Способ (варианты) захвата представляющих интерес частиц из смеси

Способ (варианты) захвата представляющих интерес частиц из смеси

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к захвату представляющей интерес частицы, такой как вирусоподобная частица (например, рекомбинантно экспрессированной, самособирающейся VLP), из смеси. Изобретение предусматривает эффективный захват представляющих интерес частиц, количество которых можно увеличить до больших объемов для использования в коммерческом масштабе.

ВВЕДЕНИЕ

Революция в генетической инженерии развилась до разработки рекомбинантных белков, которые можно использовать в ряде различных применений, включая терапевтические средства для человека и животных. Существует значительно более 100 биотехнологически полученных терапевтических средств и вакцин, одобренных FDA США для медицинского применения, и более 1000 дополнительных лекарственных средств и вакцин находятся на различных этапах клинических испытаний. В настоящее время для получения рекомбинантных белков с различными степенями успеха используют клеточные экспрессирующие системы бактерий, дрожжей, насекомых, растений и млекопитающих. Хотя это развитие технологии произвело переворот в получении и доставке фармацевтических и терапевтических продуктов, все еще остались проблемы с очисткой молекул, которые можно получать. Например, очистка белка от бактерий требует лизиса клеток, что может требовать несколько этапов и очистки раствора от примесей. При этом хроматографические смолы, используемые в процессе очистки, склонны к забивке и клеточные экстракты могут требовать дополнительной очистки от примесей другими способами, такими как центрифугирование или фильтрация. Также могут требоваться несколько этапов очистки, которые занимают время, а также могут приводить к потере образца и снижению выходов. Очистка представляющего интерес белка может являться дорогостоящей и технически сложной. Переработка для выделения и очистки конечного продукта может составлять до 80 процентов всей стоимости.

Для очистки белков широко используют адсорбционную хроматографию с уплотненным слоем. Использование уплотненных слоев требует удаления неразрушенных клеток и коллоидального дебриса. Несмотря на частое игнорирование при разработке способа в лабораторных масштабах, удаление дебриса является одним из самых сложных действий для достижения высокой эффективности. Адсорбция в расширяющемся слое представляет собой недавно разработанный способ, который можно использовать для очистки растворимого белка, и предъявляет меньше требований к очистке от примесей по ходу процесса. В ней используют поток жидкости через структуру исходно уплотненного слоя с достижением контакта при высокой пористости для жидкости.

Одним из подходов для получения рекомбинантного белка, особенно иммуногенного рекомбинантного белка, такого как иммуногенный вирусный рекомбинантный белок, является использование вирусоподобных частиц (VLP). Многие вирусы содержат капсиды, которые могут собираться из индивидуально экспрессируемых структурных белков, как in vivo в клетке, где структурные белки и рекомбинантные белки экспрессируются в формирующихся VLP, так и вне клетки после выделения и очистки. Однако захват таких VLP в смеси, содержащей высокосуспендированные твердые вещества и частицы различных размеров, как правило, в ситуациях, относящихся к получаемым из растений материалам, является технически очень сложным. VLP могут являться иммуногенными при инъекции животным с индукцией продукции антител к вирусам, которые могут блокировать инфекцию. Таким образом, например, мыши, вакцинированные вирусоподобным частицами, продуцируемыми с белками штамма птиц H5N1, могут получать защиту от заражения летальными вирусами H5N1.

В индустрии остается необходимость в способе захвата представляющих интерес частиц с улучшенной эффективностью и выходом. Также остается необходимость в масштабировании такого способа для коммерческого уровня для захвата представляющих интерес частиц рентабельным способом.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение, по меньшей мере частично, основано на открытии того, что хроматография с адсорбцией в расширяющемся слое (EBA) является особенно эффективной для захвата представляющих интерес частиц из смеси. В определенных вариантах осуществления способ можно преимущественно использовать для захвата представляющих интерес частиц в одноэтапном способе связывания и элюции, который является масштабируемым до коммерческих уровней.

