Очищенный экстракт, выделенный из pseudolysimachion rotundum var subintegrum, с высоким содержанием активного ингредиента, его получение и композиция, содержащая указанный экстракт в качестве активного ингредиента, для предотвращения или лечения воспаления, аллергии и астмы

Очищенный экстракт, выделенный из pseudolysimachion rotundum var subintegrum, с высоким содержанием активного ингредиента, его получение и композиция, содержащая указанный экстракт в качестве активного ингредиента, для предотвращения или лечения воспаления, аллергии и астмы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

[1] Настоящее изобретение относится к очищенному экстракту, выделенному из Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, содержащему большое количество активного ингредиента, его получению и композиции, содержащей указанный экстракт в качестве активного ингредиента, для предотвращения или лечения воспаления, аллергии и астмы.

Уровень техники

[2] В целом, воспалительная реакция является нормальной реакцией человеческого организма, вызванной отеком, болью и т.д., в том случае, если произошло какое-либо проникновение в ткань или клетку, которое вызывало некоторые органические изменения в данной ткани или клетке. Недавно было установлено, что в патогенез воспалительного заболевания вовлечены различные виды цитокинов.

[3] Аллергические реакции могут быть разделены на четыре категории, а именно на реакции I, II, III и IV типа в соответствии с разновидностями ответов, или на две категории, а именно на аллергическую реакцию немедленного типа, такого как тип I, II или III, и аллергическую реакцию замедленного типа, такого как тип IV, в соответствии с продолжительностью периода времени, прошедшего с момента повторной сенсибилизации, вызванной аллергеном, до времени начала реакции.

[4] Из всех перечисленных аллергических реакций аллергия I типа, которая протекает с участием антител IgE и называется аллергией анафилактического типа, вызывает бронхиальную астму, атопические заболевания, такие как дерматит или гастроэнтерит и т.д., аллергический ринит, такой как сенная лихорадка, аллергический конъюнктивит, пищевую аллергию и тому подобное.

[5]

[6] Астма считается сложным синдромом, поражающим дыхательные пути, который характеризуется различными клиническими симптомами, например кашлем, одышкой, вызванной обструкцией дыхательных путей, острым или хроническим воспалением дыхательных путей, гиперчувствительностью дыхательных путей (AHR) и их структурной перестройкой, и может поддаваться обратимому или необратимому излечению. В большинстве случаев астма представляет собой аллергическое заболевание и характеризуется хроническим воспалением дыхательных путей и гиперчувствительностью бронхов (Minoguchi К. and Adachi М., Pathophysiology of asthma. In: Cherniack NS, Altose MD, Homma I. editors. Rehabilitation of the patient with respiratory disease. New York: McGraw-Hill, 1999, pp.97-104).

[7]

[8] Астма может быть разделена на два типа, а именно на приобретенную бронхиальную астму и эндогенную бронхиальную астму. Приобретенная астма вызывается воздействием антигена и имеет положительную реакцию при аллергической кожной пробе или бронхопровокационном аллерготесте на антиген. В целом, снижается возраст, при котором начинает развиваться это заболевание. Такой тип астмы в основном вызывается клещами домашней пыли из рода Dermatophagoides, пыльцой, эпителием животных, грибками и т.п. Эндогенная астма вызывается инфекциями верхних дыхательных путей, физическим упражнением, эмоциональной неустойчивостью, изменением климата и влажности и наиболее распространена у взрослых пациентов. Помимо этого при приобретенной астме комплекс IgE-антиген можно обнаружить с помощью аллергической кожной пробы вследствие увеличения уровня IgE в сыворотке крови.

[9]

[10] С точки зрения патофизиологии астма рассматривается как хроническое воспаление, обусловленное Т-хелперами 2 типа (Th2), и различные медиаторы воспаления, такие как цитокины, хемокины, сигнальные молекулы, молекулы адгезии и факторы роста, иммунные клетки и структурные клетки в дыхательных путях, участвуют в различных стадиях патогенеза астмы (Elias JA et al., J Clin Invest., 111, pp. 291-7, 2003). Активированные воспалительные клетки, такие как эозинофилы, тучные клетки, альвеолярные макрофаги и т.д., в бронхах пациентов, страдающих астмой, высвобождают различные медиаторы воспаления, такие как содержащие цистеин лейкотриены, простагландины и т.д., и принимают участие в мощном сужении бронхов (Maggi Е., Immunotechnology 3, рр.233-244, 1998; Pawankar R. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 1, pp.3-6, 2001; Barnes PJ et al., Phamacol. Rev. 50, pp.515-596, 1998).

