Новая вирусная векторная конструкция для нейронспецифического оптимизированного непрерывного синтеза dopa in vivo

Новая вирусная векторная конструкция для нейронспецифического оптимизированного непрерывного синтеза dopa in vivo

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка соответствует международной заявке, согласно которой испрашивается приоритет по предварительной заявке на выдачу патента США №61/259502. Все патентные и непатентные ссылки, процитированные в настоящей заявке, тем самым включены посредством ссылки во всей их полноте.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к вирусным векторным конструкциям, в частности к одновекторным rAAV конструкциям, содержащим полинуклеотидные последовательности, кодирующие два полипептида, подлежащих дифференциальной экспрессии в клетке-мишени. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим указанный вектор, к доставке в ткань головного мозга человека и к медицинскому применению указанного вектора для лечения заболеваний, связанных с катехоламиновой дисфункцией. В частности, настоящее изобретение относится к лечению заболеваний, связанных с недостаточностью допамина, таких как болезнь Паркинсона и родственные нарушения.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Болезнь Паркинсона поражает людей возрастом от 30 лет и старше: Средний возраст больных, у которых начинается заболевание, составляет приблизительно 60 лет. Основными клиническими симптомами являются ригидность, брадикинезия и тремор в покое. Кроме того, при заболевании может проявляться ряд других симптомов, таких как гипотония, когнитивное нарушение, постуральная неустойчивость и многих других.

Это заболевание преимущественно является нарушением базальных ганглиев, вызванным дегенерацией нигростриарной допаминергической системы в головном мозге (нервные клетки, использующие допамин (DA) в качестве вещества их передачи сигнала, расположенные в черном веществе ствола головного мозга с проецированием на скорлупу и хвостатое ядро). Нарушение развивается в течение многих лет.

В настоящее время стандартное лечение основано на замещении допамина введением L-DOPA (который превращается в допамин в головном мозге) или других стимулирующих допаминовый рецептор средств. Хотя стратегии современного лечения, направленные на замещение недостаточности допамина, зачастую очень эффективны в ранней фазе заболевания (до 7-10 лет), в конце концов, большинство пациентов начинают испытывать ослабление ответа на лечение и усиление побочных эффектов. Наиболее проблемными из них является L-DOPA-индуцированные дискинезии, которые появляются в результате лечения существующим лекарственным средством выбора - L-DOPA или агонистами допамина. Поскольку пациенты с болезнью Паркинсона, как правило, живут со своим заболеванием все дольше в связи с улучшением лечения в последние годы, L-DOPA-индуцированная дискинезия представляет собой растущую проблему, особенно для пациентов с ранним началом заболевания. Сегодня существуют несколько вариантов лечения дискинезии, но они часто сложны, и доступность их ограничена.

Один подход, который был протестирован на доклинических моделях животных болезни Паркинсона, представляет собой усовершенствование классической фармакологической стратегии замены допамина с использованием подхода генной терапии для достижения локального замещения допамина в скорлупе и хвостатом ядре, где наиболее сильно проявляется недостаточность допамина. Такой подход называется «стратегией замещения фермента». Обоснование этого метода лечения связано с клиническими наблюдениями пациентов с болезнью Паркинсона (PD), которые позволяют предположить, что резкие патологические непроизвольные движения (т.е. дискинезии), индуцированные пероральным лекарственным препаратом L-DOPA, могут быть облегчены с помощью агонистов L-DOPA или DA, введенных инфузией либо внутривенно, либо дуоденально. Таким образом, нынешняя гипотеза заключается в том, что дискинезии развиваются, по меньшей мере частично, из-за периодической, импульсной доставки DA, к чему приводит схема перорального приема L-DOPA. Эти пациенты выигрывают от непрерывной стимуляции DA, также благодаря резкому сокращению общего времени, проведенного в «выключенном» состоянии.