В основном аспекте предоставлен способ захвата представляющих интерес частиц из смеси, включающий использование расширяющегося слоя адсорбента.

В одном из вариантов осуществления способ включает этапы (a) предоставления расширяющегося слоя адсорбента; (b) приведения смеси в контакт с адсорбентом так, что составляющие смеси контактируют и взаимодействуют с расширяющимся слоем адсорбента; (c) необязательной отмывки адсорбента и (d) необязательной элюции представляющих интерес частиц из адсорбента.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления представляющая интерес частица представляет собой представляющую интерес биологическую частицу.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления представляющая интерес частица содержит по меньшей мере один белок.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления представляющая интерес частица содержит по меньшей мере два белка, по меньшей мере один из которых является представляющим интерес белком.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления представляющая интерес частица представляет собой вирусоподобную частицу.

В первом аспекте изобретения предоставлен способ захвата представляющих интерес вирусоподобных частиц из смеси, включающий использование расширяющегося слоя адсорбента, соответственно, где указанный способ включает этапы (a) предоставления расширяющегося слоя адсорбента; (b) приведения смеси в контакт с адсорбентом так, что вирусоподобные частицы в смеси связывают адсорбент; (c) необязательной отмывки адсорбента и (d) необязательной элюции вирусоподобных частиц из адсорбента.

В одном из вариантов осуществления этого первого аспекта изобретение дополнительно относится к способу по предшествующему варианту осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, где вирусоподобные частицы содержат белок вируса гриппа, в частности гемагглютинин; соответственно подтип гемагглютинина выбран из группы, состоящей из H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16, или комбинации двух или более из них.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, адсорбент содержится в колонке.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, смесь происходит или ее получают из растения.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, растение представляет собой природное растение, мутантное растение, неприродное растение или трансгенное растение.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления смесь происходит или ее получают из листа растения.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, смесь получают посредством гомогенизации растительного материала до контакта с адсорбентом. Таким образом, по этому варианту осуществления смесь представляет собой гомогенизированный растительный материал.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, растение представляет собой растительную клетку, такую как растительная клетка, выращиваемая в культуре или вне растения, такая как выращиваемая in vitro растительная клетка или скопления клеток, таких как клетки моркови.

