Гормоны роста с пролонгированной эффективностью in vivo

Гормоны роста с пролонгированной эффективностью in vivo

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к соединению гормона роста, соединенному с альбумин-связывающим остатком через гидрофильный спейсер, и к способам получения и применения таких соединений. Эти конъюгаты гормона роста обладают повышенной устойчивостью к протеолитической деградации в сочетании более длительным профилем действия и полезны для применения в терапии.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Гормон роста - это полипептидный гормон, секретируемый передней долей гипофиза у млекопитающих. В зависимости от биологического вида, гормон роста является белком, состоящим из примерно 190 аминокислотных остатков, что соответствует молекулярной массе примерно 22 кДа. Гормон роста связывается с поверхностными рецепторами клеток, рецепторами гормона роста (GHR), и передает через них сигнал. Гормон роста играет ключевую роль в активации роста, поддержании нормальной композиции тела, анаболизма и метаболизма липидов. Он также оказывает прямое воздействие на промежуточный метаболизм, например, на сниженное поглощение глюкозы, усиленный липолиз, повышенные поглощение аминокислот и синтез белка. Гормон также оказывает влияние на другие ткани, в том числе на жировую ткань, печень, кишечник, почку, скелет, соединительную ткань и мышцы. Был получен рекомбинантный гормон роста человека (hGH), который доступен для приобретения, например: Генотропин™ (Genotropin™, Pharmacia Upjohn), Нутропин™ и Протропин™ (Nutropin™ и Protropin™, Genentech), Хуматроп™ (Humatrope™, Eli Lilly), Серостим™ (Serostim™, Serono), Нордитропин (Norditropin, Novo Nordisk), Омнитроп (Omnitrope, Sandoz), Нутропин Депот (Nutropin Depot, Genentech и Alkermes). Кроме того, на рынке также представлен аналог с дополнительным остатком метионина на N-конце, например: Соматонорм™ (Somatonorm™, Pharmacia Upjohn/Pfizer).

Гормон роста имеет схожую топологию с другими членами белкового семейства гормона роста, пролактином (PRL) и плацентарным лактогеном (PL). Гормон роста классифицируют как белок, содержащий пучок из четырех спиралей (фиг.1), имеющий топологию «вверх-вверх-вниз-вниз» с двумя консервативными дисульфидными связями. В частности, гормон роста дикого типа у человека GH (hGH) состоит из 191 аминокислотного остатка и содержит четыре остатка цистеина в положениях 53, 165, 182 и 189, которые стабилизируют пространственную структуру белка путем образования двух внутримолекулярных дисульфидных связей, соединяющих C53 с C165 и C182 с C189, соответственно (фиг.1). Структура hGH была экспериментально определена с помощью рентгеноструктурной кристаллографии в свободной форме (Chantalet L. et al (1995) Protein and Peptide Letters 3, 333-340) и в комплексе со связывающимся с GH белком (внеклеточным доменом GHR человека (hGHR)) (Devos, A.M. et al Science 255, 306, 1992-312 (1992)). Эти структуры депонированы в базе данных Protein Data Bank (PDB) и находятся в свободном доступе (коды доступа в PDB: 1HGU и 1HWG, соответственно). Таким образом, на основании опубликованных структур hGH можно выявить остатки, важные для связывания hGH с hGHR. Кроме того, динамические свойства hGH были исследованы с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (Kasimova M.R. et al. J. Mol. Biol. 318, 679-695, (2002)). Сопоставляя данные рентгеноструктурного анализа и ЯМР, можно определить области hGH, которые имеют высокую степень структурированности и хорошо отличимы от областей, которые менее структурированы и динамичны (Фиг.2). Менее структурированные и динамичные области hGH, как ожидается, особенно чувствительны к протеолитическому расщеплению, и должная стабилизация таких областей привела бы к повышению стабильности к протеолизу.

Пытаясь получить аналоги hGH с требуемыми химическими или биологическими свойствами, hGH подвергали многочисленным экспериментам по мутагенезу. В частности, описаны мутации по цистеинам с различными целями.

В US 2003/0162949 дано раскрытие вариантов членов семейства супергенов GH, различающихся по остаткам цистеина. Предложен общий способ создания сайт-специфичных, биологически активных конъюгатов этих белков. Способ включает добавление цистеиновых остатков в несущественные области белков или замену цистеиновыми остатками несущественных аминокислот в белках с применением сайт-направленного мутагенеза, а затем - ковалентную сшивку цистеин-реактивного полимера или другого типа цистеин-реактивного остатка с белками через добавленный остаток цистеина.

