Способ полипептидной модификации для очистки полипептидных мультимеров

Способ полипептидной модификации для очистки полипептидных мультимеров

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к способам получения или очистки полипептидных мультимеров, полипептидных мультимеров с измененной способностью связывать белок А и т.д.

Предпосылки к созданию изобретения

Существует несколько описанных ранее способов получения биспецифического антитела класса IgG, имеющего человеческую константную область (антитело класса IgG, которое имеет человеческую константную область и в котором одно из плеч обладает специфической связывающей активностью к антигену А и другое обладает специфической связывающей активностью к антигену В). В общем, биспецифическое антитело класса IgG состоит из двух типов Н-цепей (т.е., Н-цепь к антигену А и Н-цепь к антигену В) и двух типов L-цепей (т.е., L-цепь к антигену А и L-цепь к антигену В). Когда экспрессируется биспецифическое антитело такого класса IgG, то экспрессируются два типа Н-цепей и два типа L-цепей, и существует десять возможных комбинаций для комбинации H2L2. Из них только у одной комбинации есть представляющая интерес специфичность (одно плечо имеет связывающую активность к антигену А и другое имеет связывающую активность, специфическую к антигену В). Таким образом, чтобы получить соответствующее биспецифическое антитело, необходимо очистить единственное нужное антитело из десяти типов антител. Это является чрезвычайно неэффективной и трудной процедурой.

Описываются способы решения данной проблемы, которые используют общую L-цепь так, чтобы у L-цепи к антигену А и L-цепи к антигену В была идентичная аминокислотная последовательность (патентные документы 1 и 2). Когда экспрессируется биспецифическое антитело класса IgG, имеющее такую общую L-цепь, то экспрессируются два типа Н-цепей и один тип общей L-цепи, и существует три возможные комбинации для комбинации H2L2. Одна из этих комбинаций представляет собой представляющее интерес биспецифическое антитело. Эти три комбинации представляют собой: моноспецифическое антитело к антигену А (гомомерная Н-цепь антитела к антигену А), биспецифическое антитело и к антигену А, и к антигену В (гетеромерное антитело с Н-цепью к антигену А и Н-цепь к антигену В), и моноспецифическое антитело к антигену В (гомомерная Н-цепь антитела к антигену В). Так как их соотношение, в общем, составляет 1:2:1, то эффективность экспрессии целевого биспецифического антитела составляет приблизительно 50%. Уже был описан способ последующего улучшения этой эффективности, который допускает гетеромерно связывать два типа Н-цепей (патентный документ 3). Это может увеличить эффективность экспрессии целевого биспецифического антитела приблизительно до 90-95%. В то же время, в способе описано рациональное удаление двух типов гомомерных антител, которые являются примесями, в которых аминокислотные замещения вводятся в вариабельные области двух типов Н-цепей, чтобы придать им различные изоэлектрические точки так, чтобы два типа гомомерных антител и целевое биспецифическое антитело (гетеромерное антитело) могли быть очищены путем ионообменной хроматографии (патентный документ 4). Комбинация вышеуказанных способов позволила эффективно продуцировать биспецифическое антитело (гетеромерное антитело), имеющее константную область человеческого класса IgG.

С другой стороны, в промышленном производстве антител класса IgG должна использоваться стадия очистки с помощью хроматографии с белком А, а ионообменная хроматография в стадии очистки используется не обязательно. Вследствие этого, использование ионообменной хроматографии для получения высокочистого биспецифического антитела приводит к возрастанию производственных затрат. К тому же, так как только одна ионообменная хроматография не может обеспечить полноценный способ очистки фармацевтических веществ, то предпочтительно выполнить более чем одну хроматографическую стадию, чтобы удалить примеси.

В любом случае, предпочтительно, чтобы биспецифические антитела могли быть также очищены высоко с помощью хроматографической стадии, в которой имеется метод разделения, отличающийся от метода ионообменной хроматографии. Желательно, чтобы один из таких методов разделения, хроматография с белком А, которая должна использоваться в промышленном производстве антител класса IgG, могла очищать биспецифические антитела до высокой чистоты.