[11] Соответственно, ввиду того, что выработка различных цитокинов, участвующих в активации воспалительных клеток, таких как ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13 и т.д. и IgE, и выработка цистеинсодержащих лейкотриенов, которые высвобождаются из воспалительных клеток, являются основными причинами воспаления, аллергической реакции и астмы, вплоть до настоящего времени проводились активные исследования этих соединений, направленные на разработку агентов, ингибирующих их выработку.

[12] Авторы настоящего изобретения сосредоточили свои усилия на разработке сильного терапевтического агента, полученного безопасно и эффективно из природных ресурсов, таких как растения, животные и т.д., где указанный терапевтический агент обладает сильной ингибиторной активностью в отношении выработки воспалительных клеток, и, наконец, обнаружили, что экстракт Pseudolysimachion longifolium продемонстрировал сильную противовоспалительную, противоаллергическую и противоастматическую активность (патент Кореи №10-860080), и различные соединения, выделенные из указанного экстракта, такие как верпрозид (6-O-3,4-дигидроксибензоилкаталпол), пикрозид II (6-O-4-гидрокси-3-метоксибензоилкаталпол), верминозид (6-O-3,4-дигидроксициннамоилкаталпол), 6-О-вератроилкаталпол (6-O-3,4-диметоксибензоилкаталпол), минекозид (6-O-3-гидрокси-4-метоксициннамоилкаталпол), каталпол и т.п., также продемонстрировали сильную противовоспалительную, противоаллергическую и противоастматическую активность (публикация заявки на патент Кореи №10-2006-125499).

[13] Тем не менее, при массовом производстве и промышленном применении экстракта Pseudolysimachion longifolium возникает ряд трудностей, поскольку растительный экстракт содержит очень небольшое количество активных ингредиентов, таких как производные каталпола.

[14] Pseudolysimachion rotundum var subintegrum представляет собой многолетнее травянистое растение, распространенное в Корее, Китае, Японии, на острове Сахалин и в России.

[15] Основываясь на результатах предыдущих исследований, направленных на изучение противовоспалительной, противоаллергической и противоастматической активности экстракта Pseudolysimachion longifolium, раскрытого в патенте Кореи №10-860080, авторы настоящего изобретения предприняли попытку разработать более эффективный способ получения более сильных и более концентрированных ингредиентов, демонстрирующих противовоспалительную, противоаллергическую и противоастматическую активность, выделенных из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum.

[16] Однако сообщения или описания эффективного способа получения более сильных и более концентрированных ингредиентов, демонстрирующих противовоспалительную, противоаллергическую и противоастматическую активность, выделенных из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, в сравнении со способами, раскрытыми в приведенных выше литературных источниках, принципы изобретения которых включены в настоящую заявку посредством ссылки, отсутствовали.

[17] В связи с этим авторы настоящего изобретения обнаружили новый пригодный к применению в промышленности способ получения очищенного экстракта, содержащего большее количество активных ингредиентов, таких как производные каталпола, из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, при этом указанный очищенный экстракт продемонстрировал более сильную противовоспалительную, противоаллергическую и противоастматическую активность, чем экстракт, полученный с помощью стандартного способа получения, раскрытого в уровне техники, согласно результатам различных исследований в условиях in vivo, таких как исследование ингибирования выработки эозинофилов, высвобождения иммуноглобулина и воспалительных хемокинов в плазму крови и бронхоальвеолярную жидкость, а также исследование подавления гиперчувствительности дыхательных путей и гиперплазии бокаловидных клеток в ОВА-сенсибилизированной/иммунизированной модели на мышах.

[18]

Сущность изобретения

Техническая задача

[19] В настоящем изобретении предложен новый способ получения очищенного экстракта, содержащего большое количество активных ингредиентов, таких как производные каталпола, из Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, и экстракт, полученный в соответствии с указанным способом.

[20] В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция и диетический пищевой продукт, содержащий в качестве активного ингредиента указанный очищенный экстракт, содержащий большое количество активных ингредиентов, таких как производные каталпола из Pseudolysimachion rotundum var subintegrum в качестве активного ингредиента, в количестве, эффективном для лечения и профилактики воспалительных, аллергических или астматических заболеваний.

[21]

[22] В настоящем изобретении также предложено применение указанного очищенного экстракта, содержащего большое количество активных ингредиентов, таких как производные каталпола, из Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, демонстрирующих противовоспалительную, противоаллергическую и противоастматическую активность.

[23]

[24] В настоящем изобретении также предложен способ лечения или предотвращения воспалительного, аллергического или астматического заболевания у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества указанного очищенного экстракта, содержащего большое количество активных ингредиентов, таких как производные каталпола, из Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, совместно с фармацевтически приемлемым носителем.

[25]

Решение задачи

[26] Соответственно, задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы обеспечить новый очищенный экстракт, содержащий большое количество производных каталпола, выделенный из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum.