В WO 02/055532 описаны созданные генно-инженерными методами мутантные формы hGH, содержащие по меньшей мере один не полипептидный фрагмент, присоединенный ковалентно, в частности, мутантные формы hGH, в которых введенный остаток цистеина применяли для пегилирования.

В US 5951972 описываются физиологически активные производные природных и рекомбинантных белков и полипептидов млекопитающих и человека, в которых по меньшей мере один имеющий природное происхождение или внесенный остаток цистеина в составе белка служит для образования производных с различными заместителями.

Протеолитическое расщепление hGH подробно исследовано. Длинная петля, состоящая из остатков 128-154, содержит предполагаемые сайты расщепления для нескольких протеаз, таких как тромбин, плазмин, коллагеназа, субтилизин и химотрипсино-подобные сериновые протеазы. Соответственно, было показано, что эта часть hGH особенно чувствительна к протеолитическому расщеплению (Lewis, U.J. Ann. Rev. Physiol. 46, 33-42, (1984)). Ферменты, которые. согласно сообщениям, способны осуществлять деградацию hGH, включают тромбин, плазмин, субтилизин, химотрипсино-подобные сериновые протеазы и калликреины.

Деградация hGH была исследована в ткани крыс (Garcia-Barros et al. J. Endocrinol. Invest. 23, 748-754, (2000)).

Было обнаружено, что в щитовидной железе крыс химотрипсино-подобные протеазы, проводящие расщепление предпочтительно по объемным и липофильным аминокислотным остаткам, сначала расщепляют пептидную связь между Y143 и S144, в результате чего образуются молекула из двух цепей, а затем, благодаря расщеплению связи между Y42 и S43, происходит высвобождение N-концевого пептида F1-Y42. Расщепленная петля в молекуле из двух цепей подвергается дальнейшему расщеплению между F146 и D147 химотрипсино-подобными протеазами и затем - подвергается действию карбоксипептидаз.

Сообщалось о нескольких способах получения аналогов hGH, стабилизированных в отношении протеолитической деградации.

Авторы публикации Alam et al., J. Biotech. 65, 183-190 (1998)) сконструировали мутантные формы hGH, устойчивые к тромбину и плазмину с помощью специфических точечных мутаций. Тромбин специфически расщепляет hGH между R134 и T135, и несущие две мутации, R134D, T135P, формы давали вариант hGH, устойчивый к расщеплению тромбином, а несущие три мутации, R134D, T135P, K140A, формы приводили к устойчивости к плазмину. Кроме того, последняя мутантная форма hGH была устойчива к протеолизу ферментами плазмы человека в течение периода 7 дней.

В ЕР 534568 описываются мутантные формы hGH, стабилизированные в отношении протеолитической деградации с помощью внесения мутаций с заменой R134 на аланин, лейцин, треонин, фенилаланин, пролин или гистидин.

В WO 2004/022593/Nautilus описываются общие способы крупномасштабной направленной эволюции для получения модифицированных цитокинов, включая варианты GH, с повышенной протеолитической стабильностью.

В WO 2006/048777/Nautilus, в частности, описаны модифицированные аналоги hGH с улучшенной протеолитической стабильностью. Аналоги содержат от одной до пяти мутаций в положениях 1-55, 57, 58, 60-63, 67-87, 89-91, 93, 95-100, 102-128, 131-132, 135-139, 141, 142, 144, 148-182, 184, 185 и 187-191. Внесение цистеиновых остатков потенциально может привести к образованию нежелательных сшитых дисульфидными связями димеров, и в WO 2006/048777 замена аминокислотных остатков на цистеин специально исключена из объема изобретения; в WO 2006/048777 (p.65) указано: «Замещение аминокислот цистеиновыми остатками однозначно исключается, так как это изменение потенциально могло бы привести к образованию межмолекулярных дисульфидных связей».

Имеется очевидная необходимость в разработке соединений hGH, которые устойчивы к протеолитической деградации. Такие стабилизированные соединения должны демонстрировать повышенную стабильность в отношении протеолитического расщепления, сохраняя при этом требуемые биологический свойства hGH. Подобные молекулы GH имели бы повышенную стабильность, замедленный клиренс и/или увеличенный период полувыведения in vivo.