Три различных фермента необходимы для продуцирования допамина, а именно тирозингидроксилаза (ТН), GTP -циклогидролаза 1 (GCH1) и декарбоксилаза ароматических аминокислот (AADC). Два первых регулируют продуцирование L-DOPA из тирозина (аминокислоты, имеющейся в пище), тогда как AADC превращает L-DOPA в допамин. Ни один из этих ферментов не является уникальным для допаминергических нейронов, и также может присутствовать в недопаминергических клетках. Добавление этих ферментов в денервированную область-мишень может привести к локальному продуцированию L-DOPA или допамина. Преимущество этой стратегии может заключаться в обеспечении константного продуцирования L-DOPA по сравнению с традиционными пероральными методами лечения, при которых содержание L-DOPA в плазме крови (а также содержание в головном мозге) колеблется. Это также локализует лечение в области головного мозга, где нужна замена, тогда как другие части организма не подвергаются лечения, что дает благоприятное отношение эффекта к побочному эффекту.

В опубликованных доклинических данных, полученных с использованием этого подхода, представлены следующие наблюдения:

1. Экспрессия всех трех генов может быть индуцирована в скорлупе и хвостатом ядре путем трансдукции с использованием нескольких rAAV векторов [Kaplitt МГ, et al.: Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain; Nat Genet 1994 8 148-54; Mandel RJ, et al.: Characterization of intrastriatal recombinant adeno-associated virus-mediated gene transfer of human tyrosine hydroxylase and human GTP-cyclohydrolase I in a rat model of Parkinson's disease; J Neurosci 1998 18 4271-84; Shen Y, et al.: Triple transduction with adeno-associated virus vectors expressing tyrosine hydroxylase, aromatic-L-amino-acid decarboxylase, and GTP cyclohydrolase I for gene therapy of Parkinson's disease; Hum Gene Ther 2000 11 1509-19].

2. Эффективность TH зависит от GCH1 (которая продуцирует кофактор тетрагидробиоптерин, ВН4). Mandel и сотрудники показали это путем измерения содержания L-DOPA с использованием микродиализа [Mandel RJ, et al.: Characterization of intrastriatal recombinant adeno-associated virus-mediated gene transfer of human tyrosine hydroxylase and human GTP-cyclohydrolase I in a rat model of Parkinson's disease; J Neurosci 1998 18 4271-84].

3. На обезьяньей модели болезни Паркинсона (МРТР-модель) экспрессия AADC может приводить к более эффективному превращению перорального L-DOPA, и благодаря этому механизму улучшается функция по показателю двигательной активности UPDRS обезьяны (UPDRS является стандартной шкалой клинической оценки симптомов Паркинсона) [Bankiewicz KS, et al.: Long-term clinical improvement in MPTP-lesioned primates after gene therapy with AAV-hAADC; Mol Ther 2006 14 564-70].

4. Экспрессия всех трех генов может привести к улучшению функции и на крысиных моделях [Shen Y, et al.: Triple transduction with adeno-associated virus vectors expressing tyrosine hydroxylase, aromatic-L-amino-acid decarboxylase, and GTP cyclohydrolase I for gene therapy of Parkinson's disease; Hum Gene Ther 2000 11 1509-19], и на обезьяньих моделях [Muramatsu S, et al.: Behavioral recovery in a primate model of Parkinson's disease by triple transduction of striatal cells with adeno-associated viral vectors expressing dopamine-synthesizing enzymes. Hum Gene Ther 2002 13 345-54] болезни Паркинсона.

5. Экспрессия ТН и GCH1 является достаточной для достижения содержания L-DOPA в полосатом теле, которое может привести к функциональному улучшению на крысиной модели болезни Паркинсона и, кроме того, может значительно снизить индуцированную L-DOPA дискинезию [Kirik D, et al.: Reversal of motor impairments in parkinsonian rats by continuous intrastriatal delivery of L-dopa using rAAV-mediated gene transfer; Proc Natl Acad Sci 2002 99 4708-13; Carlsson et al.: Reversal of dyskinesias in an animal model of Parkinson's disease by continuous L-DOPA delivery using rAAV vectors; Brain 2005 128 559-69]. Однако эти исследования были проведены с использованием двух отдельных векторов AAV серотипа 2, которые содержали либо ген GCH1, либо ген ТН, оба под контролем большого синтетического промотора (промотора b-актина цыпленка, содержащего гамма-глобулиновый интрон кролика, предшествующего энхансерному элементу из цитомегаловирусного промотора, названного промотором b-актина цыпленка СВА). Таким образом, не было никакой возможности контролировать отношение экспрессии двух генов на клеточном уровне; промотор не дает возможность экспрессии, ограниченной нейронами.