В одном из вариантов осуществления первого аспекта изобретения изобретение относится к способу по любому из предшествующих вариантов осуществления или комбинации предшествующих вариантов осуществления, где смесь содержит разрушенные клетки растения соответственно, где растение представляет собой растение табака, инфильтрированное молекулами нуклеиновой кислоты, транзиторно экспрессирующими белок в растении, где указанный белок находится в вирусоподобных частицах, более соответствующе, где смесь происходит или ее получают из надземных частей растения.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, адсорбент содержит множество гранул.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, гранулы представляют собой составные гранулы, содержащие инертный материал сердцевины.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, гранулы содержат, состоят или, по существу, состоят из материала, выбранного из группы, состоящей из пластмасс, метакрилата, анионообменного материала, диэтиламиноэтила, катионообменного материала, полисахарида, диоксида кремния, поли(стиролдивинил)бензола, полиакриламида, керамики и их производных, или комбинации двух или более из них.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, гранулы содержат, состоят или, по существу, состоят из полисахарида, соответственно, целлюлозы, агарозы, декстрана или их производных или комбинации из двух или более из указанного выше.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, инертный материал сердцевины содержит, состоит или, по существу, состоит из материала, выбранного из группы, состоящей из кварца, диоксида кремния, сплава Nd-Fe-B, нержавеющей стали, оксида циркония, диоксида циркония, силикатов металлов, боросиликатов металлов, керамики, содержащей диборид титана, карбида титана, диборида циркония, карбида циркония, карбида вольфрама, карбида кремния, нитрида алюминия, нитрида кремния, нитрида титана, оксида иттрия, порошка металлического кремния и дисилицида молибдена; оксидов и сульфидов металлов, включая оксиды магния, алюминия, титана, ванадия, хрома, циркония, гафния, марганца, железа, кобальта, никеля, меди и серебра; оксид неметаллов; соли металлов, включая сульфат бария; металлические элементы, включая вольфрам, цирконий, титан, гафний, ванадий, хром, марганец, железо, кобальт, никель, индий, медь, серебро, золото, палладий, платину, рутений, осмий, родий и иридий и сплавы металлических элементов, такие как сплавы, формируемые между указанными металлическими элементами и их производными, или комбинации двух или более из них.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, размер гранул составляет приблизительно от 5 мкм до 500 мкм или более.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, размер гранул, которые связывают представляющие интерес частицы, составляет приблизительно от 25 мкм до 100 мкм, соответственно, приблизительно 50 мкм.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, размер гранул, которые связывают материал, отличный от представляющей интерес частицы, например растительные материалы, составляет от приблизительно 125 мкм до 250 мкм, соответственно, приблизительно 150 мкм.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, способ включает этап предварительного захвата, который включает использование дополнительного расширяющегося слоя адсорбента. Этот первый расширяющийся слой адсорбента содержит гранулы, соответственно, в диапазоне размеров, составляющем приблизительно от 125 мкм до 250 мкм, более соответственно, приблизительно 150 мкм.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, адсорбент содержит лиганд.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, лиганд содержит, состоит или, по существу, состоит из лиганда, выбранного из группы, состоящей из (i) бензиламина или его производного; (ii) алкиламина или его производного; (iii) алкениламина или его производного; (iv) алкиниламина или его производного; (v) алкоксиамина или его производного и (vi) амина моно- или бициклических ароматических или гетероароматических молекул или их производных, или комбинации двух или более из них.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, лиганд содержит, состоит или, по существу, состоит из анионообменной смолы.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, анионообменная смола содержит, состоит или, по существу, состоит или представляет собой ионообменную смолу на основе диэтиламиноэтилцеллюлозы, соответственно, ионообменной смолы на основе диэтиламиноэтилцеллюлозы-декстрана.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, электропроводность смеси до контакта с адсорбентом составляет приблизительно от 1 мСм/см до 10 мСм/см, соответственно, от 2 мСм/см до 3 мСм/см.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, pH смеси до контакта с адсорбентом составляет приблизительно от pH 6,0 до pH 8,0.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, смесь для связывания представляющих интерес частиц вносят в колонку при линейной скорости потока в диапазоне приблизительно от 1 см/мин до 15 см/мин.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, плотность адсорбента находится в диапазоне приблизительно от 1 г/мл до 20 г/мл.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, степень расширения расширяющегося слоя находится в диапазоне приблизительно от 1 до 5.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, указанный способ включает этап предварительного захвата до приведения смеси в контакт с адсорбентом.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, этап предварительного захвата выбран из группы, состоящей из фильтрации, микрофильтрации, центрифугирования, декантации и седиментации, или комбинации двух или более из них.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, этап предварительного захвата включает: (i) приведение материала в контакт с ионообменной смолой или (ii) кислотное осаждение и фильтрацию материала.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, материал приводят в контакт с ионообменной смолой в режиме статического связывания или периодической инкубации.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, элюат или одну или несколько его фракций, получаемых на этапе (d), подвергают этапу дальнейшей обработки.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, этап последующей обработки выбран из группы, состоящей из очистки, фильтрации, микрофильтрации, центрифугирования, декантации и седиментации, или комбинации двух или более из них.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, представляющая интерес частица содержит представляющий интерес белок.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, представляющий интерес белок представляет собой антиген.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, представляющий интерес белок представляет собой гемагглютинин.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, гемагглютинин представляет собой подтип гемагглютинина, выбранный из группы, состоящей из H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16, или комбинации двух или более из них.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, коэффициент расширения расширяющегося слоя в течение этапа элюции составляет приблизительно от 0,5 до 5.