Кроме того, хорошо известно, что они изменяют свойства и характеристики пептидов при конъюгации групп с пептидом. в результате чего необходимым образом изменяются свойства пептида. Такая конъюгация в общем случае требует наличия определенных функциональных групп в пептиде для прохождения реакции с другой функциональной группой в конъюгирующей группе. В типичном случае аминогруппы, такие как N-концевая аминогруппа или ε-аминогруппа лизина, применяли в сочетании с пригодным ацилирующим реагентом. В соответствии с другим вариантом, к белкам можно присоединять полиэтиленгликоль (ПЭГ) или его производные. См. обзор в публикации Exp. Opion. Ther. Patent. 14, 859-894, (2004). Показано, что присоединение ПЭГ к гормону роста может оказывать положительное влияние на период полувыведения гормона роста из плазмы, см. WO 03/044056.

Ранее описано применение карбоксипептидаз для модификации С-концевых пептидов. В WO 92/05271 раскрывается применение карбоксипептидаз и нуклеофильных соединений для амидирования С-концевой карбоксильной группы, и в WO 98/38285 описываются варианты карбоксипептидазы Y, пригодные, в частности, для этой цели.

В EP 243 929 раскрывается применение карбоксипептидазы для внедрения полипептидов, репортерных групп или цитотоксических агентов в C-концевую часть белков или полипептидов.

В WO 2005/035553 описаны способы селективной конъюгации пептидов с помощью ферментативного внедрения функциональной группы на C-конец пептида.

Активированные галогенопроизводные и имиды малеиновой кислоты являются некоторыми из функциональных групп, наиболее часто применяемых при присоединении конъюгатов к сульфгидрильным группам в составе пептидов (G.Т. Hermanson in Bioconjugate Techniques 2. Ed. 2008, Elsevier).

Ранее для изменения свойств пептидов применяли трансглутаминазу. В пищевой промышленности и, в частности, в молочной промышленности доступны многие способы, например, для поперечной сшивки пептидов с применением трансглутаминаз. В других документах раскрыто применение трансглутаминазы для изменения свойств физиологически активных пептидов. В EP 950665, EP 785276 и публикации Sato, Adv. Drug Delivery Rev. 54, 487-504, (2002) раскрыта прямая реакция между пептидами, содержащими по меньшей мере один остаток Gln, и ПЭГ с добавленной функциональной аминогруппой или схожими лигандами в присутствии трансглутаминазы, а в публикации Wada, Biotech. Lett. 23, 1367-1372, (2001) раскрывается прямое конъюгирование β-лактоглобулина с жирными кислотами с помощью трансглутаминазы. В международной заявке на патент, опубликованной под номером WO 2005/070468, раскрывается применение трансглутаминазы для внедрения «рукоятки», к которой может быть присоединена конъюгирующая группа.

Гормон роста является ключевым гормоном, участвующим в регуляции не только соматического роста, но также в регуляции метаболизма белков, углеводов и липидов. Основной функцией гормона роста является активация роста. Гормон роста человека представляет собой белок из 191 аминокислотного остатка, имеющий последовательность:

Введение гормона роста человека и его близкородственных вариантов применяют для лечения различных заболеваний, связанных с дефицитом гормона роста. Так как гормон роста является полипептидом, его вводят парентерально, т.е., с помощью иглы. Кроме того, для гормона роста характерен относительно короткий период полувыведения, следовательно, необходимы частые введения, что сопровождается болью и неудобством для пациента. Поэтому сохраняется потребность в получении соединений гормона роста с улучшенными фармакологическими свойствами, такими как, например, увеличенный период полувыведения.

Настоящее изобретение направлено на создание новых конъюгатов соединений гормона роста с улучшенными фармакокинетическими и фармакологическими свойствами, а также способов их получения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Биодоступность вводимого подкожно фармацевтического соединения может быть связана со скоростью абсорбции. Способность соединения проникать через плотные контакты подкожных капилляров может быть, в частности, связана с его физическими и химическими свойствами, а также молекулярной массой или гидродинамическим объемом соединения. Белковый конъюгат, такой как пегилированный hGH (ПЭГ-hGH) с ПЭГ, имеющим молекулярную массу 40 кДа, обладает кажущейся молекулярной массой 150-250 кДа. Молекула hGH с ковалентно связанным альбумином обладает молекулярной массой 87 кДа, тогда как молекула hGH с нековалентно связанным альбумином будет часть времени находиться в диссоциированном от альбумина состоянии и, следовательно, иметь молекулярную массу 22 кДа.

