Фактор ii и фибриноген для лечения гемостатических нарушений

Фактор ii и фибриноген для лечения гемостатических нарушений

Реферат

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам лечения гемостатических нарушений.

Описание области техники, к которой относится данное изобретение

Гемостаз относятся к процессу остановки потери крови из поврежденных кровеносных сосудов. Свертывание, или образование тромбов, является важной частью гемостаза. Чтобы остановить кровотечение из раны, поврежденная стенка кровеносного сосуда покрывается тромбом, содержащим тромбоциты и фибрин. Нарушения свертывания могут привести к увеличению риска кровотечения (кровоизлияния) или свертывания (тромбоз).

Массивное кровотечение или переливание крови у больных обычно связаны с нарушением свертывания. Это нарушение свертывания может вызываться дилюционной коагулопатией, определяемой как повышение склонности к кровотечению в связи с разжижением крови. Компенсация жидкости является обычным лечением обширной потери крови для нормализации кровяного давления и предотвращения циркуляторного шока. Однако компенсация жидкости разжижает факторы свертывания в оставшейся крови и нарушает их функцию, что может привести к усилению кровотечения, которое может являться опасным для жизни.

In vivo биохимические пути, ведущие к свертыванию, являются сложными и требуют большого количества факторов и кофакторов. Существует десять факторов, которые обозначаются римскими цифрами I-XIII, при этом III, IV и VI не являются используемыми обозначениями. Многочисленные взаимосвязанные факторы и кофакторы модулируют активность биохимических путей. Например, в пути тканевого фактора после повреждения кровеносного сосуда фактор VII (сокращенно FVII, как принято для факторов, обозначенных римскими цифрами) вступает в контакт с тканевым фактором (TF), экспрессированным на клетках, несущих тканевой фактор (стромальные фибробласты и лейкоциты). При этом образуется активированный комплекс (TF-FVIIa). TF-FVIIa активирует FIX и FX. FVII сам активируется тромбином, FXIa, плазмином, FXII и FXa. Преобразование FX в активированный FXa с помощью TF-FVIIa почти сразу же тормозится ингибитором пути тканевого фактора (TFPI). FXa и его кофактор FVa формируют протромбиназный комплекс, который активирует преобразование протромбина в тромбин. Тромбин затем активирует другие компоненты системы свертывания, в том числе FV и FVIII (который активирует FXI, который, в свою очередь, активирует FIX), а также активирует и высвобождает FVIII из связи с фактором фон Виллебранда (vWf). FVIIIa является кофактором FIXa, и вместе они образуют «теназный» комплекс, который активирует FX для непосредственного возвращения в цикл. Активация пути вызывает резкое увеличение активированного тромбина. Тромбин, активированный в этом цикле, может преобразовывать фибриноген в фибрин, который является белком, образующим тромб вместе с тромбоцитами.

Протромбин (FII) производится в печени и посттрансляционно модифицируется в витамин К-зависимой реакции, которая преобразует десять глутаминовых кислот в протромбине в гамма-карбоксиглутаминовую кислоту. Дефицит витамина K или введение антикоагулянта варфарина ингибирует превращение остатков глутаминовой кислоты фактора II в Gla, замедляя активацию системы свертывания. Тромбин (FIIa) производится путем ферментативного расщепления двух участков в FII активированным фактором X (FXa). Активность FXa значительно усиливается путем связывания с активированным фактором V (FVa). У взрослых людей нормальный уровень активности протромбина в крови при измерении составляет около 1,1 ед/мл. Уровни протромбина в плазме крови новорожденного неуклонно возрастают после рождения до достижения нормального уровня взрослого, с уровня около 0,5 ед/мл через день после рождения, до уровня около 0,9 ед/мл через 6 месяцев жизни.

Тромбин, который образуется из протромбина, имеет множество эффектов в каскаде коагуляции. Он представляет собой сериновую протеазу, которая преобразует растворимый фибриноген в нерастворимые нити фибрина, а также катализирует многие другие реакции, связанные с коагуляцией. Al Dieri и соавт. исследовали связь между концентрациями фактора свертывания, параметрами генерации тромбина и объемом кровопотери у больных с различными врожденными недостатками фактора коагуляции. Авторы показали, что склонность к кровотечениям была напрямую связана с объемом генерации тромбина, который изменялся линейно к FII концентрациям. Al Dieri et al. Thromb Haemost 2002, 88:576-82. Фенгер-Эриксон (Fenger-Erikson) и соавт. также показали, что в случае дилюционной коагулопатии помимо фибриногена, факторы коагуляции, включая FII, FX и FXIII, также снижаются ниже ожидаемого уровня после 32% разбавления раствором гидроксиэтилкрахмала. Fenger-Eriksen et al. J Thromb Haemost 2009, 7:1099-105.