В описанном ранее способе очистки биспецифического антитела (гетеромерного антитела) с использованием белка А используют биспецифическое антитело, имеющее Н-цепь IgG2a мыши, которая связывается с белком А и Н-цепь IgG2b крысы, которая не связывается с белком А. Сообщалось, что этот способ позволяет очистить целевое биспецифическое антитело с чистотой в 95% путем только стадии очистки на основе белка А (непатентный документ 1 и патентный документ 5). Тем не менее, в этом способе также используется ионообменная хроматография, чтобы улучшить чистоту биспецифического антитела. Другими словами, очистка высокочистого биспецифического антитела не может быть выполнена путем стадии очистки с использованием только хроматографии с белком А. Кроме того, катумаксомаб, биспецифическое антитело, продуцированное описанным выше способом и имеющее Н-цепь IgG2a мыши и Н-цепь IgG2b крысы, имеет время полужизни примерно в 2.1 дня у человека, который намного короче времени полужизни нормального IgG1 человека (от 2 до 3 недель) (непатентный документ 2). Вдобавок к наличию короткого времени полужизни, катумаксомаб является чрезвычайно иммуногенным по причине его мышиных и крысиных константных областей (непатентный документ 3). Таким образом, биспецифическое антитело, полученное такими способами, рассматривается как непригодное в качестве лекарственного средства.

С другой стороны, было предложено, чтобы с точки зрения иммуногенности, константная область IgG3 человека могла быть использована как несвязывающая белок А константная область (непатентный документ 1). Тем не менее, поскольку известно, что Н-цепи IgG1 человека и IgG3 человека почти не связываются друг с другом (непатентный документ 1), то возможно продуцировать целевое биспецифическое антитело с использованием Н-цепи IgG1 человека и Н-цепи IgG3 человека тем же самым способом, применяемым для биспецифического антитела, имеющего Н-цепь IgG2a мыши и Н-цепь IgG2b крысы. Кроме того, время полужизни человеческого IgG3 у человека, как сообщалось, в целом, было короче, чем время полужизни человеческого IgG1, человеческого IgG2, и человеческого IgG4 (непатентные документы 4 и 5). Следовательно, как биспецифическое антитело с использованием IgG2a мыши и IgG2b крысы, биспецифическое антитело с использованием человеческого IgG3 могло бы также иметь короткое время полужизни у человека. Причиной того, что ассоциация Н-цепи редко происходит между человеческим IgG1 и человеческим IgG3, предположительно может быть то, что он является шарнирной последовательностью человеческого IgG3 (непатентный документ 1). Тем временем, причина короткого времени полужизни константной области IgG3 человека еще не была объяснена полностью. Таким образом, до настоящего времени не было отчета относительно биспецифических антител, которые используют константную область IgG3 человека в качестве несвязывающей белок А константной области. Кроме того, также нет отчета относительно способов эффективного продуцирования или очистки высокочистых биспецифических антител, имеющих человеческую константную область и показывающих подобное длительное время полужизни как и IgG1 человека.

Документы известного уровня техники

Патентные документы

Патентный документ 1: WO 98050431

Патентный документ 2: WO 2006109592

Патентный документ 3: WO 2006106905

Патентный документ 4: WO 2007114325

Патентный документ 5: WO 95033844

Непатентные документы

Непатентный документ 1: The Journal of Immunology, 1995, 155:219-225

Непатентный документ 2: J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 14006)

Непатентный документ 3: Clin Cancer Res 2007 13:3899-3905

Непатентный документ 4: Nat Biotechnol. 2007 Dec; 25(12):1369-72

Непатентный документ 5: J. Clin Invest 1970; 49:673-80

Раскрытие изобретения

[Задачи, решаемые с помощью изобретения]

В общем, обычное антитело класса IgG может быть эффективно получено как высокочистый. IgG вследствие стадии очистки на основе белка А. Тем не менее, получение высокочистого биспецифического антитела требует дополнительной стадии очистки с использованием ионообменной хроматографии. Добавление такой стадии очистки путем ионообменной хроматографией может усложнить получение и увеличить стоимость производства. Таким образом, предпочтительно получать высокочистое биспецифическое антитело только посредством стадии очистки на основе белка А. Объектом настоящего изобретения является предоставление способов, которые используют только стадию очистки на основе белка А для эффективного получения или очистки высокочистого биспецифического антитела класса IgG, имеющего константную область тяжелой цепи человеческого антитела.