Предполагается, что время, в течение которого сохраняется диссоциированное состояние, зависит, по меньшей мере частично, от аффинности альбумин-связывающего фрагмента. Таким образом, скорость абсорбции молекулы hGH с нековалентно связанным альбумином может быть выше, чем у ПЭГ-hGH. Повышенную скорость абсорбции можно достичь при применении альбумин-связывающих фрагментов, обладающих более низкой аффинностью к альбумину.

Кроме того, физические и химические свойства линкера и/или спейсера, обеспечивающих присоединение альбумин-связывающего фрагмента к hGH, будут влиять на функциональные свойства соединений.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что соединения гормона роста (GH) с одиночной мутацией с внесением Cys и/или дополнительным дисульфидным мостиком можно селективно присоединять к альбумин-связывающему радикалу - через гидрофильный спейсер, который разделяет GH и альбумин-связывающий радикал, при этом в типичном случае химический фрагмент обладает показателем mLogP<0 - или cLogP<0,5, с получением конъюгатов GH с улучшенными свойствами, такими как высокая активность in vitro или, например, увеличенный период полувыведения in vivo, или, например, повышенная устойчивость к протеолитической деградации, возможно, в сочетании с более длительным профилем активности in vivo. При присоединении альбумин-связывающего радикала через гидрофильный спейсер к одиночной мутации с внесением Cys биологическая активность может сохраняться и может достигаться улучшение одного или нескольких из упомянутых выше свойств. Такие улучшения также достигаются, когда альбумин-связывающий радикал через гидрофильный спейсер присоединяют к гормону роста, имеющему дополнительный дисульфидный мостик, например, к N-концу, к положению 40 или положению 141 в составе hGH. Соединение гормона роста также может содержать и одиночную мутацию с внесением Cys, и дополнительный дисульфидный мостик, и в таком случае альбумин-связывающий радикал через гидрофильный спейсер присоединяют к одиночной мутации с внесением Cys.

В широком смысле настоящее изобретение относится к конъюгату гормона роста, который содержит соединение гормона роста (GH), имеющее:

a) одиночную мутацию с внесением Cys,

b) дополнительный дисульфидный мостик или

c) одиночную мутацию с внесением Cys и дополнительный дисульфидный мостик,

при этом альбумин-связывающий радикал присоединен через гидрофильный спейсер к указанному GH, или относится к его фармацевтически приемлемой соли.

В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения стабильные соединения hGH содержат дополнительную дисульфидную связь (или связи). Дисульфидные связи образуются между парами цистеинов, один или оба из которых внесены посредством точечных мутаций в последовательность hGH дикого типа.

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения стабильные соединения hGH содержат дополнительные цистеины. Цистеины вносят посредством точечных мутаций в последовательности hGH дикого типа.

В дополнительном варианте воплощения настоящего изобретения стабильные соединения hGH содержат дополнительную дисульфидную связь (или связи) и один или несколько дополнительных цистеинов. Дополнительная дисульфидная связь (или связи) образуются между парами дополнительных цистеинов, а дополнительные цистеины внесены посредством точечных мутаций в последовательности hGH дикого типа.

Дополнительно, настоящее изобретение основано на наблюдении того, что добавление альбумин-связывающего радикала через гидрофильный спейсер в гормон роста человека (hGH) может быть осуществлено селективно, при этом существенная доля активности сохраняется. Предпочтительно, альбумин-связывающий радикал присоединяют через гидрофильный спейсер к положению(иям), соответствующему внесенному цистеину (или цистеинами) и/или к положению глутамина 40 и/или к положению глутамина 141 и/или к N-концу в составе hGH, имеющего последовательность SEQ ID NO:1. Применение трансглутаминазы (TGase), и в частности, TGase из Streptoverticillium mobaraenae или Streptomyces lydicus, позволяет проводить селективное присоединение альбумин-связывающего радикала через гидрофильный спейсер к положению 40 или положению 141, а остальные 11 остатков глутамина остаются незатронутыми, несмотря на тот факт, что глутамин является субстратом трансглутаминазы.

Таким образом, в одном из вариантов воплощения настоящего изобретения соединение гормона роста (GH) сшито с одним альбумин-связывающим радикалом через гидрофильный спейсер. В типичном случае альбумин-связывающий радикал присоединен к N-концу, или к положению 18, 30, 40, 42, 62, 69, 88, 95, 98, 99, 100, 101, 102, 108, 135, 141 или 154 в составе hGH через гидрофильный спейсер. В дополнительных вариантах воплощения два альбумин-связывающих радикала присоединены к месту одиночной мутации с внесением Cys и к любому одному положению из перечисленных выше, например, к N-концу, положению 40 или положению 141 в составе hGH, через гидрофильный спейсер.