Фибриноген (фактор I или FI) представляет собой растворимый гликопротеин плазмы, который синтезируется печенью и превращается под действием тромбина в фибрин во время свертывания крови. Процессы в системе свертывания преобразуют протромбин в активированную сериновую протеазу - тромбин, который превращает фибриноген в фибрин. Фибрин затем перекрестно связывается фактором XIII с образованием тромба. Нормальная концентрация фибриногена в плазме крови 1,5-4,0 г/л или около 7 мкМ. В случае значительной потери крови фибриноген более чем любые другие прокоагулирующие факторы или тромбоциты достигает критически низких концентраций в плазме. Hiippala et al. Anesth Analg 1995, 81 :360-5; Singbartl et al. Anesth Analg 2003, 96:929-35; McLoughlin et al. Anesth Analg 1996, 83:459-65. Небольшие количества коллоидов (менее 1000 мл) могут нарушать полимеризацию фибрина и, соответственно прочность тромба. Innerhofer P et al. Anesth Analg 2002, 95:858-65; Mittermayr et al. Anesth Analg 2007; 105:905-17; Fries et al. Anesth Analg 2002, 94:1280-7. Некоторые рекомендации приводят пороговую концентрацию фибриногена 1 г/л, на основе результатов исследования, в котором у четырех из четырех пациентов с концентрацией фибриногена менее 0,5 г/л наблюдали диффузное микрососудистое кровотечение. Spahn et al. Crit Care 2007, 11: R17; Stainsby et al. Br J Haematol 2006; 135:634-41; Ciavarella et al. Br J Haematol 1987;67:365-8. Напротив, последние клинические данные околородовых кровотечений, нейрохирургии и сердечной хирургии показывают, что при концентрации фибриногена менее 1,5-2 г/л уже существует повышенная склонность к пери- и послеоперационному кровотечению. Charbit et al. J Thromb Haemost 2007, 5:266-73; Gerlach et al. Stroke 2002, 33: 1618-23; Blome et al. J Thromb Haemost 2005, 93:1101-7; Ucar et al. Heart Surg Forum 2007, 10:E392-6.

Проблемы свертывания, связанные с нарушениями свертываемости, такие как дилюционная коагулопатия, могут быть решены с помощью гемостатической терапии. Целью гемостатической терапии является сведение к минимуму потери крови, необходимости переливания и смертности. У пациентов с травмой с одинаковыми показателями тяжести повреждения (ISS), смертность практически удваивается просто в результате коагулопатии. Brohi et al. J Trauma 2003, 54: 1127-30. Массивное кровотечение или массивное переливание у пациентов с множественными травмами связано с нарушениями свертывания крови. Таким образом, для достижения адекватного гемостаза требуется достаточное количество тромбина и достаточно способного к свертыванию субстрата. Ключевыми элементами в свертывании являются генерация тромбина на поверхности тромбоцитов и расщепление фибриногена под действием тромбина с образованием фибрина. Brohi et al. J Trauma 2003, 54:1127-30. Если образуется достаточно тромбина, он преобразует фибриноген в стабильный фибрин, который определяет плотность развивающегося тромба в присутствии фактора XIII (FXIII). Korte, et al., Hamostaseologie 2006, 26:S30-5.

Быстрая замена жидкости имеет решающее значение в случае массивной кровопотери у пациентов с грубой и множественной травмой, для поддержания нормоволемии. Sperry JL, et al. J Trauma 2008; 64:9-14. Однако гемодинамическая стабилизация путем введения больших количеств кристаллоидных или коллоидных растворов вызывает дилюционную коагулопатию. Клинические эффекты нарушения свертывания плазмы, вызванного нормоволемической гемодилюцией, ранее исследовались в нескольких публикациях. Innerhofer P, et al. Anesth Analg 2002;95:858-65, Singbartl et al. Anesth Analg 2003;96:929-35, Mittermayr et al. Anesth Analg 2007; 105:905-17.