Тем не менее, поскольку участок связывания белка А в Fc домене является идентичным с участком связывания FcRn в Fc домене, то предполагается, что будет трудно отрегулировать активность связывать белок А, сохраняя связывание с FcRn человека. Сохранение связывающей способности FcRn человека является очень важным для длительного удержания плазмы (продолжительное время полужизни) у человека, которое характерно для антител класса IgG. Настоящее изобретение предоставляет способы, которые используют только стадию очистки на основе белка А для эффективного получения или очистки высокочистого биспецифического антитела, которое поддерживает время удержания плазмы, сопоставимое с или более продолжительное, чем время удержания плазмы IgG1 человека.

[Средства для решения задач]

Изобретатели настоящего изобретения обнаружили способы, использующие только стадию очистки на основе белка А для эффективной очистки или получения высокочистого полипептидного мультимера, способного связываться с двумя или более антигенами, в частности, полиспецифического антитела класса IgG, имеющего константную область человека, путем изменения его способности связывать белок А.

Кроме того, эти способы были объединены со способами регулирования ассоциации между первым полипептидом, обладающим антигенсвязывающей активностью и вторым полипептидом, обладающим антигенсвязывающей активностью путем модифицирования аминокислот, которые составляют интерфейс, сформированный при ассоциации полипептидов. Посредством этой комбинации настоящее изобретение способствует эффективному получению или очистке соответствующего высокочистого полипептидного мультимера.

Изобретатели настоящего изобретения также обнаружили, что посредством модифицирования аминокислотного остатка в положении 435 (EU нумерация) в константной области тяжелой цепи, способность связывать белок А может быть отрегулирована, сохраняя свое удержание плазмы, сравнимое с или более длительное, чем удержание плазмы IgG1 человека. Основываясь на этом открытии, может быть получено или очищено высокочистое биспецифическое антитело со временем удержания плазмы, сравнимым с или более длительным, чем время удержания IgG1 человека.

Настоящее изобретение основывается на открытиях, описанных выше, и предоставляет от [1] до [55] ниже:

[1] Способ получения полипептидного мультимера, который включает первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью и второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью или не обладающий антигенсвязывающей активностью, который включает стадии:

(a) экспрессии ДНК, которая кодирует первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью и ДНК, которая кодирует второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью или не обладающий антигенсвязывающей активностью; и

(b) сбора продукта экспрессии стадии (а),

где один или более аминокислотных остатков в любом из или обоих первого полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью и второго полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью или не обладающего антигенсвязывающей активностью были модифицированы, так что существует большее различие в способности связывать белок А между первым полипептидом, обладающим антигенсвязывающей активностью и вторым полипептидом, обладающим антигенсвязывающей активностью или не обладающим антигенсвязывающей активностью.

[2] Способ по [1], где продукт экспрессии собирается с использованием аффинной хроматографии с белком А в стадии (b).

[3] Способ по [1] или [2], где один или более аминокислотных остатков в любом из или обоих первого полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью и второго полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью или не обладающего антигенсвязывающей активностью были модифицированы, так что существует большее различие между рН растворителя для элюирования первого полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью из белка А и рН растворителя для элюирования второго полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью или не обладающего антигенсвязывающей активностью из белка А.

[4] Способ по любому из от [1] до [3], где один или более аминокислотных остатков в первом полипептиде, обладающем антигенсвязывающей активностью или втором полипептиде, обладающем антигенсвязывающей активностью или не обладающем антигенсвязывающей активностью были модифицированы для увеличения или уменьшения способности связывать белок А любого из первого полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью и второго полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью или не обладающего антигенсвязывающей активностью.

[5] Способ по любому из от [1] до [4], где один или более аминокислотных остатков в первом полипептиде, обладающем антигенсвязывающей активностью или втором полипептиде, обладающем антигенсвязывающей активностью или не обладающем антигенсвязывающей активностью были модифицированы для увеличения способности связывать белок А любого из первого полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью и второго полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью или не обладающего антигенсвязывающей активностью, и уменьшить способность связывать белок А другого полипептида.

[6] Способ по любому из от [1] до [5], где чистота собранного полипептидного мультимера составляет 95% или более.