Конъюгаты соединений гормона роста по настоящему изобретению обладают более высокой скоростью подкожной абсорбции, по сравнению с пегилированным hGH, и, таким образом, вызывают в меньшей степени или не вызывают липоатрофию. Дополнительно, альбумин-связывающий радикал и гидрофильный спейсер являются биодеградируемыми, в отличие от ПЭГ.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа улучшения свойств GH посредством конъюгации указанного белка в соответствии со способами по настоящему изобретению.

Дополнительные особенности изобретения относятся к выделенным соединениям гормона роста (GH), содержащим одиночную мутацию с внесением Cys, дополнительную дисульфидную связь или к соединениям гормона роста, содержащим одиночную мутацию с внесением Cys и дополнительную дисульфидную связь. Дополнительной целью изобретения было стремление сделать такие соединения растворимыми.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1 показывает пространственную структуру белка гормона роста.

Фиг.2 показывает аминоксилотную последовательность белка гормона роста.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В настоящем контексте термин «соединение гормона роста» при использовании в этом документе означает гормон роста, принадлежащий млекопитающему, такой как гормон роста человека, коровы или свиньи, и рекомбинантный гормон роста, такой как рекомбинантный гормон роста человека, коровы или свиньи, а также варианты и мутантные формы таких гормонов роста. При использовании в этом документе «GH» и «соединение гормона роста» являются взаимозаменяемыми. В случае, если GH является вариантом гормона роста, принадлежащего млекопитающему, например, hGH и рекомбинантного hGH, понимается, что указанный вариант является соединением, полученным путем замены одного или нескольких аминокислотных остатков в последовательности гормона роста, например hGH, на другую аминокислоту природного или неприродного происхождения; и/или путем добавления одной или нескольких аминокислот природного или неприродного происхождения к последовательности гормона роста, например hGH; и/или путем делеции одного или нескольких аминокислотных остатков из последовательности гормона роста, например hGH, при этом за любыми из этих этапов, возможно, следует дополнительное получение производных одного или нескольких аминокислотных остатков. В типичном случае GH обладает по меньшей мере 80% идентичностью относительно hGH, и, в типичном случае, по меньшей мере 10% активности гормона роста, присущей hGH, согласно определению с помощью способа анализа (I) (пример 46), описанному в этом документе.

В данном контексте термин «альбумин-связывающий радикал» при использовании в этом документе означает радикал, который нековалентно связывается с сывороточным альбумином человека. Альбумин-связывающий радикал, присоединенный к соединению гормона роста (GH), в типичном случае обладает аффинностью связывания в отношении сывороточного альбумина человека, которая составляет менее чем примерно 10 мкМ, или даже менее чем примерно 1 мкМ. Известен ряд альбумин-связывающих радикалов, принадлежащих к линейным и разветвленным липофильным фрагментам, содержащим 12-40 атомов углерода, соединениям с циклопентанофенантреновым скелетом и/или пептидам, включающим 10-45 аминокислотных остатков, и т.д. Альбумин-связывающие свойства можно измерить с помощью поверхностного плазменного резонанса, как описано в публикации J. Biol. Chem. 277(38), 35035-35042, (2002).

Термин «гидрофильный спейсер» при использовании в этом документе означает спейсер, который разделяет соединение гормона роста и альбумин-связывающий радикал посредством химического фрагмента, который содержит по меньшей мере 5 атомов, отличных от атомов водорода, и при этом 30-50% этих атомов являются либо N, либо O.

Подразумевается, что в данном контексте термин «трансаминирование» и родственные термины обозначают реакцию, при которой происходит реакция обмена между атомом азота амидогруппы боковой цепочки глутамина и атомом азота другого соединения, в частности, атомом азота в составе другого азотсодержащего нуклеофила.

Трансглутаминаза (E.C.2.3.2.13) известна также как протеин-глутамин-γ-глутамилотрансфераза и катализирует реакцию с общей схемой:

.

