, снижена, по меньшей мере, приблизительно в 10 раз или 20 раз, или 50 раз, или 100 раз, или 150 раз, или 200 раз, по сравнению со связыванием указанного белка с полипептидом SEQ ID NO:1. Предпочтительно, степень связывания белка с полипептидом, содержащим замещение аланина, снижена, по меньшей мере, в 50 раз. Предпочтительно, степень связывания белка с полипептидом, содержащим замещение аланина, снижена, по меньшей мере, в 60 раз.

В одном примере, антигенсвязывающий сайт белка не связывается обнаруживаемым образом с полипептидом SEQ ID NO:1, в котором аланин замещен аргинином в положении 287 SEQ ID NO:1.

В одном примере, степень связывания оценивают с использованием биосенсора, например, резонансом поверхностного плазмона. Например, белок фиксируют и измеряют степень связывания с полипептидом SEQ ID NO:1 или с формой полипептида, содержащей замещение аланина.

Дополнительные формы полипептида, содержащего аминокислоты SEQ ID NO:1 с другими замещениями или без них, которые связываются или существенно не связываются, или не связываются обнаруживаемым образом, с белком настоящего описания, описаны в настоящем документе, и их следует использовать mutatis mutandis в примерах настоящего описания.

В одном примере, антиген-связывающий сайт перекрестие реагирует с:

(i) полипептидом SEQ ID NO:1, в котором аланин замещен лизином в положении 167 SEQ ID NO:1; и/или

(ii) полипептидом SEQ ID NO:1, в котором аланин замещен гистидином в положении 168 SEQ ID NO:1.

В одном примере, антигенсвязывающий сайт дополнительно перекрестие реагирует с полипептидом SEQ ID NO:1, в котором аланин замещен лейцином в положении 169 SEQ ID NO:1

В одном примере, белок конкурентно ингибирует связывание С1.2 (содержащего V_H, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO:2) и V_L, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO:3) или C1.2G (содержащего V_H, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO:4) и V_L, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO:5) с одним или более из:

(i) полипептида SEQ ID NO:1, в котором аланин замещен лизином в положении 167 SEQ ID NO:1; и/или

(ii) полипептида SEQ ID NO:1, в котором аланин замещен гистидином в положении 168 SEQ ID NO:1.

В одном примере, белок, описанный в настоящем документе по любому примеру, связывается с эпитопом, содержащим остатки в пределах одной или двух, или трех, или четырех областей, выбранных из 111-115, 170-176, 218-234 и/или 286-300 SEQ ID NO:1.

В одном примере, при связывании белка, описанного в настоящем документе по любому примеру, с полипептидом SEQ ID NO:1 и расщеплении при помощи протеолитических ферментов, остается связь с одним или двумя, или тремя, или четырьмя пептидами, содержащими или состоящими из аминокислот 111-115 SEQ ID NO:1 или аминокислот 170-176 SEQ ID NO:1, или аминокислот 218-234 SEQ ID NO:1, или аминокислот 286-300 SEQ ID NO:1.

В одном примере, белок связывается с конформационным эпитопом.

В настоящем описании дополнительно или альтернативно представлен белок, который связывается с hG-CSFR и нейтрализует передачу сигналов G-CSF, указанный белок содержит, по меньшей мере, одно из:

(i) V_H, содержащей определяющую комплементарность область (CDR) 1, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO:6, и CDR2, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO:7 и CDR3, содержащую последовательность, по меньшей мере, приблизительно на 55% идентичную последовательности, представленной в SEQ ID NO:8;

(ii) V_H, содержащей последовательность, по меньшей мере, приблизительно на 80%, такую как на 85%, или 90%, или 91%, или 92%, или 93%, или 94%, или 95%, или 96%, или 97%, или 98%, или 99% идентичную последовательности, представленной в SEQ ID NO:2 и/или 4;

(iii) V_L, содержащей CDR1, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, и CDR2, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO:10 и CDR3, содержащую последовательность, по меньшей мере, приблизительно на 33% идентичную последовательности, представленной в SEQ ID NO:11; и

(iv) V_L, содержащей последовательность, по меньшей мере, приблизительно на 80%, такую как на 85%, или 90%, или 91%, или 92%, или 93%, или 94%, или 95%, или 96%, или 97%, или 98%, или 99% идентичную последовательности, представленной в SEQ ID NO:3 и/или 5.