[7] Способ по любому из от [1] до [6], где первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью и второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью или не обладающий антигенсвязывающей активностью включают аминокислотную последовательность Fc домена антитела или аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи антитела.

[8] Способ по [7], где по меньшей мере один аминокислотный остаток, выбранный из аминокислотных остатков положений от 250 до 255, от 308 до 317, и от 430 до 436 (EU нумерация), в аминокислотной последовательности Fc домена антитела или константной области тяжелой цепи антитела был модифицирован.

[9] Способ по любому из от [1] до [8], где первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью и второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью включают аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела.

[10] Способ по [9], где по меньшей мере один аминокислотный остаток был модифицирован в аминокислотных последовательностях FR1, CDR2, и FR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела.

[11] Способ по любому из от [1] до [10], где полипептидный мультимер включает один или два третьих полипептида, обладающих антигенсвязывающей активностью, и стадия (а) включает экспрессию ДНК, которая кодирует третий полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью.

[12] Способ по [11], где третий полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью, включает аминокислотную последовательность легкой цепи антитела.

[13] Способ по [11] или [12], где полипептидный мультимер дополнительно включает четвертый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью, и стадия (а) включает экспрессию ДНК, которая кодирует четвертый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью.

[14] Способ по [13], где, по меньшей мере, один из третьего и четвертого полипептидов, обладающих антигенсвязывающей активностью, включает аминокислотную последовательность легкой цепи антитела.

[15] Способ по [13], где первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью, включает аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи антитела и константной области тяжелой цепи антитела; второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью, включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи антитела; третий полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью, включает аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела и константной области легкой цепи антитела; и четвертый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью, включает аминокислотную последовательность легкой цепи антитела.

[16] Способ по любому из от [1] до [15], где полипептидный мультимер представляет собой полиспецифическое антитело.

[17] Способ по [16], где полиспецифическое антитело представляет собой биспецифическое антитело.

[18] Способ по любому из от [1] до [8], который включает первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью и второй полипептид, не обладающий антигенсвязывающей активностью, и где первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью, включает аминокислотную последовательность антигенсвязывающей области рецептора и аминокислотную последовательность Fc домена антитела, и второй полипептид, не обладающий антигенсвязывающей активностью, включает аминокислотную последовательность Fc домена антитела.

[19] Способ по любому из от [7] до [18], где Fc домен антитела или константная область тяжелой цепи антитела получена из человеческого IgG.

[20] Полипептидный мультимер, полученный способом по любому из от [1] до [19].

[21] Способ очистки полипептидного мультимера, который включает первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью и второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью или не обладающий антигенсвязывающей активностью, который включает стадии:

(a) экспрессии ДНК, которая кодирует первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью и ДНК, которая кодирует второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью или не обладающий антигенсвязывающей активностью; и

(b) сбора продукта экспрессии стадии (а) с помощью аффинной хроматографии с белком А,

где один или более аминокислотных остатков в любом из или обоих первого полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью и второго полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью или не обладающего антигенсвязывающей активностью были модифицированы, так что существует большее различие в способности связывать белок А между первым полипептидом, обладающим антигенсвязывающей активностью и вторым полипептидом, обладающим антигенсвязывающей активностью или не обладающим антигенсвязывающей активностью.

[22] Способ по [21], где один или более аминокислотных остатков в первом полипептиде, обладающем антигенсвязывающей активностью или втором полипептиде, обладающем антигенсвязывающей активностью или не обладающем антигенсвязывающей активностью были модифицированы, чтобы увеличить или уменьшить способность связывать белок А первого полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью или второго полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью или не обладающего антигенсвязывающей активностью.

[23] Способ по [20] или [21], где один или более аминокислотных остатков в первом полипептиде, обладающем антигенсвязывающей активностью или втором полипептиде, обладающем антигенсвязывающей активностью или не обладающем антигенсвязывающей активностью были модифицированы для увеличения способности связывать белок А любого из первого полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью и второго полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью или не обладающего антигенсвязывающей активностью, и уменьшить способность связывать белок А другого полипептида.