Q-C(O)-NH₂ (аминосодержащий акцептор) может представлять собой пептид или белок, включающий остаток глутамина, и Q′-NH₂ (аминосодержащий донор) представляет собой аминосодержащий нуклеофил. В соответствии с другим вариантом, Q-C(O)-NH₂ и Q′-NH₂ могут представлять собой аминосодержащий акцептор и содержащий лизин пептид или белок, соответственно. В настоящем изобретении, однако, Q-C(O)-NH₂ представляет собой гормон роста, содержащий остаток глутамина, и Q′-NH₂ представляет собой аминосодержащий нуклеофил, как указано выше.

Примеры полезных трансглутаминаз включают трансглутаминазы микробного происхождения, например, такие как трансглутаминазы из Streptomyces mobaraense, Streptomyces cinnamoneum и Streptomyces griseocarneum (все раскрыты в US 5156956, содержание которого включено сюда в качестве ссылки), а также из Streptomyces lavendulae (раскрыта в US 5252469, содержание которого включено сюда в качестве ссылки) и Streptomyces ladakanum (JP 2003/199569, содержание которого включено сюда в качестве ссылки). Следует отметить, что члены выделяемого ранее рода Streptoverticillium сейчас включены в род Streptomyces (Kaempfer, J. Gen. Microbiol. 137, 1831-1892, (1991)). Другие полезные трансглутаминазы микробного происхождения были выделены из Bacillus subtilis (раскрыта в US 5731183, содержание которого включено сюда в качестве ссылки) и из различных представителей миксомицетов. Другими примерами полезных трансглутаминаз микробного происхождения являются трансглутаминазы, описанные в WO 96/06931 (например трансглутаминаза из Bacilus lydicus) и WO 96/22366, содержание которых включено сюда в качестве ссылок. Полезные трансглутаминазы не микробного происхождения включают трансглутаминазу из печени морской свинки и трансглутаминазы из различных морских видов, таких как рыба тай красный, Pagrus major (раскрыта в ЕР - 0555649, содержание которого включено сюда в качестве ссылки) и японская устрица Crassostrea gigas (раскрыта в US 5736356, содержание которого включено сюда в качестве ссылки).

Предполагается, что в данном контексте термин «недоступный» указывает на то, что что-то отсутствует или фактически отсутствует в том смысле, что этого невозможно достичь. Когда утверждается, что функциональные группы в белке, который будут конъюгировать, недоступны, подразумевается, что это свидетельствует о том, что указанная функциональная группа отсутствует в белке или, если она присутствует, каким-либо образом защищена от участия в реакциях. Например, указанная функциональная группа может быть погружена глубоко внутрь структуры белка, таким образом, что она экранирована от участия в реакции. Очевидно, что то, является ли функциональная группа доступной или нет, зависит от условий протекания реакции. Можно предположить, что, например, в присутствии денатурирующих агентов или при повышенных температурах белок может разворачиваться и экспонировать функциональные группы, которые в других случаях недоступны. При этом понимается, что «недоступный» означает «недоступный в условиях прохождения реакции, выбранных для конкретной рассматриваемой реакции».

Подразумевается, что термин «алкан» или «алкил» обозначает насыщенный линейный, разветвленный или циклический углеводород. Если не указано другое количество атомов углерода, подразумевается, что термин обозначает углеводороды с количеством атомов углерода от 1 до 30 (включая оба крайние значения), например от 1 до 20 (включая оба крайние значения), например от 1 до 10 (включая оба крайние значения), например от 1 до 5 (включая оба крайние значения). Термины «алкил» и «алкилен» обозначают соответствующие радикалы с одной или двумя свободными валентностями, соответственно.

Термин «C_1-6 алкил» обозначает линейный или разветвленный насыщенный углеводород, содержащий от одного до шести атомов углерода включительно. К таким группам относятся, в качестве неограничивающих примеров, метил, 2-пропил, 1-бутил, 2-бутил, 2-метил-2-пропил, 2-метил-1-бутил и н-гексил.

Термин «C_3-10 циклоалкил» в типичном случае обозначает циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, циклононил и циклодеканил.

Подразумевается, что термин «алкен» обозначает линейные, разветвленные и/или циклические углеводороды, содержащие по меньшей мере одну двойную связь углерод-углерод. Если не указано другое количество атомов углерода, подразумевается, что термин обозначает углеводороды с количеством атомов углерода от 2 до 30 (включая оба крайние значения), например от 2 до 20 (включая оба крайние значения), например от 2 до 10 (включая оба крайние значения), например от 2 до 5 (включая оба крайние значения). Термины «алкенил» и «алкенилен» обозначают соответствующие радикалы с одной или двумя свободными валентностями, соответственно.