Во втором аспекте предоставлен способ захвата представляющих интерес частиц из смеси, включающий этапы (i) помещения в колонку расширяющегося слоя адсорбента, содержащего лиганд при высоте уплотненного слоя более 10 см, где плотность адсорбента составляет приблизительно от 1 г/мл до 20 г/мл, где степень расширения расширяющегося слоя составляет приблизительно от 1 до 5 и где средний размер частиц адсорбента составляет от приблизительно 5 мкм до приблизительно 500 мкм; (ii) уравновешивание материала смолы при pH в диапазоне pH приблизительно от 6,0 до 8,0; (iii) предоставления смеси, содержащей представляющие интерес частицы, где электропроводность указанной смеси составляет приблизительно от 1 мСм/см до 10 мСм/см; (iv) внесения смеси в колонку при скорости потока (например, линейной скорости потока) в диапазоне приблизительно от 1 см/мин до 15 см/мин для связывания представляющих интерес частиц; (v) отмывки нагруженной колонки с использованием буфера с pH в диапазоне pH приблизительно от 6,0 до 8,0; и (vi) элюции представляющих интерес связанных частиц из колонки в одной или нескольких фракциях.

В одном из вариантов осуществления этого второго аспекта представляющая интерес частица представляет собой вирусоподобную частицу (VLP) или тенеподобную частицу.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта смесь происходит или ее получают из растения.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта растение представляет собой природное растение, мутантное растение, неприродное растение или трансгенное растение.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта смесь происходит или ее получают из листа растения.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта представляющая интерес частица содержит представляющий интерес белок.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта представляющий интерес белок представляет собой антиген.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта представляющий интерес белок представляет собой гемагглютинин.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта гемагглютинин представляет собой подтип гемагглютинина, выбранный из группы, состоящей из H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16, или комбинации двух или более из них.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта, размер гранул, которые связывают представляющую интерес частицу, составляет приблизительно от 25 мкм до 100 мкм, соответственно приблизительно 50 мкм.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта, размер гранул, которые связывают материал, отличный от представляющей интерес частицы, например растительные материалы, составляет приблизительно от 125 мкм до 250 мкм, соответственно приблизительно 150 мкм.

В одном из вариантов осуществления этого второго аспекта или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта, предоставлен способ захвата из смеси представляющих интерес вирусоподобных частиц, включающий этапы

(i) помещения в колонку расширяющегося слоя адсорбента, содержащего диэтиламиноэтилцеллюлоза-декстран, где плотность адсорбента составляет приблизительно от 2,5 г/мл до 3,5 г/мл и где средний размер частиц адсорбента составляет приблизительно 50;

(ii) уравновешивание материала смолы при pH в диапазоне pH приблизительно от 6,0 до 8,0;

(iii) предоставления смеси, содержащей растительный материал табака, где электропроводность указанной смеси составляет приблизительно от 2 мСм/см до 3 мСм/см;

(iv) внесения смеси в колонку при скорости потока приблизительно 2,5 см/мин для связывания вирусоподобных частиц, и где степень расширения расширяющегося слоя в колонке составляет приблизительно 2;

(v) отмывки нагруженной колонки с использованием буфера с pH в диапазоне pH приблизительно от 6,0 до 8,0; и

(vi) элюции представляющих интерес связанных частиц из колонки в одной или нескольких фракциях.

В одном из вариантов осуществления способ по предыдущему варианту осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта, включает этап (iii), включающий (a) предоставление целых растений табака, транзиторно экспрессирующих белок, находящийся в вирусоподобных частицах; (b) разрушение клеток листьев и стеблей растений табака с получением растительного материала табака и (c) регуляцию pH и электропроводности смеси посредством разведения буфером или деионизированной водой.