[24] Способ по любому из от [21] до [23], где чистота собранного полипептидного мультимера составляет 95% или более.

[25] Способ по любому из от [21] до [24], где первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью и второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью или не обладающий антигенсвязывающей активностью включают аминокислотную последовательность Fc домена антитела или аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи антитела.

[26] Способ по [25], где по меньшей мере один аминокислотный остаток, выбранный из аминокислотных остатков положений от 250 до 255, от 308 до 317, и от 430 до 436 (EU нумерация), в аминокислотной последовательности Fc домена антитела или константной области тяжелой цепи антитела был модифицирован.

[27] Способ по любому из от [21] до [26], где первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью и второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью включают аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела.

[28] Способ по [27], где по меньшей мере один аминокислотный остаток был модифицирован в аминокислотных последовательностях FR1, CDR2, и FR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела.

[29] Способ по любому из от [21] до [28], где полипептидный мультимер включает один или два третьих полипептида, обладающих антигенсвязывающей активностью, и стадия (а) включает экспрессию ДНК, которая кодирует третий полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью.

[30] Способ по [29], где третий полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью включает аминокислотную последовательность легкой цепи антитела.

[31] Способ по [29] или [30], где полипептидный мультимер дополнительно включает четвертый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью, и стадия (а) включает экспрессию ДНК, которая кодирует четвертый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью.

[32] Способ по [31], где по меньшей мере один из третьего и четвертого полипептидов, обладающих антигенсвязывающей активностью, включает аминокислотную последовательность легкой цепи антитела.

[33] Способ по [31], где первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью включает аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи антитела и константной области тяжелой цепи антитела; второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи антитела; третий полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью, включает аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела и константной области легкой цепи антитела; и четвертый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью, включает аминокислотную последовательность легкой цепи антитела.

[34] Способ по любому из от [21] до [33], где полипептидный мультимер представляет собой полиспецифическое антитело.

[35] Способ по [34], где полиспецифическое антитело представляет собой биспецифическое антитело.

[36] Способ по любому из от [25] до [35], где Fc домен антитела или константная область тяжелой цепи антитела получена из IgG человека.

[37] Полипептидный мультимер, который включает первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью и второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью или не обладающий антигенсвязывающей активностью, где способность связывать белок А отличается для первого полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью и второго полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью или не обладающего антигенсвязывающей активностью.

[38] Полипептидный мультимер по [37], где существует различие между рН растворителя для элюирования первого полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью из белка А и рН растворителя для элюирования второго полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью или не обладающий антигенсвязывающей активностью из белка А.

[39] Полипептидный мультимер по [37] или [38], где первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью или второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью или не обладающий антигенсвязывающей активностью включает аминокислотную последовательность Fc домена антитела или аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи антитела, и где, по меньшей мере, один аминокислотный остаток, выбранный из аминокислотных остатков положений от 250 до 255, от 308 до 317, и от 430 до 436 (EU нумерация) в аминокислотной последовательности Fc домена антитела или константной области тяжелой цепи антитела был модифицирован.

[40] Полипептидный мультимер по любому из от [37] до [39], где первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью и второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью или не обладающий антигенсвязывающей активностью включают аминокислотную последовательность Fc домена антитела или аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи антитела;

где аминокислотный остаток положения 435 (EU нумерация) в аминокислотной последовательности Fc домена антитела или константной области тяжелой цепи антитела представляет собой гистидин или аргинин в любом из первого полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью и второго полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью или не обладающего антигенсвязывающей активностью; и

где аминокислотный остаток положения 435 (EU нумерация) в аминокислотной последовательности Fc домена антитела или константной области тяжелой цепи антитела в любом из вышеуказанных полипептидов отличается от такового в другом полипептиде.

[41] Полипептидный мультимер по любому из от [37] до [40], где первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью и второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью или не обладающий антигенсвязывающей активностью включают аминокислотную последовательность Fc домена антитела или аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи антитела;

где аминокислотный остаток положения 435 (EU нумерация) в аминокислотной последовательности Fc домена антитела или константной области тяжелой цепи антитела представляет собой гистидин в любом из первого полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью и второго полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью или не обладающего антигенсвязывающей активностью; и

где аминокислотный остаток положения 435 (EU нумерация) в аминокислотной последовательности Fc домена антитела или константной области тяжелой цепи антитела представляет собой аргинин в другом полипептиде.