Подразумевается, что термин «алкин» обозначает линейные, разветвленные и/или циклические углеводороды, содержащие по меньшей мере одну тройную связь углерод-углерод, и они, возможно, могут включать одну или несколько двойных связей углерод-углерод. Если не указано другое количество атомов углерода, подразумевается, что термин обозначает углеводороды с количеством атомов углерода от 2 до 30 (включая оба крайние значения), например от 2 до 20 (включая оба крайние значения), например от 2 до 10 (включая оба крайние значения), например от 2 до 5 (включая оба крайние значения). Термины «алкинил» и «алкинилен» обозначают соответствующие радикалы с одной или двумя свободными валентностями, соответственно.

Подразумевается, что термин «гомоциклическое ароматическое соединение» обозначает ароматические углеводороды, такие как бензол и нафталин.

Подразумевается, что термин «гетероциклическое соединение» обозначает циклическое соединение, содержащее 5, 6 или 7 атомов в кольце, и которых 1, 2, 3 или 4 гетероатома выбраны из N, O и/или S. Примеры включают гетероциклические ароматические соединения, такие как тиофен, фуран, пиран, пиррол, имидазол, пиразол, изотиазол, изооксазол, пиридин, пиразин, пиримидин, пиридазин, а также их частично или полностью гидрогенизированные эквиваленты, такие как пиперидин, пиразолидин, пирролидин, пиролин, имидазолидин, имидазолин, пиперазин и морфолин.

Подразумевается, что термины «гетероалкан», «гетероалкен» и «гетероалкин» обозначают алканы, алкены и алкины, как указано выше, в которых в структуру указанных фрагментов вставлены один или несколько гетероатомов или групп.Примеры гетерогрупп и гетероатомов включают -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂-, -C(O)- -C(S)- и -N(R*)-, где R* является водородом или C₁-C₆-алкилом. Примеры гетероалканов включают:

,	,	,
,	и

Предполагается, что термин «радикал» или «радикал с двумя свободными валентностями» обозначает соединение, у которого были удалены один или два атома водорода, соответственно. Когда это указано особо, радикал также может обозначать фрагмент, образованный формальным удалением более крупной группы атомов, например гидроксила, из соединения.

Предполагается, что термин «галоген» обозначает членов седьмой главной группы периодической таблицы элементов, например F, CI, Вг и I.

В данном контексте предполагается, что термин «арил» обозначает радикал карбоциклического ароматического кольца или радикал системы слитых ароматических колец, где по меньшей мере одно из колец является ароматическим. Типичные арильные группы включают фенил, бифенилил, нафтил и т.п.

Термины «гетероарил» или «гетарил» при использовании в этом документе, сами по себе или в сочетаниях, обозначают радикал ароматического кольца, содержащий в кольце, например, от 5 до 7 атомов, или радикал системы слитых ароматических колец, содержащий в кольцах, например, от 7 до 18 атомов, где по меньшей мере одно кольцо является ароматическим, содержащие один или несколько гетероатомов в качестве атомов колец, выбранные из гетероатомов азота, кислорода или серы, при этом оксиды азота, монооксиды серы и диоксиды серы являются допустимыми заместителями в гетероароматической системе. Примеры включают фуранил, тиенил, тиофенил, пирролил, имидазолил, пиразолил, триазолил, тетразолил, тиазолил, оксазолил, изоксазолил, оксадиазолил, тиадиазолил, изотиазолил, пиридинил, пиридазинил, пиразинил, пиримидинил, хинолинил, изохинолинил, бензофуранил, бензотиофенил, индолил и индазолили и т.п.

Предполагается, что термин «конъюгат» (в качестве существительного) обозначает модифицированный белок, т.е., белок с фрагментом, присоединенным к нему с целью модификации свойств указанного белка. Предполагается, что глагол «конъюгировать» обозначает процесс связывания фрагмента с белком с целью модификации свойств указанного белка.

Термин «одиночный Cys» или «свободный цистеин» обозначает остаток цистеина, который не участвует в образовании двойной связи. Таким образом, белок может включать один или несколько одиночных остатков Cys в дополнение к одной или нескольким дополнительным дисульфидным мостикам, при условии что указанные одиночные остатки Cys не приводят к образованию внутреннего дисульфидного мостика (или мостиков).