Дилюционную коагулопатию обычно лечат с помощью свежезамороженной плазмы (FFP) и, если возможно, с помощью криопреципитата. Stainsby et al. Br J Anaesth 2000, 85:487-91; Spahn et al. Crit Care 2007, 11:17. Однако критически уменьшенные концентрации фактора свертывания едва ли возможно исправить путем введения FFP в связи с низкой концентрацией факторов свертывания крови в ней и ее эффектами расширения объема, которые уравновешивают намеренное увеличение концентрации любого интересующего белка. Mittermayer 2007, supra; Scalea et al. Ann Surg, 2008, 248:578-84; Chowdhury et al. Br J Haematol 2004, 125:69-73; Stanworth et al. Br J Haematol 2004, 126: 139-52; Abdel-Wahabet al. Transfusion 2006, 46:1279-85. Кроме того, введение FFP связано с несколькими осложнениями, такими как начало повреждения легкого, полиорганная недостаточность и инфекции. Watson GA, et al. J Trauma 2009, 67:221-7; Sarani et al. Crit Care Med 2008, 36: 1114-8; Dara et al. Crit Care Med. 2005, 33:2667-71 . Более того, необходимый процесс размораживания задерживает немедленное лечение, которое имеет особое значение в случае острых и тяжелых кровотечений.

Действие введения концентрата фибриногена на дилюционную коагулопатию ранее изучалось in vitro в нескольких животных моделях, а также в клинической практике. Fries et al. Br J Anaesth 2005, 95:172-7; Fries et al. Anesth Analg 2006, 102:347-51; Velik-Salchner et al. J Thromb Haemost 2007, 5:1019-25; Stinger et al. J Trauma 2008, 64:S79-85. Введение только концентрата фибриногена нормализует прочность тромба, но не инициацию свертывания, так как это является тромбин-зависимой реакцией. Fries et al. Br J Anaesth 2005, 95: 172-7; Fries et al. Anesth Analg 2006, 102:347-51; Fenger-Eriksen et al. J Thromb Haemost 2009, 7:795-802. Таким образом, ранее изучены комбинации фибриногена и комплексов факторов свертывания, таких как концентрат протромбинового комплекса (PCC).

В частности, Fries и соавт. исследовали эффект замещения фибриногена на реверсирование дилюционной коагулопатии в in vitro модели. British Journal of Anaesthesia, 2006, 97(4):460-467. Кровь от 5 здоровых мужчин-добровольцев разбавляли на 60%, с применением лактированного раствор Рингера, 4% раствора модифицированного желатина или 6% гидроксиэтилкрахмала (HES) 130/0,4, а также комбинации лактированного раствора Рингера с любым из 2 коллоидных растворов. Fries et al., Anesth Analg; 2006, 102:347-51. После этого, аликвотные пробы разбавленной крови инкубировали с 3-мя различными концентрациями фибриногена (0,75, 1,5 и 3,0 г/л). Измерения выполняли с помощью модифицированной тромбоэластографии (ROTEM®; Pentapharm, Мюнхен, Германия). После 60% разбавления время свертывания увеличилось, в то время как плотность тромба и полимеризация фибрина значительно уменьшились. После введения фибриногена время свертывания уменьшилось. Твердость тромба, а также полимеризация фибрина увеличились во всех разбавленных образцах крови при добавлении фибриногена. Эффект замещения фибриногена in vitro на переменные ROTEM® зависел от дозы фибриногена и типа раствора, применяемого для разбавления крови.

В другом исследовании, Fries и соавт. исследовали влияние фибриногена и концентрата протромбинового комплекса (PCC) в условиях гемодилюции и неконтролируемых кровотечений в свиной модели. Fries et al, British Journal of Anaesthesia, 2006, 97(4):460-467. После серьезной потери крови на 65% от расчетного общего объема крови, замещение объема жидкости с помощью HES (2500 мл) привело к дилюционной коагулопатии, по измерениям обычных коагуляционных проб и анализа ROTEM®. У животных, получавших только концентрат восстановленных эритроцитов, и в группе плацебо наблюдалось небольшое статистически значимое улучшение ROTEM® параметров. Однако в группе лечения дополнительное замещение фибриногена и PCC привело к нормализации параметров свертывания. Потеря крови и смертность после стандартизированного повреждения печени значительно уменьшались у животных, которых лечили с помощью фибриногена и РСС, по сравнению с плацебо.

PCC часто вводят в клинической практике в случае пролонгированного времени свертывания крови у пациентов в критическом состоянии, а также в ситуациях массивных кровотечений. Schochl et al. Anaesthesia 2009. PCC соответствует факторам II, VII, IX и X, а также протеину C и небольшому количеству гепарина, и применялся в течение многих лет для лечения наследственных дефицитов свертывания и для реверсирования антикоагуляции после введения антагонистов витамина К. Доступны только ограниченные данные для животных по применению современных препаратов PCC у свиней, показывающих приобретенные дефициты фактора свертывания, вызванные массивной кровопотерей и введением HES. Dickneite et al. Anesth Analg 2008, 106: 1070-7; Dickneite et al. Br J Anaesth 2009, 102:345-54; Dickneite et al. J Trauma 2009.