Такой белок может содержать любую одну или более функциональных активностей, описанных в настоящем документе, например, предпочтительное связывание с полипептидом SEQ ID NO:1 относительно степени его связывания с полипептидом SEQ ID NO:1, в котором аланин замещен любым из:

(a) аргинина в положении 287 SEQ ID NO:1;

(b) гистидина в положении 237 SEQ ID NO:1;

(d) тирозина в положении 172 SEQ ID NO:1;

(e) лейцина в положении 171 SEQ ID NO:1; или

(f) лейцина в положении 111 SEQ ID NO:1.

В одном примере, процентная идентичность у (ii) составляет, по меньшей мере, около 95%.

В одном примере, процентная идентичность у (iv) составляет, по меньшей мере, около 94%.

В одном примере, различия между упомянутой последовательностью и белком заключаются в замещениях.

Специалисты в данной области могут определить сайты мутаций белка настоящего описания, например, в пределах каркасной области белка, содержащей вариабельную область. Более того, авторы настоящего изобретения идентифицировали многочисленные сайты в V_H CDR3 и V_L CDR3, которые могут быть мутированы, а также многочисленные мутации, которые сохраняют активность белка настоящего описания. Примером мутации является, например, замещение в пределах одного или более (например, 2 или 3, или 4) из четырех С-концевых остатков HCDR3 и/или одного или более (например, 2 или 3, или 4, или 5, или 6) из N-концевых или С-концевых остатков LCDR3. В одном примере, пять N-концевых аминокислот V_H CDR3 представляют собой LGELG. В одном примере, три N-концевые аминокислоты CDR3 представляют собой QQS и/или три С-концевые аминокислоты V_L CDR3 представляют собой PLT.

В одном примере, V_H содержит CDR3, содержащий последовательность _{LGELGX1X2X3X4}, причем:

X₁ выбран из группы, состоящей из триптофана, глутамина, метионина, серина, фенилаланина, глутаминовой кислоты и гистидина, и/или представляет собой нейтральную аминокислоту, такую как триптофан, глутамин или метионин, например аминокислота, представляет собой триптофан;

X₂ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из фенилаланина, тирозина, метионина, серина, глицина и изолейцина, например, представляет собой фенилаланин, тирозин, метионин или серин, например, аминокислота представляет собой фенилаланин;

Х₃ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из аспарагиновой кислоты, метионина, глутамина, серина, лейцина, валина, аргинина и гистидина, например, представляет собой пролин, глутаминовую кислоту, аланин, лейцин, фенилаланин или тирозин, например аминокислота, представляет собой аспарагиновую кислоту; и

X₄ представляет собой любую аминокислоту или аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из пролина, глутаминовой кислоты, аланина, лейцина, фенилаланина, тирозина, треонина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, серина, глицина, аргинина и лизина, например, аминокислота представляет собой пролин.

В одном примере, V_L содержит CDR3, содержащий последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉, причем:

X₁ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глутамина, глутаминовой кислоты, гистидина, аланина и серина и/или представляет собой гидрофильную аминокислоту, такую как глутамин или глутаминовая кислота, например аминокислота, представляет собой глутамин;

Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глутамина, валина, фенилаланина, аспарагина и глутаминовой кислоты, например аминокислота, представляет собой глутамин;

Х₃ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из серина и глицина, например, аминокислота представляет собой серин;

Х4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из триптофана, метионина, фенилаланина, тирозина, изолейцина и лейцина, например, аминокислота представляет собой триптофан или тирозин;

Х₅ представляет собой любую аминокислоту или аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, метионина, глутамина, триптофана, серина, валина, аспарагина, глицина, аланина, аргинина, гистидина, тирозина, лизина и треонина, например, аминокислота представляет собой серии;

Х₆ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из тирозина, метионина, изолейцина и треонина, например, аминокислота представляет собой метионин, тирозин или треонин;

Х₇ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из пролина, аланина, гистидина, глицина и лизина, например, аминокислота представляет собой пролин;

X₈ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из лейцина, глутамина, метионина, аланина, фенилаланина, изолейцина, лизина, гистидина и глицина, например, аминокислота представляет собой лейцин;

Х₉ представляет собой любую аминокислоту или аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из треонина, фенилаланина, тирозина, метионина, лизина, серина, гистидина, пролина, триптофана, изолейцина, глутамина, глицина и валина, например, аминокислота представляет собой треонин.