В отношении текущего состояния известного уровня техники в области настоящего изобретения в Sun et al. (2004) описан отличный от AAV вирусный вектор экспрессии с двумя единицами транскрипции, каждая из которых регулируется нейронспецифическим промотором. Относительный уровень транскрипции двух единиц не описан. In vitro присутствуют сопоставимые количества клеток, экспрессирующих ТН и GCH-1 при трансдукции вектором и 3-гена, и 4-гена. В обоих случаях ТН и GCH-1 находятся на разных транскриптах. В векторе 4-гена GCH-1 транслируется с сайта IRES (после ORF VMAT-2).

В Shen et al. (2000) описана котрансдукция клеток НЕК-293 AAV-TH, AAV-AADC и AAV-GCH-1. В титриметрическом исследовании клетки 293 трансдуцировали AAV-TH и AAV-AADC и варьирующими количествами AAV-GCH-1. Результаты показали повышение содержания и L-DOPA, и допамина с повышением титра AAV-GCH-1. AAV-GCH-1 тестировали при титрах вплоть до таких же, что и для AAV-TH. Описанные отношения составляют 1:10, 1:2 и 1:1 (AAV-GCH-1:AAV-TH). In vivo генную терапию проводили с отношением двух векторов 1:1 (с AAV-AADC и без такового).

Kirik et al., 2002, и Carlsson et al., 2005, описывают совместное введение смеси 1:1 AAV-TH и AAV-GCH1, при котором титр AAV-TH приблизительно в 3,5 раза превышает AAV-GCH-1 (отношение 1:3,5). Ни в одной из этих ссылок не говорится, почему было использовано это отношение.

В патенте США №7419829 (Oxford Biomedica) описан мутированный элемент WPRE и его применение в трехгенном векторе (EIAV) с ТН, AADC и GCH-1, разделенными последовательностями IRES. Элемент WPRE усиливает экспрессию трех генов в той же степени.

В WO 96/05319 (Arch Development) описаны двухцистронные векторы либо с сайтом IRES, либо с промотором в 5' LTR ретровируса, который контролирует экспрессию цистрона и в 5'-3'-направлении, и в 3'-5'-направлении. В эксперименте с двойной трансдукцией фибробластов описана активность ТН, составляющая в 242,6 пмоль/мг/минута, и активность GCH1, составляющая в 35,8 пмоль/мг/минута. Это выражается в отношении 1:6,8 по активности между двумя ферментами. Кроме того, в ссылке описана оптимальная концентрация ВН4 (500 QM) для достижения максимальной активности ТН. Максимальная концентрация L-DOPA в трансдуцированных ТН клетках превышала 50 QM ВН4 и далее при повышении концентраций ВН4 не повышалась.

Ни в одной из упомянутых ссылок не описан вектор AAV с конструкцией, кодирующей и ТН, и GCH-1. Все одновекторные системы, известные из предшествующего уровня техники, кодирующие и ТН, и GCH-1, были выполнены на вирусных векторах, которые содержат гораздо большие фрагменты нуклеиновой кислоты. Большинство одновекторных систем, известных из предшествующего уровня техники, дополнительно содержат конструкцию экспрессии, кодирующую AADC. AAV векторы для клинических целей предоставляют преимущества по сравнению с одновекторными системами на основе HSV, EIAV и ретровируса. Кроме того, отсутствие AADC также является преимуществом по сравнению с известным уровнем техники, поскольку это приводит к образованию L-DOPA в трансдуцированных клетках вместо DA.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Целью настоящего изобретения является разработка новых молекулярных инструментов для лечения нарушений, для которых существующие стратегии лечения недостаточны, или существующее лечение которых связано с серьезными побочными эффектами, и/или при которых у пациента развивается резистентность к указанному лечению. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новой конструкции экспрессии, регулирующей содержание ферментов, вовлеченных в биосинтез катехоламина, таким образом, применимой в способе восстановления нормального катехоламинового баланса у нуждающегося в этом субъекта. В частности, настоящее изобретение относится к применению указанной конструкции экспрессии в способе лечения нервных нарушений, предпочтительно неизлечимых дегенеративных нервных нарушений, при которых большинство пациентов испытывают ослабление реакции на лечение и усиление побочных эффектов при длительном лечении.