[42] Полипептидный мультимер по любому из от [37] до [41], где первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью и второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью включают аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела, и, по меньшей мере, один аминокислотный остаток был модифицирован в аминокислотных последовательностях FR1, CDR2, и FR3 вариабельной области тяжелой цепи.

[43] Полипептидный мультимер по любому из от [37] до [42], который дополнительно включает один или два третьих полипептида, обладающих антигенсвязывающей активностью.

[44] Полипептидный мультимер по [43], где третий полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью, включает аминокислотную последовательность легкой цепи антитела.

[45] Полипептидный мультимер по [43] или [44], который дополнительно включает четвертый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью.

[46] Полипептидный мультимер по [45], где, по меньшей мере, один из третьего и четвертого полипептидов, обладающих антигенсвязывающей активностью включает аминокислотную последовательность легкой цепи антитела.

[47] Полипептидный мультимер по [45], где первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью включает аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи антитела и константной области тяжелой цепи антитела; второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи антитела; третий полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью включает аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела и константной области легкой цепи антитела; и четвертый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью включает аминокислотную последовательность легкой цепи антитела.

[48] Полипептидный мультимер по любому из от [37] до [47], который представляет собой полиспецифическое антитело.

[49] Полипептидный мультимер по [48], где полиспецифическое антитело представляет собой биспецифическое антитело.

[50] Полипептидный мультимер по любому из от [37] до [41], который включает первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью и второй полипептид, не обладающий антигенсвязывающей активностью, и где первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью включает аминокислотную последовательность антигенсвязывающей области рецептора и аминокислотную последовательность Fc домена антитела, и второй полипептид, не обладающий антигенсвязывающей активностью включает аминокислотную последовательность Fc домена антитела.

[51] Полипептидный мультимер по любому из от [39] до [50], где Fc домен антитела или константная область тяжелой цепи антитела получена из IgG человека.

[52] Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, который составляет Полипептидный мультимер по любому из от [20] и [37] до [51].

[53] Вектор, вставленный с нуклеиновой кислотой по [52].

[54] Клетка, включающая нуклеиновую кислоту по [52] или вектор по [53].

[55] Фармацевтическая композиция, включающая Полипептидный мультимер по любому из от [20] и [37] до [51] в качестве действующего ингредиента.

[Осуществление изобретения]

Настоящее изобретение предоставляет способы, которые используют только стадию очистки на основе белка А для эффективной очистки или получения высокочистого полипептидного мультимера, имеющего связывающую активность по отношению к двум или более антигенов (полиспецифическое антитело), путем изменения их способности связывать белок А. Способы настоящего изобретения способствуют эффективной очистке или получению представляющего интерес высокочистого полипептидного мультимера, не ослабляя действия других целевых аминокислотных модификаций. В частности, посредством комбинирования этих способов со способом регулирования ассоциации между двумя областями белка, представляющие интерес полипептидные мультимеры могут быть получены более эффективно или очищены до более высокой чистоты.

Способы настоящего изобретения получения или очистки полиспецифических антител отличаются тем, что аминокислотные остатки в их константной области тяжелой цепи антитела и/или вариабельной области тяжелой цепи антитела являются модифицированными. Аминокислотные модификации настоящего изобретения введены в эти области, чтобы модифицировать их способность связывать белок А. Кроме того, также могут быть получены другие эффекты от представляющей интерес аминокислотной модификации, например, сравнимое или более длительное время удержания плазмы, чем таковое IgG1 человека. Способы настоящего изобретения способствуют эффективному изготовлению высокочистых полиспецифических антител, имеющих такие эффекты аминокислотной модификации.