В настоящем описании дополнительно или альтернативно представлен белок (например, антитело), который связывается с hG-CSFR и нейтрализует передачу сигналов G-CSF, указанный белок содержит, по меньшей мере, одну вариабельную область антитела, выбранную из группы, состоящей из:

(i) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2;

(ii) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3;

(iii) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4;

(iv) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5;

(v) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:14;

(vi) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:15;

(vii) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:16;

(viii) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:17;

(ix) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:18;

(х) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:19;

(xi) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:20;

(xii) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:21;

(xiii) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:22;

(xiv) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:23;

(xv) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:24;

(xvi) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:25;

(xvii) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:26;

(xviii) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:27;

(xix) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:28;

(хх) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:29;

(xxi) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:30;

(xxii) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:31;

(xxiii) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:32;

(xxiv) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:33;

(xxv) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:34;

(xxvi) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:35;

(xxvii) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:36;

(xxviii) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:37;

(xxix) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:38;

(ххх) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:39;

(xxxi) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:40;

(xxxii) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:41;

(xxxiii) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:42;

(xxxiv) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:43;

(xxxv) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:44;

(xxxvi) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:45;

(xxxvii) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:46;

(xxxviii) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:47;

(xxix) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:48;

(xl) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:49;

(xli) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:50;

(xlii) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:51;

(xliii) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:52;

(xliv) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:53;

(xlv) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:54;

(xlvi) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:55;

(xlvii) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:56;

(xlviii)VH, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:57;

(xlix) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:58;

(1) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:59;

(li) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:60;

(lii) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:61;

(liii) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:62; и

(liv) V_L, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:63.

В одном примере, белок, описанный в настоящем документе, содержит, по меньшей мере, V_H и V_L, причем указанные V_H и V_L связываются с образованием Fv, содержащей антигенсвязывающий домен. Специалистам в данной области понятно, что указанный антигенсвязывающий домен содержит связывающий сайт антитела.

В одном примере, V_H и V_L находятся в одной полипептидной смеси. Например, белок представляет собой:

(i) одноцепочечный фрагмент Fv (scFv);

(ii) димерный scFv (ди-scFv); или

(iii) по меньшей мере, один из (i) и/или (ii), связанный с константной областью антитела, Fc, или константным доменом тяжелой цепи (С_Н)2 и/или C_H3.

В одном примере, V_H и V_L находятся в разных полипептидных цепях.

Например, белок представляет собой:

(i) диатело;

(ii) триотело;

(iii) тетратело;

(iv) Fab;

(v) F(ab′)2;

(vi) Fv; или

(vii) один из (i)-(vi), связанный с константной областью антитела, Fc, или константным доменом тяжелой цепи (C_H)2 и/или C_H3.

Вышеупомянутые белки (описанные в двух предыдущих списках) также могут быть упомянуты как антигенсвязывающие домены или антитела.

В одном примере, белок представляет собой антитело. В одном примере, антитело представляет собой ненагруженное антитело.

В одном примере, белок является химерным, деиммунизированным, гуманизированым, человеческим или приматизированным.

В одном примере, белок или антитело является человеческим.