Настоящее изобретение относится преимущественно к лечению болезни Паркинсона, при которой современная стратегия лечения предусматривает введение L-DOPA или других стимулирующих допаминовый рецептор средств. Существующее лечение является эффективным, особенно на ранней фазе заболевания, но при длительном лечении у большинства пациентов развивается индуцированная L-DOPA дискинезия. Считается, что развитие дискинезии связано с доставкой, не являющейся непрерывной, L-DOPA или других стимулирующих допаминовый рецептор агентов. Главной целью в соответствии с настоящим изобретением является усовершенствование современного лечения путем доставки соединений, необходимых для лечения, в частности, болезни Паркинсона, местно, куда необходимо, и с постоянными скоростями, что уменьшает любые побочные эффекты.

Настоящее изобретение относится к одновекторной системе экспрессии, содержащей два полинуклеотида, кодирующие два полипептида, подлежащие местному введению в центральную нервную систему, причем указанная векторная система экспрессии способна дифференциально экспрессировать два кодируемых полипептида для получения точной пропорции экспрессируемых полипептидов, необходимой для оптимального лечения данного нервного нарушения.

Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к одновекторной системе экспрессии, содержащей

a) первую и вторую кассеты экспрессии, причем указанная первая кассета экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, содержащую первую промоторную последовательность, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, причем указанная первая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид GTP-циклогидролазы 1 (GCH1) или его биологически активный фрагмент или вариант, и причем указанная вторая кассета экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, содержащую вторую промоторную последовательность, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид тирозингидроксилазы (ТН) или его биологически активный фрагмент или вариант, при условии, что указанный вектор не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид декарбоксилазы ароматических аминокислот (AADC), или

b) первую и вторую кассеты экспрессии, причем указанная первая кассета экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, содержащую первую промоторную последовательность, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, причем указанная первая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид GTP-циклогидролазы 1 (GCH1) или его биологически активный фрагмент или вариант, и причем указанная вторая кассета экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, содержащую вторую промоторную последовательность, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид тирозингидроксилазы (ТН) или его биологически активный фрагмент или вариант, причем вектором является аденоассоциированный вектор (AAV), или

c) кассету экспрессии, содержащую промотор, первую нуклеотидную последовательность, нуклеотидную последовательность инициации трансляции, такую как сайт внутренней посадки рибосомы (IRES), и вторую нуклеотидную последовательность, причем указанный промотор функционально связан с указанной первой нуклеотидной последовательностью, и причем указанная нуклеотидная последовательность инициации трансляции связана с указанной первой и указанной второй нуклеотидными последовательностями, причем указанная первая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид GTP-циклогидролазы 1 (GCH1) или его биологически активный фрагмент или вариант, и причем указанная вторая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид тирозингидроксилазы (ТН) или его биологически активный фрагмент или вариант, или

d) кассету экспрессии, содержащую первую нуклеотидную последовательность, нуклеотидную последовательность инициации трансляции, такую как сайт внутренней посадки рибосомы (IRES), и вторую нуклеотидную последовательность, причем указанная нуклеотидная последовательность инициации трансляции связывает указанную первую и указанную вторую нуклеотидные последовательности, и причем последовательность, содержащая указанную первую нуклеотидную последовательность, связанную с указанной нуклеотидной последовательностью инициации трансляции, связанной с указанной второй нуклеотидной последовательностью, фланкирована 5'- и 3'-концевыми повторами, и причем указанная первая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид GTP-циклогидролазы 1 (GCH1) или его биологически активный фрагмент или вариант, и причем указанная вторая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид тирозингидроксилазы (ТН) или его биологически активный фрагмент или вариант, причем указанные концевые повторы содержат последовательность, способную управлять экспрессией функционально связанного полипептида.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к одновекторной системе экспрессии, содержащей