В одном из вариантов осуществления способ по предшествующему варианту осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта до этапа (iv) включает этап, включающий фильтрацию смеси из этапа (iii) и приведение фильтрованной смеси из этапа (iii) в контакт с первым расширяющимся слоем адсорбентов, содержащим полиэтиленимин, где размер гранул составляет приблизительно 150 мкм, с удалением из смеси нежелательных веществ.

В третьем дополнительном аспекте предоставлен расширяющийся слой адсорбента, содержащий представляющие интерес частицы, обратимо связанные с ним.

В одном из вариантов осуществления этого третьего аспекта, адсорбент содержит множество гранул.

В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого третьего аспекта, размер гранул, которые связывают представляющие интерес, частицы составляет приблизительно от 25 мкм до 100 мкм, соответственно, приблизительно 50 мкм.

В четвертом дополнительном аспекте предоставлено применение расширяющегося слоя адсорбента для захвата из смеси представляющих интерес частиц, конкретно, представляющих интерес вирусоподобных частиц, более конкретно, из смеси, которую получают из растения, транзиторно экспрессирующего белок, где указанный белок находится в вирусоподобных частицах.

В одном из вариантов осуществления этого четвертого аспекта частица представляет собой вирусоподобную частицу (VLP) или тенеподобную частицу.

Пятый аспект относится к расширяющемуся слою адсорбента, содержащему представляющие интерес частицы, соответственно, где с ним обратимо связаны представляющие интерес вирусоподобные частицы, в частности, где адсорбент находится в режиме хроматографии с расширяющимся слоем.

Шестой аспект относится к применению хроматографии с расширяющимся слоем для захвата представляющих интерес частиц, соответственно вирусоподобных частиц, из смеси.

Вариант(ы) осуществления и комбинации вариантов осуществления, описанные выше для основного и первого аспектов изобретения, также могут формировать варианты осуществления по меньшей мере второго, третьего, четвертого, пятого и шестого аспектов по настоящему изобретению.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Технические термины и выражения, используемые в объеме настоящей заявки, в общем, следует понимать в значении, как правило, в котором их используют в технических областях растений и молекулярной биологии. Все из приводимых ниже определений применяются для всего содержания настоящей заявки. Слово "содержащий (включающий)" не исключает других элементов или этапов, а формы единственного числа не исключают множественного. Один этап может исполнять функции нескольких характеристик, указанных в формуле изобретения. Термины "по существу", "примерно", "приблизительно" и т.п. по отношению к параметру или значению, в частности, также определяют точный параметр или точное значение, соответственно. Термин "приблизительно" в отношении приведенного числового значения или диапазона относится к значению или диапазону, которые находятся в пределах 20%, в пределах 10% или в пределах 5% от приведенного значения или диапазона. Термины "миллионные доли" или "м.д." используют в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения меры чистоты представляющих интерес очищенных частиц или представляющих интерес очищенных белков. Единицы м.д. указывают на количество белка хозяина в нанограммах/миллилитр по отношению к представляющему интерес белку в миллиграммах/миллилитр, где белки находятся в растворе, где м.д. белка хозяина = (нг/мл белка хозяина)/(мг/мл представляющего интерес белка). Когда белки сушат, например, посредством лиофилизации, м.д. относится к (нг белка хозяина)/(мг представляющего интерес белка).

Термин "расширяющийся слой" относится к вариантам осуществления, где хроматографический процесс функционирует со слоями адсорбента с классифицируемыми (стратифицируемыми) диапазонами размеров, диапазонами плотностей или обоими, стабильно псевдоожиженными посредством направленного потока жидкости, соответственно восходящего потока жидкости, с минимальным аксиальным смешиванием адсорбентов, обеспечивая контакт жидких и твердых компонентов в жидкости с адсорбентами при прохождении через слой. Таким образом, жидкость проходит через слой почти в условиях поршневого вытеснения.