Staudinger и соавт. исследовали эффект PCC на свертывание плазмы у пациентов в критическом состоянии и указали, что доза 2000 единиц фактора IX в PCC (в среднем 30 МЕ/кг массы тела) нормализовала протромбиновое время (PT) за счет повышения плазменного уровня факторов свертывания II, VII, IX и X у пациентов с умеренно сниженной активностью свертывания. Staudinger et al. Intensive Care Med 1999, 25: 1105-10. Однако в отношении генерации тромбина, PCC представляется гораздо более активным, чем rhFVIIa. Dickneite et al. J Trauma 2009. PCC может быть связан с повышенным риском тромбоэмболических осложнений, особенно у пациентов с приобретенными пороками свертывания. Bagot et al. Thromb Haemost 2007, 98: 1141-2; Warren et al. Ann Emerg Med 2009, 53:758-61; Kohler et al. Thromb Haemost 1998, 80:399-402.

Также предлагались различные дополнительные способы лечения кровотечений и потери крови, включая добавление факторов свертывания. См., например, опубликованные патенты США 2003/0129183, 2004/0198647, 2004/0237970, 2005/0282771, 2006/0025336, 2006/0211621, 2007/0232788, 2008/0014251, 2008/0188400, 2008/0267940, 2010/0093607, 2009/0098103, 2009/0148502, 2009/0175931, 2009/0232877 и 2010/0086529.

Несмотря на предложение и изучение различных композиций и способов для восстановления гемостаза, в данной области остается потребность в усовершенствованных способах лечения гемостатических нарушений, таких как дилюционная коагулопатия.

Для достижения гемостаза у пациентов с нарушениями свертываемости или потерей крови, требуется достаточное количество тромбина и достаточно способного к свертыванию субстрата (фибриноген). Ключевыми аспектами в свертывании являются формирование тромбина на поверхности тромбоцитов и расщепление фибриногена под действием тромбина с образованием фибрина. При наличии достаточного количества фибриногена, если образуется достаточно тромбина, он преобразует фибриноген в стабильный фибрин, который определяет плотность развивающегося тромба в присутствии фактора XIII (FXIII).

Настоящее изобретение предусматривает лечение или минимизацию неконтролируемых кровотечений с применением рекомбинантного гемостатического средства (средств), включая только рекомбинантный человеческий фактор II (rhFII) или комбинацию из трех рекомбинантных человеческих факторов свертывания, rhII, rhFX и rhVIIa (3F), где гемостатические средства применяют с или без фибриногена. В частности, настоящее изобретение демонстрирует эффективность таких рекомбинантных гемостатических средств в лечении дилюционной коагулопатии. Удивительно, но введение только rhFII или в комбинации с фибриногеном является достаточным для восстановления нормального гемостаза. Введением только rhFII или в комбинации с фибриногеном можно избежать потенциально серьезных осложнений в виде тромбоэмболических явлений, которые могут сопровождать другие стандартные формы лечения, которые в настоящее время предусмотрены для контроля нарушений свертываемости или потери крови.

Следует отметить, что ссылки на какие-либо публикации в данном документе не следует истолковывать как признание того, что такая публикация является ограничительной частью патентной формулы изобретений, раскрытых в данном документе ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

Лечение гемостатического нарушения или нормализация гемостаза может включать в себя применение лечения фактором свертывания, который выбирают из группы, включающей (1) только FII, (2) PCC, и (3) комбинацию трех факторов FII, FX, и VIIa. Лечение фактором свертывания (гемостатическим средством (средствами)) можно факультативно назначать в комбинации с фибриногеном. Гемостатическим средством (средствами) могут являться рекомбинантные человеческие факторы, например, rhFII, rhFX и rhVIIa (данная трехфакторная комбинация из рекомбинантных человеческих факторов может сокращаться 3F), или только rhFII. В некоторых вариантах осуществления эффективное лечение гемостатического нарушения или нормализация гемостаза может включать в себя совместное применение фибриногена и rhFII. Лечение можно проводить без существенного дополнения любым другим фактором свертывания. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления эффективное лечение гемостатического нарушения может включать в себя применение лечения фактором свертывания, который выбирают из группы, включающей (1) только FII, например, rhFII; (2) 3F; (3) фибриноген и комбинацию FII, FVIIa и FX, (4) или фибриноген и FII.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1: Потеря крови в мл на кг массы тела после рассечения печени и введения контрольного физиологического раствора, концентрата фибриногена (fib), концентрата фибриногена в комбинации с PCC (PCC + fib), концентрата фибриногена в комбинации с трехфакторной комбинацией (ThreeF + fib) или концентрата фибриногена в комбинации с рекомбинантным человеческим FII (FII + fib); показано как среднее +/- SD (стандартное отклонение).