В общем, получение высокочистых полиспецифических антител класса IgG требует стадии очистки с использованием ионообменной хроматографии. Тем не менее, добавление этой стадии очистки усложняет производство и увеличивает производственные затраты. С другой стороны, очистка, которая использует только ионообменную хроматографию, не может быть достаточно надежной в качестве способа очистки для фармацевтических препаратов. Таким образом, задача состоит в разработке способа получения биспецифического антитела класса IgG с использованием только стадии очистки на основе белка А, или в разработке надежного способа получения с использованием стадии очистки на основе белка А и стадии ионообменной хроматографии.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлен график, показывающий оценку времени удержания плазмы MRA-IgG1 и MRA-z106/z107k у трансгенных мышей с FcRn человека.

На фиг.2 представлена диаграмма, показывающая, что та же самая область в Fc домене антитела связывается с белком А и FcRn.

На фиг.3 показывает динамику концентраций плазмы Q499-z118/J339-z119/L377-k и Q499-z121/J339-z119/L377-k после введения трансгенным мышам с FcRn человека.

На фиг.4 представлено схематическое изображение GC33-IgG1-CD3-scFv молекулы, которая двухвалентно связывается с раковым специфическим антигеном глипикан-3 (GPC3) и моновалентно связывается с Т-клеточным антигеном CD3.

На фиг.5 показан результат анализа эксклюзионной хроматографии очищенных с белком A NTA1L/NTA1R/GC33-k0 и NTA2L/NTA2R/GC33-k0.

На фиг.6 представлено схематическое изображение молекулы анти-GPC3 IgG антитела, которая моновалентно связывается с глипиканом-3.

На фиг.7 показан результат анализа эксклюзионной хроматографии очищенных с белком A NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0, NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0, и NTA4L/NTA4R/GC33-k0.

На фиг.8 показаны хроматограммы NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0, NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0, и NTA4L/NTA4R/GC33-k0, которые были подвержены очистке колоночной хроматографией с белком А с рН градиентным элюированием.

На фиг.9 представлено схематическое изображение молекулы слитого белка Fc альфа рецептор-Fc, который моновалентно связывается с IgA.

На фиг.10 показан результат анализа эксклюзионной хроматографии очищенных с белком A LAL-cont/IAR-cont и IAL/IAR.

На фиг.11 представлена схематическая диаграмма для no1, встречающегося в природе анти-IL-6 рецептор/анти-GPC3 биспецифического антитела.

На фиг.12 представлена схематическая диаграмма для nо2, полученного путем перестановки VH-области и VL-области анти-GPC3 антитела в no1.

На фиг.13 представлена схематическая диаграмма для no3, который был получен путем модифицирования no2, чтобы изменить изоэлектрическую точку каждой цепи.

На фиг.14 представлена схематическая диаграмма для no5, который был получен путем модифицирования no3, чтобы усилить гетеромерную ассоциацию Н-цепей и очистить гетеромерно ассоциированное антитело с использованием белка А.

На фиг.15 представлена схематическая диаграмма для no6, который был получен путем модифицирования no5, чтобы усилить ассоциацию между целевой Н-цепью и целевой L-цепью.

На фиг.16 представлены хроматограммы анти-IL-6 рецептор/анти- GPC3 биспецифических антител no1, nо2, no3, nо5, и no6 в катионообменной хроматографии, чтобы оценить их паттерны экспрессии.

На фиг.17 представлена хроматограмма для no6 КС, элюированного с рН градиентом из колонки HiTrap protein A HP (GE Healthcare).

На фиг.18 представлена хроматограмма анализа катионообменной хроматографии, чтобы оценить главную пиковую фракцию, полученную очисткой фракции для no6, очищенной с белком А, с использованием колонки SP Sepharose HP (GE Healthcare).

Форма осуществления изобретения

Настоящее изобретение предоставляет способы получения полипептидного мультимера, который включает первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью и второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью или не обладающий антигенсвязывающей активностью. Способы настоящего изобретения для получения полипептидного мультимера включают стадии:

(а) экспрессии ДНК, кодирующей первый полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью и ДНК, кодирующей второй полипептид, обладающий антигенсвязывающей активностью или не обладающий антигенсвязывающей активностью; и

(b) сбора продуктов экспрессии стадии (а); где

один или более аминокислотных остатков в любом из или обоих первого полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью и второго полипептида, обладающего антигенсвязывающей активностью или не обладающего антигенсвязывающей активностью были модифицированы, так что существует большее различие в способности связывать белок А между первым полипептидом, обладающим ант