"Адсорбент" относится к любому веществу, которое может адсорбировать представляющие интерес частицы на своей поверхности посредством сил межмолекулярного взаимодействия. Как правило, связывание представляющих интерес частиц с адсорбентом является обратимым так, что их можно элюировать из адсорбента в требуемое время.

Как применяют в настоящем документе, термин "представляющая интерес частица" относится к молекулярной структуре, захват которой из смеси является желательным. В определенных вариантах осуществления представляющая интерес частица содержит один или несколько белков. В других вариантах осуществления представляющая интерес частица содержит один или более или два или более (например, множество) белков, по меньшей мере один из которых является представляющим интерес белком. В одном из вариантов осуществления частица для захвата представляет собой частицу, содержащую множество макромолекул биологического происхождения, и таким образом является представляющей интерес биологической частицей. В другом варианте осуществления частица для захвата представляет собой вирусоподобную частицу. В другом варианте осуществления частица для захвата представляет собой частицу-тень бактерии. Как применяют в настоящем документе, термин "захваченные представляющие интерес частицы" относится к препарату представляющих интерес частиц, в котором по меньшей мере приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по массе препарата представляют собой желаемые представляющие интерес частицы. В вариантах осуществления в способах по настоящему изобретению происходит захват по меньшей мере 50% общего количества представляющих интерес частиц, исходно присутствующих в смеси, включая по меньшей мере 60%, 70%, 80% или 90% представляющих интерес частиц. Можно достигать даже больших степеней захвата, таких как по меньшей мере 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99%. Термин "очищенные представляющие интерес частицы" относится к препарату представляющих интерес частиц, в котором по меньшей мере приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по массе препарата представляют желаемые представляющие интерес частицы с оставшейся массой, в которую вносят вклад загрязняющие примеси или загрязнители, в частности другие белки, нуклеиновые кислоты, липиды или углеводы или их сочетание, такие как загрязняющие примеси или загрязнители, происходящие из клетки-хозяина, которые могут совместно очищаться с очищенными представляющими интерес частицами. В одном из вариантов осуществления захваченные или очищенные представляющие интерес частицы, по существу, не содержат загрязняющих макромолекул (за исключением растворителя). Частицы, описываемые в настоящем документе, можно характеризовать различными способами, известными в данной области, такими как электрораспыление-анализ дифференциальной подвижности (ES-DMA), фракционирование в асимметричном потоке при наличии поля с многоугловой детекцией рассеяния (AFFFF-MALS) и трансмиссионная электронная микроскопия (TEM). В одном из вариантов осуществления размер представляющей интерес частицы составляет менее чем приблизительно 1,0, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,09, 0,08, 0,07, 0,06, 0,05, 0,04 или 0,03 мкм в диаметре, например от 1,0 до 0,03, от 0,8 до 0,03, от 0,6 до 0,03, от 0,4 до 0,03, от 0,2 до 0,03, от 0,1 до 0,03, от 0,08 до 0,03, от 0,06 до 0,03, от 0,05 до 0,03 или от 0,04 до 0,03 мкм в диаметре.

Как применяют в настоящем документе, термины "вирусоподобная частица" (VLP), "вирусоподобные частицы" (VLP) или представляющая интерес VLP, относятся к молекулярным структурам, формирующимся посредством самосборки, и они содержат множество белков, содержащих по меньшей мере один представляющий интерес белок, и которые по меньшей мере по одному из свойств сходны с вирусом. Примечательно, что в отличие от вирусных частиц или вирионов, VLP не содержат геномных нуклеиновых кислот. VLP могут обладать различными мультимодальными распределениями по размерам, где на распределение по размерам можно воздействовать изменениями в способе получения. Например, распределение по размерам VLP, получаемых в растениях, может отличаться от распределения по размерам VLP, получаемых в других хозяевах. В вариантах осуществления средний диаметр VLP (например, VLP, захватываемых из растительного материала) может составлять 35 нм, 40 нм, 45 нм, 50 нм, 55 нм, 60 нм, 65 нм, 70 нм или 75 нм. В вариантах осуществления диаметр VLP, захватываемых (например, из растительного материала) способами по настоящему изобретению, находится в диапазоне от 35 нм до 75 нм; соответственно от 35 нм до 70 нм; более соответственно от 35 нм до 65 нм; еще более соответственно от 35 нм до 60 нм; особенно соответственно от 35 нм до 55 нм; еще более соответственно от 35 нм до 50 нм; еще более соответственно от 35 нм до 45 нм, наиболее соответственно от 35 нм до 40 нм.