Фигура 2 (A-B): ROTEM® анализ в исходном состоянии (BL), после забора крови (BW), после гемодилюции (HD), после введения исследуемого лекарственного средства (TH), и в конечной точке наблюдения (END). Исследуемые лекарственные средства соответствуют концентрату фибриногена (фибриноген), концентрату фибриногена в комбинации с PCC (PCC), концентрату фибриногена в комбинации с рекомбинантным человеческим FII (FII), концентрату фибриногена в комбинации с трехфакторной комбинацией (3F), или контрольному физиологическому раствору. Показаны время свертывания (СТ, в сек) (Фигура 2А) и максимальная плотность тромба (MCF, в мм) (Фигура 2B). Статистически значимые различия (Р<0,001) показаны по сравнению с группой физиологического раствора и группой фибриногена.

Фигура 3: Потеря крови в мл на кг массы тела после введения (1) контрольного физиологического раствора; (2) рекомбинантного человеческого FII (rhFII) в дозе 8 мг/кг; (3) трехфакторной комбинации, соответствующей rhFII + rhFX + rhFVIIa в дозе 4,0, 0,32 и 0,006 мг/кг, соответственно (низкая доза); (4) трехфакторной комбинации, соответствующей rhFII + rhFX + rhFVIIa в дозе 8,0, 0,64 и 0,012 мг/кг, соответственно (высокая доза); (5) FEIBA VH^® (концентрата активированного комплекса (АРСС); Baxter) в дозе 40 ед/кг; (6) NovoSeven^® (фактор свертывания VIIa; Novo Nordisk) в первой дозе 200 мкг/кг, с последующей второй дозой 100 мкг/кг через час; или Haemocomplettan^® HS (концентрат фибриногена; CSL-Behring), как отдельные значения и среднее (горизонтальная полоса).

Фигура 4 показывает кривые выживания для групп лечения rhFII, rhFII + rhFX + rhFVIIa, Feiba, NovoSeven и Haemocomplettan. Также присутствует носитель в качестве контрольной группы.

Фигура 5 (А-В): Результаты ROTEM после введения факторов свертывания или их комбинаций, как описано выше для фигуры 3, показывающие а) время свертывания (СТ), b) максимальную плотность тромба (MCF) в образцах активированной ех-ТЕМ (тканевой фактор) цельной крови, забранной в исходном состоянии, после разбавления, после введения лекарственного средства и в конце эксперимента, соответственно; показаны как среднее +/- SEM (стандартная ошибка среднего значения).

Фигура 6 (A-D): Результаты генерации тромбина (калиброванная автоматизированная тромбограмма) после введения факторов свертывания или их комбинаций, как описано выше для фигуры 3, показывающие (А) латентный период (длительность периода до начала свертывания крови), (В) время до пика, (С) пик и (D) эндогенный потенциал тромбина для образцов плазмы, полученных в исходном состоянии, после разбавления, после введения лекарственного средства и в конце эксперимента, показанные как среднее +/- SEM.

[0027] Фигура 7: Концентрация комплекса тромбин-антитромбин в образцах плазмы после введения факторов свертывания, или их комбинаций, как описано выше для фигуры 3, отобранных в исходном состоянии, после разбавления, после введения лекарственного средства и в конце эксперимента; показана как среднее.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение предусматривает лечение неконтролируемого кровотечения или нормализацию гемостаза путем назначения лечения фактором свертывания или комбинацией одного или нескольких факторов свертывания. В частности, изобретение предусматривает лечение неконтролируемого кровотечения или нормализацию гемостаза путем назначения FII или трехфакторной комбинации (FII, FX и VIIa). В некоторых вариантах осуществления гемостатическими средствами или факторами свертывания являются рекомбинантные человеческие факторы свертывания. В дальнейших вариантах осуществления факторы свертывания вводят с или без фибриногена. В некоторых других вариантах осуществления фактором свертывания лечения является РСС (FII, FVII, FIX и FX, факультативно с небольшим количеством гепарина).

Начало дилюционной коагулопатии и эффект лечения можно измерить обычными тестами коагуляции, такими как ротационная тромбоэластометрия (ROTEM^®) и генерация тромбина, измеряемая калиброванной автоматизированной тромбограммой (CAT), которая осуществляется с помощью 1 пМ TF активатора.