а) первую и вторую кассеты экспрессии, причем указанная первая кассета экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, содержащую первую промоторную последовательность, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, причем указанная первая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид GTP-циклогидролазы 1 (GCH1) или его биологически активный фрагмент или вариант, причем указанный полипептид или его биологически активный фрагмент или вариант по меньшей мере на 70% идентичен полипептиду, выбранному из группы, состоящей из SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 и SEQ ID NO. 6, и причем указанная вторая кассета экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, содержащую вторую промоторную последовательность, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид тирозингидроксилазы (ТН) или его биологически активный фрагмент или вариант, причем указанный полипептид или его биологически активный фрагмент или вариант по меньшей мере на 70% идентичен полипептиду, выбранному из группы, состоящей из SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13 и SEQ ID NO. 14, при условии, что указанный вектор не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид декарбоксилазы ароматических аминокислот (AADC), или

b) первую и вторую кассеты экспрессии, причем указанная первая кассета экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, содержащую первую промоторную последовательность, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, причем указанная первая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид GTP-циклогидролазы 1 (GCH1) или его биологически активный фрагмент или вариант, причем указанный полипептид или его биологически активный фрагмент или вариант по меньшей мере на 70% идентичен полипептиду, выбранному из группы, состоящей из SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 и SEQ ID NO. 6, и причем указанная вторая кассета экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, содержащую вторую промоторную последовательность, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид тирозингидроксилазы (ТН) или его биологически активный фрагмент или вариант, причем указанный полипептид или его биологически активный фрагмент или вариант по меньшей мере на 70% идентичен полипептиду, выбранному из группы, состоящей из SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13 и SEQ ID NO. 14, причем вектором является аденоассоциированный вектор (AAV), или

c) кассету экспрессии, содержащую промотор, первую нуклеотидную последовательность, нуклеотидную последовательность инициации трансляции, такую как сайт внутренней посадки рибосомы (IRES), и вторую нуклеотидную последовательность, причем указанный промотор функционально связан с указанной первой нуклеотидной последовательностью, и причем указанная нуклеотидная последовательность инициации трансляции связывает указанную первую и указанную вторую нуклеотидные последовательности, причем указанная первая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид GTP-циклогидролазы 1 (GCH1) или его биологически активный фрагмент или вариант, причем указанный полипептид или его биологически активный фрагмент или вариант по меньшей мере на 70% идентичен полипептиду, выбранному из группы, состоящей из SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, и причем указанная вторая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид тирозингидроксилазы (ТН) или его биологически активный фрагмент или вариант, причем указанный полипептид или его биологически активный фрагмент или вариант по меньшей мере на 70% идентичен полипептиду, выбранному из группы, состоящей из SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12 SEQ ID NO. 13 и SEQ ID NO. 14, или

d) кассету экспрессии, содержащую первую нуклеотидную последовательность, нуклеотидную последовательность инициации трансляции, такую как сайт внутренней посадки рибосомы (IRES), и вторую нуклеотидную последовательность, причем указанная нуклеотидная последовательность инициации трансляции связывает указанную первую и указанную вторую нуклеотидные последовательности, и причем последовательность, содержащая указанную первую нуклеотидную последовательность, связанную с указанной нуклеотидной последовательностью инициации трансляции, связанной с указанной второй нуклеотидной последовательностью, фланкирована 5'- и 3'-концевыми повторами, и причем указанная первая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид GTP-циклогидролазы 1 (GCH1) или его биологически активный фрагмент или вариант, причем указанный полипептид или его биологически активный фрагмент или вариант по меньшей мере на 70% идентичен полипептиду, выбранному из группы, состоящей из SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 и SEQ ID NO. 6, и причем указанная вторая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид тирозингидроксилазы (ТН) или его биологически активный фрагмент или вариант, причем указанный полипептид или его биологически активный фрагмент или вариант по меньшей мере на 70% идентичен полипептиду, выбранному из группы, состоящей из SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12 SEQ ID NO. 13 и SEQ ID NO. 14, причем указанные концевые повторы содержат последовательность, способную управлять экспрессией функционально связанного полипептида.