В настоящем описании дополнительно или альтернативно представлено антитело, которое связывается с hG-CSFR и нейтрализует передачу сигналов G-CSF, указанное антитело содержит:

(i) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3;

(ii) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5;

(iii) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:15 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:14;

(iv) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:16;

(v) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:17;

(vi) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:18;

(vii) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:20 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:19;

(viii) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:21;

(ix) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:22;

(х) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:24 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:23;

(ix) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:25;

(х) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:26;

(xi) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:28 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:27;

(xii) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:29;

(xiii) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:31 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:30;

(xiv) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:33 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:32;

(xv) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:34;

(xvi) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:36 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:35;

(xvii) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:38 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:37;

(xviii) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:40 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:39;

(xix) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:42 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:41;

(хх) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:43;

(xxi) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:45 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:44;

(xxii) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:46;

(xxiii) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:47;

(xxiv) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:49 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:48;

(xxv) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:51 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:50;

(xxvi) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:53 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:52;

(xxvii) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:54;

(xxviii) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:55 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5;

(xxix) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:57 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:56;

(ххх) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:59 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:58;

(xxxi) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:61 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:60;

(xxxii) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:62;

(xxxiii) V_H, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:63; и

(xxxix) V_H, содержащую три CDR из набора V_H, представленного выше в любом одном или более из (i)-(xxxiii), и V_L, содержащую три CDR из набора V_L, представленного выше в любом одном или более из (i)-(xxxiii).

Последовательности иллюстративных V_H и V_L описаны в Таблице 3, причем указанная последовательность CDR3 V_H или V_L замещена соответствующей последовательностью в V_H или V_L С1.2 или C1.2G, как описано в настоящем документе.

В одном примере, в настоящем описании представлено антитело, которое связывается с hG-CSFR и нейтрализует передачу сигналов G-CSF, указанное антитело содержит:

(i) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3; или

(ii) V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5.

В настоящем описании дополнительно или альтернативно представлено антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:64 и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:65. В одном примере, указанное антитело связывается с hG-CSFR и нейтрализует передачу сигналов G-CSF.

В настоящем описании дополнительно или альтернативно представлено антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:68 и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:65. В одном примере, указанное антитело связывается с hG-CSFR и нейтрализует передачу сигналов G-CSF.

В настоящем описании дополнительно или альтернативно представлено антитело, содержащее одну тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:64 и одну тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:68, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:65. В одном примере, указанное антитело связывается с hG-CSFR и нейтрализует передачу сигналов G-CSF.

Упоминание в настоящем документе белка или антитела, которое «связывается с» hG-CSFR обеспечивает буквальное подкрепление белка или антитела, которое «специфически связывается с» hG-CSFR.

В одном примере, белок или антитело, описанное в настоящем документе, существенно не связывается с мышиным G-CSFR и/или не связывается обнаруживаемым образом с мышиным G-CSFR.

В одном примере, белок или антитело, описанное в настоящем документе по любому примеру, конкурентно ингибирует связывание С1.2 и/или C1.2G с hG-CSFR или клеткой, экспрессирующей их, или SEQ ID NO:1, или растворимым hG-CSFR (например, содержащим аминокислоты 1-311 SEQ ID NO:1, гибридизованные с Fc областью антитела).

В одном примере, белок или антитело, описанное в настоящем документе, связывается с лиганд-связывающей областью hG-CSFR и лиганд-связывающей областью cynoG-CSFR с одинаковой аффинностью. В одном примере, белок связывается с растворимым hG-CSFR и растворимым cynoG-CSFR с одинаковой аффинностью. В одном примере, белок связывается с полипептидом, содержащим SEQ ID NO:1 и с полипептидом, содержащим SEQ ID NO:67 с одинаковой аффинностью. В одном примере, белок связывается с hG-CSFR-Fc и cynoG-CSFR-Fc, описанными в настоящем документе, с одинаковой аффинностью. В одном примере, аффинность составляет, по меньшей мере, около 2 нМ, например, по меньшей мере, около 1,5 нМ, такое значение как, по меньшей мере, около 1,2 нМ, 1,1 нМ или 1 нМ. В одном примере, 0,5 нМ, такое значение, как, по меньшей мере, около 0,46 нМ или 0,45 нМ, или 0,40 нМ, или 0,39 нМ. В другом примере, аффинность составляет, по меньшей мере, около 0,1 нМ, такое значение как, по меньшей мере, около 0,09 нМ, например, по меньшей мере, около 0,08 нМ. В одном примере, степень связывания оценивают с использованием биосенсора, нап

Антитела против g-csfr и их применение

Патент 2605595