ROTEM^® исследует взаимодействие факторов свертывания, их ингибиторов, антикоагулянтных лекарственных средств, клеток крови, в частности, тромбоцитов, во время свертывания и последующего фибринолиза. Реологические условия имитируют медленный ток крови в венах. Если вкратце, кровь помещают в одноразовую кювету с помощью электронной пипетки. Одноразовая игла крепится к стержню, который соединен с тонкой пружиной и медленно колеблется взад и вперед. Сигнал иглы, находящейся во взвешенном состоянии в образце крови, передается по системе оптического детектора. Прибор измеряет и графически отображает изменения в эластичности на всех стадиях образования и рассасывания тромба. Типичная температура теста 37°C, но можно выбирать разные температуры. Основным результатом является кривая реакции, которая показывает эластичность в течение времени, когда тромб образуется или растворяется.

Четыре параметра описывают кривую свертывания при обычном применении. Временем свертывания (СТ) является латентное время от добавления начального реагента к крови до начала формирования тромба. Удлинение СТ может являться результатом дефицитов свертывания, прежде всего, факторов свертывания или гепарина (в зависимости от применяемого теста). Сокращение CT указывает на гиперкоагуляцию. Угол альфа является углом касательной к кривой, тогда как время образования тромба (CFT) является временем от CT до достижения тромбом точки плотности 20 мм. Данные параметры обозначают скорость, с которой формируется плотный тромб, и в первую очередь зависят от функции тромбоцитов, но фибриноген и факторы свертывания также вносят свой вклад. Удлиненное CFT (или меньший альфа-угол), как правило, вызвано недостаточной функцией тромбоцитов, низким количеством тромбоцитов, нарушениями полимеризации фибрина или дефицитом фибриногена. Сокращение CFT (или большой альфа-угол) указывает на гиперкоагуляцию. Максимальной плотностью тромба (MCF) является самая большая вертикальная амплитуда записи прибора. Она отражает абсолютную прочность сгустка фибрина и тромбоцитов. Низкая MCF указывает на пониженное количество или функцию тромбоцитов, пониженный уровень фибриногена или нарушения полимеризации фибрина, или низкую активность фактора XIII. Механически слабый тромб представляет риск тяжелого кровотечения.

Можно применять вариации ROTEM^®, чтобы подчеркнуть различные параметры и эффекты. Например, EXTEM является скрининг-тестом для (внешней) системы гемостаза. Реагент EXTEM мягко активирует гемостаз с применением тканевого фактора. Таким образом, на результат влияют внешние факторы свертывания крови, тромбоциты и фибриноген.

Калиброванная автоматизированная тромбограмма (CAT) описывается Hemker и соавт. (Pathophysiol Haemost Thromb, 2002, 32:249-253). С помощью "медленного" флуорогенного субстрата тромбина и непрерывного сравнения с одновременно работающим калибратором, генерацию тромбина можно контролировать автоматически. "Тромбограмма", полученная в результате, измеряет способность к гипокоагуляции и гиперкоагуляции в бедной тромбоцитами плазме.

Лечение гемостатического нарушения или нормализация гемостаза может включать применение лечения фактором свертывания, например, FII и, факультативно, FX и FVIIa или комбинацией фибриногена и FII, факультативно также в комбинации с FX и FVIIa. Гемостатическим средством (средствами) могут являться рекомбинантные человеческие факторы, например, rhFII, rhFX и rhVIIa или только rhFII. В некоторых вариантах осуществления эффективное лечение гемостатического нарушения может включать введение FII или совместное введение FII, FX и FVIIa, или совместное введение фибриногена с FII, и, факультативно, также совместное введение FX и FVIIa, где FII, FX и/или FVIIa могут являться рекомбинантно полученными человеческими факторами.

Лечение или нормализацию гемостаза можно проводить без существенного добавления любого другого фактора свертывания. В некоторых вариантах осуществления лечение гемостатического нарушения может включать FII или совместное введение фибриногена и FII, где FII может являться рекомбинантным человеческим FII (rhFII).

Термин "существенное добавление" относится к добавлению других компонентов, таких как факторы свертывания в дополнение к тем, которые описаны в настоящем изобретении, в количестве, при котором эффект одного или нескольких гемостатических средств, при добавлении таких дополнительных факторов свертывания, значительно отличается от такого эффекта введения одного или нескольких гемостатических средств без добавления.

Как применяется в данном документе, "рекомбинантные" протеины включают протеины, полученные с помощью рекомбинантных технологий. Такие протеины включают те, которые имеют сходство с природным протеином, а также те, которые модифицированы для повышения активности, периода полувыведения протеина, стабильности протеина, локализации и эффективности протеина. См. опубликованную патентную заявку США № US 2005/0164367, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки.

Как применяется в данном документе, "лечение" является способом получения полезных или желаемых клинических результатов. Полезные или желаемые клинические результаты включают, но без ограничений, облегчение симптомов, уменьшение кровотечения, стабилизацию индивида и предотвращение кровотечения.