Согласно некоторым вариантам осуществления вектором может быть вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV). Согласно предпочтительным вариантам осуществления настоящее изобретение относится к регуляторным элементам, таким как посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (WPRE), в векторной конструкции для регулирования дифференциальной экспрессии кодируемых полипептидов. Согласно некоторым вариантам осуществления дифференциальная экспрессия полипептидов может быть выгодной для постоянного потока DOPA при назначенном лечении болезни Паркинсона. Она также может быть выгодной для функционирования указанного вектора в клетках млекопитающих, предпочтительно в нервных клетках.

Одновекторная конструкция, с которой возможна дифференциальная экспрессия двух или более кодирующих полипептид полинуклеотидов, также может быть использована для других применений, таких как лечение других нарушений, при которых желательна специфическая стехиометрия между двумя или более полипептидами.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу определения отношения экспрессии полипептида GTP-циклогидроксилазы 1 (SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 5 и 6) и полипептида тирозингидроксилазы (SEQ ID NO. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14), соответственно, или их вариантов, причем указанный полипептид кодируется вектором, как определено в настоящем документе, предусматривающим измерение:

a. ферментной активности полипептидов, или

b. количества продуцированного ВH₄, или

c. экспрессируемого количества указанных полипептидов, или

d. содержания транскрибированной мРНК, соответствующей полипептиду GTP-циклогидроксилазы 1 и полипептиду тирозингидроксилазы, соответственно.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения отношение предпочтительно измеряется путем определения количества экспрессируемой мРНК, более предпочтительно путем определения количества экспрессируемого белка или путем определения активности экспрессируемых ферментов ТН (тирозингидроксилазы) и GCH1 (полипептида GTP-циклогидроксилазы 1). Отношение экспрессируемых ферментов ТН и GCH1 составляет от 15:1 до 1:1, предпочтительно от 10:1 до 3:1, более предпочтительно от 8:1 до 3:1, более предпочтительно от 7:1 до 4:1, такое как от 7:1 до 5:1, например, 6:1 (подробнее на фигуре 3).

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к выделенной клетке-хозяину, содержащей вектор, как определено в настоящем документе выше.

Согласно следующим аспектам настоящее изобретение относится к медицинским применениям векторной системы экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, полинуклеотида вектора и кодируемого полипептида.

Предпочтительно медицинским применением является применение для лечения заболевания, нарушения или повреждения нервной системы, более предпочтительно для лечения дегенеративных нервных нарушений, таких как болезнь Паркинсона.

Согласно следующим аспектам настоящее изобретение относится к выделенной клетке-хозяину, трансформированной или трансдуцированной вектором в соответствии с настоящим изобретением, и к линии упаковывающих клеток, способной продуцировать инфекционный вирион в соответствии с настоящим изобретением.

Согласно одному аспекту вектор в соответствии с настоящим изобретением применяют в качестве лекарственного препарата.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вектор, как определено в настоящем документе выше, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

Согласно одному аспекту фармацевтическую композицию применяют в способе лечения болезни Паркинсона, причем указанная композиция содержит одновекторную систему экспрессии и состав для доставки указанного вектора в базальные ганглии, причем указанная одновекторная система экспрессии содержит

a) первую и вторую кассеты экспрессии, причем указанная первая кассета экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, содержащую первую промоторную последовательность, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, причем указанная первая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид GTP-циклогидролазы 1 (GCH1) или его биологически активный фрагмент или вариант, и причем указанная вторая кассета экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, содержащую вторую промоторную последовательность, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид тирозингидроксилазы (ТН) или его биологически активный фрагмент или вариант, при условии, что указанный вектор не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид декарбоксилазы ароматических аминокислот (AADC), или

b) первую и вторую кассеты экспрессии, причем указанная первая кассета экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, содержащую первую промоторную последовательность, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, причем указанная первая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид GTP-циклогидролазы 1 (GCH1) или его биологически активный фрагмент или вариант, и причем указанная вторая кассета экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, содержащую вторую промоторную последовательность, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид тирозингидроксилазы (ТН) или его биологически активный фрагмент или вариант, причем вектором является аденоассоциированный вектор (AAV), или