При использовании в этом документе термин «пролекарство» обозначает биогидролизуемые амиды, биогидролизуемые сложные эфиры, а также включает:

a) соединения, являющиеся пролекарством, в котором активируемая при биогидролизе функциональная активность заключена в соединении по настоящему изобретению, и b) соединения, которые могут быть окислены или восстановлены в биологических условиях по данной функциональной группе с образованием лекарственной субстанции по настоящему изобретению. Примеры таких функциональных групп включают 1,4-дигидропиридин, N-алкилкарбонил-1,4-дигидропиридин, 1,4-циклогексадиен, трет-бутил и т.п.

При использовании в этом документе термин «биогидролизуемый сложный эфир» обозначает сложный эфир лекарственной субстанции (например, соединения по изобретению), который a) либо не препятствует проявлению биологической активности исходной субстанции, но придает этой субстанции полезные свойства in vivo, такие как длительность действия, регулируемое начало действия и т.п., или b) биологически не активен, но легко превращается in vivo в организме субъекта в биологически активный компонент. Полезными являются, например, повышенная растворимость или способность биогидролизуемого сложного эфира при пероральном приеме абсорбироваться из кишечника и превращаться в соединение по настоящему изобретению в плазме. Специалистам в данной области известны многие примеры таких веществ, которые включают, например, сложные эфиры низших алкилов (таких, как C₁-C₄), ацилоксиалкилов, сложные эфиры низших алкоксиацилоксиалкилов, сложные алкоксиацилоксиэфиры, сложные эфиры алкилациламиноалкилов и сложные эфиры холинов.

При использовании в этом документе термин «биогидролизуемый амид» обозначает амид лекарственной субстанции (например, соединения по настоящему изобретению), который либо a) не препятствует проявлению биологической активности исходной субстанции, но придает этой субстанции полезные свойства in vivo, такие как длительность действия, начало действия и т.п., либо b) биологически не активен, но легко превращается in vivo в организме субъекта в биологически активный компонент.Полезными являются, например, повышенная растворимость или способность биогидролизуемого амида при пероральном приеме абсорбироваться из кишечника и превращаться в соединение по настоящему изобретению в плазме. Специалистам в данной области известны многие примеры таких веществ, которые включают, например амиды низших алкилов, амиды а-аминокислот, алкоксиациламиды и алкиламиноалкилкарбониламиды.

В данном контексте предполагается, что термин «фармацевтически приемлемая соль» обозначает соли, которые не являются вредными для пациента. Такие соли включают фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли, фармацевтически приемлемые соли металлов, соли аммония и алкилированного аммония. Кислотно-аддитивные соли включают соли неорганических кислот, а также органических кислот. Представительные примеры пригодных неорганических кислот включают хлористоводородную, бромистоводородную, йодистоводородную, фосфорную, серную, азотную кислоты и т.п. Представительные примеры пригодных органических кислот включают муравьиную, уксусную, трихлоруксусную, трифторуксусную, пропионовую, бензойную, коричную, лимонную, фумаровую, гликолевую, молочную, малеиновую, яблочную, малоновую, миндальную, щавелевую, пикриновую, пировиноградную, салициловую, янтарную, метансульфоновую, этансульфоновую, винную, аскорбиновую, памоевую, бисметиленсалициловую, этандисульфоновую, глюконовую, цитраконовую, аспарагиновую, стеариновую, пальмитиновую, ЭДТА, гликолевую, p-аминобензойную, глутаминовую, бензенсульфоновую, p-толуолсульфоновую кислоты и т.п. Дополнительные примеры фармацевтически приемлемых аддитивных солей неорганических и органических кислот включают фармацевтически приемлемые соли, перечисленные в публикации J. Pharm. Sci. 66, 2, (1977), содержание которой включено сюда в качестве ссылки. Примеры солей металлов включают соли лития, натрия, калия, магния и т.п. Примеры солей аммония и алкилированного аммония включают соли аммония, метиламмония, диметиламмония, триметиламмония, этиламмония, гидроксиэтиламмония, диэтиламмония, бутиламмония, тетраметиламмония и т.п.

«Терапевтически эффективное количество» соединения при использовании в этом документе означает количество, достаточное для того, чтобы вылечить, ослабить или частично прекратить клинические проявления данного заболевания и его осложнений. Количество, достаточное для достижения этой цели, называется «терапевтически эффективным количеством». Эффективные количества для каждой цели будут зависеть от степени тяжести заболевания или травмы, а также от массы тела и общего состояния субъекта. Понятно, что определение