Фраза “включающий в основном” подразумевает не то, что необходимо воздерживаться от других одновременных обычных способов лечения пациента, а скорее то, что лечению, включающему в основном, например, введение FII или совместное введение эффективного количества фибриногена и FII, непосредственно не предшествует, не сопутствует, либо за ним не следует значительное добавление других факторов свертывания, в частности, белковых факторов свертывания, обозначаемых римскими цифрами V-XIII. В некоторых вариантах осуществления лечение, включающее в основном введение только FII или совместное введение эффективного количества фибриногена и FII, можно проводить одновременно с отдельными процедурами, такими как переливание крови, введение замороженных тромбоцитов, восстановленных клеток крови, жидкостей, содержащих кристаллоиды и/или коллоиды, и другими обычными способами лечения, которые не включают активное добавление факторов свертывания, сверх тех, которые могут являться эндогенными в переливаемой крови, препарате замороженных тромбоцитов или тому подобное. В других вариантах осуществления может оказаться ненужным или нежелательным одновременное проведение какой-либо процедуры, включающей отдельное введение композиции, которая включает значительные количества факторов свертывания (например, факторов V-XIII), при проведении лечения, включающего в основном введение эффективного количества из FII, 3F, фибриногена и FII или фибриногена и 3F.

В некоторых вариантах осуществления, способ лечения травматического нарушения свертываемости у млекопитающих, которые в этом нуждаются, может включать применение лечения фактором свертывания, который выбирают из группы, включающей (а) PCC (FII, FX, FIX, FVII и протеин C); (b) rhFII, rhFVIIa и rhFX; и (с) только rhFII, где (а), (b) или (с) предоставляются факультативно в комбинации с фибриногеном. Подобным образом, способ нормализации нарушенного гемостаза, связанного с травматическим нарушением свертываемости у млекопитающих, может включать применение лечения фактором свертывания, который выбирают из группы, включающей (а) PCC (FII, FX, FIX, FVII и протеин C), (b) rhFII, rhFVIIa и rhFX; и (с) только rhFII, где (а), (b) или (c) предоставляются факультативно в комбинации с фибриногеном. Кроме того, способ снижения смертности в результате травматического нарушения свертываемости может включать применение лечения фактором свертывания, который выбирают из группы, включающей (а) PCC (FII, FX, FIX, FVII и протеин C), (b) rhFII, rhFVIIa и rhFX; и (с) только rhFII, где (а), (b) или (c) предоставляются факультативно в комбинации с фибриногеном.

Способ лечения гемостатического нарушения или нормализации гемостаза может включать увеличение максимальной плотности тромба (MCF), сокращение времени свертывания (CT) и/или улучшение генерации тромбина после кровоизлияния или массивной кровопотери, связанных с травматическим нарушением свертываемости у млекопитающих, путем назначения комбинированной терапии, включающей или состоящей в основном из одного или более гемостатических средств, включая FII и факультативно фибриноген.

В любом из этих способов, лечение фактором свертывания можно выбирать из группы, включающей (а) PCC (FII, FX, FIX, FVII и протеин C), (b) rhFII, rhFVIIa и rhFX; и (с) rhFII. В одном из вариантов осуществления лечение фактором свертывания является комбинацией FII, FVIIa и FX. В другом варианте осуществления лечение фактором свертывания представляет собой FII или только rhFII. В других вариантах осуществления лечение фактором свертывания может являться либо комбинацией rhFII, rhFVIIa и rhFX, либо только rhFII, практически без добавления любого другого гемостатического фактора, в частности, других факторов свертывания, выраженных римскими цифрами. То есть, в некоторых вариантах осуществления способы могут включать введение rhFII и факультативно фибриногена, практически без добавления любого другого гемостатического фактора, в частности, факторов V-XIII.

В альтернативных вариантах осуществления способ лечения травматического нарушения свертывания у млекопитающих, которые в этом нуждаются, может включать применение лечения фактором свертывания, как описано выше. Подобным образом, способ нормализации нарушенного гемостаза, связанного с травматическим нарушением свертываемости у млекопитающих, может включать применение лечения фактором свертывания, как описано выше. Более того, способ снижения смертности в результате травматического нарушения свертываемости может включать применение лечения фактором свертывания, как описано выше.