c) кассету экспрессии, содержащую промотор, первую нуклеотидную последовательность, нуклеотидную последовательность инициации трансляции, такую как сайт внутренней посадки рибосомы (IRES), и вторую нуклеотидную последовательность, причем указанный промотор функционально связан с указанной первой нуклеотидной последовательностью, и причем указанная нуклеотидная последовательность инициации трансляции связывается с указанной первой и указанной второй нуклеотидными последовательностями, причем указанная первая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид GTP-циклогидролазы 1 (GCH1) или его биологически активный фрагмент или вариант, и причем указанная вторая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид тирозингидроксилазы (ТН) или его биологически активный фрагмент или вариант, или

d) кассету экспрессии, содержащую первую нуклеотидную последовательность, нуклеотидную последовательность инициации трансляции, такую как сайт внутренней посадки рибосомы (IRES), и вторую нуклеотидную последовательность, причем указанная нуклеотидная последовательность инициации трансляции связана с указанной первой и указанной второй нуклеотидными последовательностями, и причем последовательность, содержащая указанную первую нуклеотидную последовательность, связанную с указанной нуклеотидной последовательностью инициации трансляции, связанной с указанной второй нуклеотидной последовательностью, фланкирована 5'- и 3'-концевыми повторами, и причем указанная первая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид GTP-циклогидролазы 1 (GCH1) или его биологически активный фрагмент или вариант, и причем указанная вторая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид тирозингидроксилазы (ТН) или его биологически активный фрагмент или вариант, причем указанные концевые повторы содержат последовательность, способную управлять экспрессией функционально связанного полипептида.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу введения фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением, причем указанную фармацевтическую композицию вводят инъекцией, перорально, например, таблеткой, аэрозолем, кожно или ингаляцией. Указанной инъекцией предпочтительно является интракраниальная, интрацеребральная, интравитреальная, интраназальная, внутривенная, внутримышечная, интраспинальная, внутрибрюшинная, подкожная или болюсная, или длительная инъекция.

Также предусмотрен набор, содержащий фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением, причем указанный набор также содержит инструкции по введению фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением.

Описание графических материалов

На фигуре 1 представлен (А) обзор стратегии непрерывной доставки DOPA в соответствии с настоящим изобретением; (В) сравнительный пример с использованием традиционной двухвекторной системы, не характеризующейся возможностью контролировать относительные уровни экспрессии GCH и ТН.

На фигуре 2 представлены векторные конструкции. Генная конструкция создана для экспрессии и тирозингидроксилазы (ТН), и GTP циклогидролазы 1 (GCH-1) из одновекторного генома. Для достижения усиленной экспрессии гена ТН по сравнению с геном GCH1 добавляли посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (WPRE). Оба гена управлялись промотором синапсина 1 (SYN-1) человека, и направленная миграция усиливалась с использованием последовательности полиаденилирования SV40 (рА). Полную генную последовательность встраивали между обращенными концевыми повторами (ITR) из серотипа 2 AAV.

На фигуре 3 представлено моделирование зависимости ВН4 и GCH1 для функции ТН. Значения данных in vivo и in vitro измерений ферментной активности ТН вместе с полуколичественными вестерн-блоттингами для измерений белка ТН в 6 группах, причем векторы rAAV5-TH и rAAV5-GCH1 смешивали в варьирующих отношениях, унифицировали в одну переменную считывания путем нормализации величин к Z-показателям. Это дает безразмерную величину, которую затем можно будет непосредственно сравнивать и моделировать, (а) Отдельные Z-показатели in vivo и in vitro ферментной активности ТН и содержания белка ТН нанесены на график как функция синтеза ВН4 в обедненном DA полосатом теле после трансдукции rAAV5-TH и rAAV5-GCH1. Эта операция показала, что результаты трех анализов фактически слились в один общий профиль при нанесении на график как функция содержания ВН4 в полосатом теле. (b) Содержание ВН4 в полосатом теле нанесено на график как функция инъецированного gc rAAV5-GCH1. Содержание ВН4 в полосатом теле не повышалось линейно с повышением титров rAAV5-GCH1, но вместо этого демонстрировало четкую корреляцию при содержании выше 3,6×10⁹ gc. (с) Группировка Z-показателей трех тестов фермент ной функции ТН на одной модел и нанесены на график как функция содержания ВН4 в полосатом теле, (d) Средние Z-показатели трех тестов функции ТН нанесены на график как функция геномных копий инъецированного rAAV5-GCH1. Жирные линии на B-D представляют нелинейное приближение, достигнутое после применения корреляционной модели у=Ах/(В+х)+С с использованием модифицированного алгоритма Левенберга-Марквардта.