Как применяют в настоящем документе, "смесь" содержит представляющие интерес частицы совместно с одним или несколькими материалами, которые являются нежелательными, такими как примеси или загрязнения. Термины "примесь" и "загрязнение" используют взаимозаменяемо для обозначения любого материала, отличного от представляющих интерес частиц, вне зависимости от того, происходят ли он из организма-хозяина, который желательно удалять из композиции, содержащей представляющие интерес частицы. Смесь можно получать непосредственно из организма-хозяина или клетки-хозяина, продуцирующих представляющие интерес частицы. Не предполагая ограничений, примеры смесей, которые можно обрабатывать способом по настоящему изобретению, включают сырье, материалы разрушенных клеток-хозяев, гомогенат тканей хозяина, лизат тканей хозяина, экстракт тканей хозяина, ферментационный бульон и супернатант культуры клеток-хозяев. Примеси в качестве неограничивающих примеров могут включать любые биологические макромолекулы, такие как белки, отличные от представляющих интерес белков, частицы, отличные от представляющих интерес частиц, которые могут содержать представляющий интерес белок, нуклеиновые кислоты (например, ДНК и РНК), липиды, полисахариды (например, крахмалы, целлюлоза), лигнин, фенольные смолы, углеводы и пигменты.

"Кондиционированная смесь" представляет собой смесь, полученную для этапа хроматографии, используемого в способе по изобретению, посредством подвергания смеси одному или нескольким из замены буфера, разбавления, добавления солей, титрования pH или комбинации указанного выше для установления pH, диапазона электропроводности, буферных условий или комбинации, соответственно, для достижения желаемых характеристик хроматографии. "Кондиционированная смесь" может представлять собой сырье, и ее можно использовать для стандартизированных условий загрузки на хроматографическую колонку.

Термин "представляющий интерес белок", который в настоящем документе используют взаимозаменяемо с термином "белок-мишень", относится к одному или нескольким рекомбинантно полученным белкам, которые присутствуют в представляющей интерес частице и которые можно захватывать с представляющей интерес частицей в виде несобранного белка, мультимерных форм белка или частично собранной частицы.

Термин "белок хозяина" относится к любым белкам, происходящим из клеток хозяина, продуцирующего представляющую интерес частицу(ы), содержащую белок-мишень, и включает любые белки, экспрессируемые с генома хозяина, или белки, экспрессируемые рекомбинантно и не являющиеся составляющими представляющей интерес частицы. Количество белка хозяина, присутствующее в смеси, содержащей по меньшей мере представляющие интерес частицы или представляющий интерес белок, предоставляет меру степени чистоты. Как правило, количество белка хозяина в смеси белков выражают в миллионных долях относительно количества представляющих интерес частиц или представляющего интерес белка в смеси.

Термин "захват" и его грамматические вариации используют в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения удержания или скапливания представляющих интерес частиц из смеси, приводящих к более высокой концентрации представляющих интерес частиц, чем концентрация в смеси. Захват представляющих интерес частиц из смеси может быть неполным. Захваченные представляющие интерес частицы могут представлять собой фракцию всех представляющих интерес частиц в смеси, такую как, но без ограничения, приблизительно 2%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% или 90% или более.

Термины "чистота" и "изолят" и их грамматические вариации используют для обозначения отделения или удаления, полностью или частично, по меньшей мере одной примеси из смеси, что таким обр