Способ лечения гемостатического нарушения или нормализации гемостаза может включать увеличение максимальной плотности тромба (MCF), сокращение времени свертывания (CT), и/или улучшение генерации тромбина после кровоизлияния или массивной кровопотери, связанных с травматическим нарушением свертываемости, у млекопитающих способом, который может включать применение лечения фактором свертывания. В определенных вариантах осуществления, максимальная плотность сгустка возрастает от около 10 мм до около 40 мм, от около 10 мм до около 30 мм, до около 10 мм, до около 15 мм, до около 20 мм, до около 25 мм или до около 30 мм. В других вариантах осуществления время свертывания снижается на от около 35 до около 75 секунд или на около 35 секунд, на около 40 секунд, на около 45 секунд, на около 50 секунд, на около 55 секунд, на около 60 секунд, на около 65 секунд, на около 70 секунд или на около 75 секунд. Как и выше, лечение фактором свертывания можно выбирать из группы, включающей (а) PCC (FII, FX, FIX, FVII и протеин C), (b) rhFII, rhFVIIa и rhFX; и (с) только rhFII, где (а), (b) или (c) предоставляются факультативно в комбинации с фибриногеном. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления лечение фактором свертывания является либо комбинацией (1) FII, FVIIa и FX; либо (2) только FII. Лечение фактором свертывания может включать рекомбинантные человеческие факторы, т.е. либо комбинацию (1) rhFII, rhFVIIa и rhFX; либо (2) только rhFII. В некоторых вариантах осуществления способы могут включать совместное введение rhFII и факультативно совместное введение фибриногена.

"Совместное введение" или "совместное лечение" означает введение смеси компонентов, или отдельно вводимые компоненты совместного лечения во время, которое близко друг к другу, например, введение совместно вводимых компонентов в течение временно перекрывающихся периодов, или начальное введение одного из компонентов в пределах около часа, или получаса, или четверти часа от начала или прекращения введения совместно вводимого компонента.

Компоненты, вводимые в способах, раскрытых в данном документе, составляются и вводятся с применением методов, которые хорошо известны в данной области техники. Например, фибриноген и FII, rhFII или 3F можно вводить путем внутривенной инъекции или инфузии с применением фармацевтически приемлемого носителя или наполнителя. Носители и наполнители, подходящие для состава активных средств, включают любое фармацевтическое средство, которое не вызывает иммунный ответ, вредный для индивидуума, получающего композицию, и которое может вводиться без чрезмерной токсичности. Фармацевтически приемлемые наполнители включают, но без ограничений жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин, сахара и этанол. Фармацевтически приемлемые соли также могут включаться. Такие соли включают соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п., а также соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и тому подобное. Кроме того, вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие средства, рН буферные вещества и тому подобное, могут присутствовать в таких носителях. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей доступно в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., 18th Edition, Easton, Pa., 1990).

Гемостатическое нарушение может быть связано с любой коагулопатией (например, дилюционной коагулопатией) травматического кровотечения, периоперационного кровотечения, послеоперационного кровотечения, послеродового кровотечения и тому подобное. Гемостатическое нарушение может быть связано с уровнем концентрации фибриногена в крови менее, чем от около 2 до около 1,5 г/л или менее, чем от около 1 г/л или менее чем около 0,5 г/л. Гемостатическое нарушение может быть связано с потерей крови от около 30% до около 85%, например, более чем около 30%, около 40%, около 45%, около 50%, около 55%, около 60%, около 70 %, около 80%, или около 85% от предполагаемого общего объема крови млекопитающего, в некоторых вариантах осуществления, дилюционная коагулопатия является результатом восстановления нормоволемии или восстановления стабилизации гемодинамики. Таким образом, млекопитающим, нуждающимся в лечении, которое раскрыто в данном документе, может являться млекопитающее, отвечающее одному или нескольким из данных критериев.

Гемостатические нарушения также могут включать гемофилию А и В, гемофилию А и В у пациентов с ингибирующими антителами, дефициты факторов свертывания, например, фибриногена, FII, FV, FVII, FIX, FVIII, FX, FXI, FXII и FXIII, фактора фон Виллебранда, комбинированный FV/FVII дефицит, дефицит C1 витамин K-эпоксидредуктазы, дефицит гамма-карбоксилазы; кровотечения, связанные с травмой, повреждением, тромбозом, тромбоцитопенией, инсультом, коагулопатией, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием крови (ДВС-синдром); сверхантикоагуляцию, связанную с гепарином, низкомолекулярным гепарином, пентасахаридом, варфарином, низкомолекулярными антитромботическими средствами (т.е. FXa ингибиторами); и нарушения тромбоцитов, такие как синдром Бернара-Сулье, тромбластемия Гланцмана (Glanzman thromblastemia), и дефицит пула тромбоцитов.

Гемостатическое нарушение может также включать кровотечение, связанное с тромботическими нарушениями, такими как тромбоз глубоких вен, тромбоз, связанный с состояниями сердечнососудистого заболевания или злокачественными опухолями, тромбоз в результате присутствия постоянных катетеров или других инвазивных хиру