На фигуре 4 представлено восстановление двигательной функции. Животных с полной односторонней денервацией DA тестировали с использованием ряда поведенческих тестов. На основе их характеристики в тестах «цилиндр» (а) и индуцированных лекарственным средством вращений (d, е) они либо подвергались ложному хирургическому вмешательству (группа Les-Sham), либо получали терапевтический отдельный вектор rAAV (TH-GCH1). Полное восстановление наблюдали в группе TH-GCH1 в течение 5 недель в тесте «цилиндр» (а) и тесте с шаганием (b). Оно сохранялось в течение всего эксперимента. Оно также наблюдалось в тесте «коридор» (с), тогда как восстановление было частичным при индуцированных амфетамином (d) и апоморфином (е) вращениях. Восстановление комплексной двигательной функции, такой как в тесте с лестницей, также было значительным (f). * = значительно отличается от группы Les-Sham.

На фигуре 5 представлен посмертный анализ трансгенной экспрессии и синтеза DA. Через шесть месяцев после инъекции rAAV у поврежденных 6-OHDA животных оценивали функцию одного вектора TH-GCH1 rAAV биохимически и с использованием иммуногистохимии. Иммуногистохимический анализ показал явную экспрессию обоих трансгенов ТН (а) и GCH1 (b). Эта экспрессия была связана с очень эффективным продуцированием и DOPA (закрашенный столбик в с), и ВН4 (закрашенный столбик в d) в гораздо более высокой степени, чем в интактном полосатом теле (незакрашенный столбик в d). Содержание допамина также было в значительной степени восстановлено (е), содержание промежуточного метаболита DOPAC восстанавливалось до 50% от нормы (f), а содержание конечного метаболита HVA (g) повышалось в два раза по сравнению с нормальным содержанием.

На фигуре 6 представлена векторная карта с конструкцией одного варианта осуществления настоящего изобретения.

На фигуре 7 представлена зависимость дозы от реакции по отношению к восстановлению двигательной функции. Животных с полной односторонней денервацией DA тестировали в тесте «коридор» до инъекции AAV (обозначенная базовая линия повреждения). Затем их делили на четыре группы на основе их характеристик. Затем все поврежденные животные получали стереотаксическую инъекцию равного объема вектора rAAV5-TH:GCH1 [5 мкл], но с повышающейся концентрацией. В результате этого образовались следующие четыре группы дозирования: 0,7% [9,1×10⁸ gc], 3,4% [4,6×10⁹ gc], 9,8% [1,3×10¹⁰ gc], 100% [1,3×10¹¹ gc]. Включали равную по размеру интактную одновозрастную контрольную группу в качестве стандартной для всех временных точек. Затем животных повторно подвергли тесту «коридор» через 12 недель после инъекции AAV. Полное восстановление наблюдали в двух опытных группах, которые получали более высокие концентрации векторов, т.е. понижение до дозы вектора 1,3×10¹⁰ gc rAAV5-TH:GCH1.4,6×10⁹ gc давало 50% восстановление, тогда как восстановление от дозы 9,1×10⁸ gc было значительно ниже. * = значительно отличается при двойном факторном ANOVA с последующим апостериорным критерием подлинной значимости Тьюки.

На фигуре 8 представлена количественная оценка с помощью микродиализа межклеточного содержания допамина. Животных с полной, односторонней денервацией DA делили на две группы (группу TH-GCH1 и только с повреждением 6-OHDA). Затем животные груп