[27] В настоящем документе термин «производные каталпола» включает верпрозид, каталпозид, пикрозид II, изованиллоилкаталпол, 6-О-вератроилкаталпол и т.д.

[28] В настоящем документе термин «Pseudolysimachion rotundum var subintegrum» включает культивированное или выращенное в природных условиях растение и коммерчески доступное растение, но не ограничивается такими растениями, описанными в настоящем документе.

[29] В настоящем документе термин «новый очищенный экстракт» включает: (а) очищенный экстракт, фракционированный с использованием бутанола (в дальнейшем обозначенный как «ATC1»), и (b) очищенный экстракт после вторичного фракционирования (в дальнейшем обозначенный как «АТС2»).

[30] В частности, термин «очищенный экстракт, фракционированный с использованием бутанола (ATC1)», характеризуется содержанием 15-50% (мас./мас.) верпрозида, 0,3-10% (мас./мас.) вератровой кислоты, 0,5-10% (мас./мас.) каталпозида, 0,3-10% (мас./мас.) пикрозида II, 0,3-10% (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 0,3-10% (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола в расчете на общую массу экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum; предпочтительно 20-25% (мас./мас.) верпрозида, 0,5-5% (мас./мас.) вератровой кислоты, 1-5% (мас./мас.) каталпозида, 0,5-5% (мас./мас.) пикрозида II, 0,5-5% (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 1-5% (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола в расчете на общую массу экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum;

[31] или характеризуется содержанием производных каталпола 12,3-47% (мас./мас.) в общем экстракте (100%) из Pseudolysimachion rotundum var subintegrum и относительным смешанным отношением (мас./мас.) каждого из производных каталпола, составляющим 15,0-18,0 (мас./мас.) верпрозида, 2,10-2,60 (мас./мас.) каталпозида, 1 (мас./мас.) пикрозида II, 1,00-1,30 (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 2,00-2,30 (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола; предпочтительно 16,0-17,0 (мас./мас.) верпрозида, 2,20-2,50 (мас./мас.) каталпозида, 1 (мас./мас.) пикрозида II, 1,10-1,20 (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 2,10-2,20 (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола; более предпочтительно 16,20-16,99 (мас./мас.) верпрозида, 2,40-2,45 (мас./мас.) каталпозида, 1 (мас./мас.) пикрозида II, 1,10-1,19 (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 2,10-2,19 (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола.

[32] Более конкретно термин «очищенный экстракт, фракционированный с использованием бутанола (ATC1)» характеризуется тем, что указанный экстракт получают способом, согласно которому: добавляют по меньшей мере один экстрагирующий растворитель, выбранный из воды, C1-С4-низшего спирта, такого как метанол, этанол, бутанол и т.д. или их смеси, предпочтительно смесь воды и этанола, более предпочтительно 30-80 (мас./мас.) этанола в воде, к высушенному Pseudolysimachion rotundum var subintegrum на 1-м этапе; экстрагируют по меньшей мере одним способом экстракции, выбранным из экстракции горячей водой с обратным холодильником, экстракции холодной водой, экстракции ультразвуком или обычной экстракции, предпочтительно экстрагируют холодной водой с последующей экстракцией с обратным холодильником при температуре в диапазоне от 10 до 100°C, предпочтительно от 20 до 90°C, в течение периода от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 часов до 48 часов, более предпочтительно экстрагируют холодной водой при температуре в диапазоне от 10 до 60°C, предпочтительно от 20 до 50°C, в течение периода от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 часов до 48 часов, с последующей экстракцией с обратным холодильником при температуре от 40 до 120°C, предпочтительно от 60 до 90°C, в течение периода от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 часов до 48 часов, повторяют указанные этапы, чтобы получить указанный 1-й экстракт на 2-м этапе; суспендируют указанный 1-й экстракт в приблизительно 0,5-10-кратном объеме (об./об.), предпочтительно в приблизительно 1-5-кратном объеме (об./об.), воды с получением суспендированного экстракта на 3-м этапе; и добавляют приблизительно 0,5-20-кратный объем (об./об.), предпочтительно приблизительно 1-10-кратный объем (об./об.), бутанола, фракционируют в водном слое и бутанольном слое и собирают бутанольный слой с получением указанного очищенного экстракта, фракционированного с использованием бутанола (ATC1), содержащего 15-50% (мас./мас.) верпрозида, 0,3-10% (мас./мас.) вератровой кислоты, 0,5-10% (мас./мас.) каталпозида, 0,3-10% (мас./мас.) пикрозида II, 0,3-10% (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 0,3-10% (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола в расчете на общую массу экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, для лечения и предотвращения воспалительного, аллергического или астматического заболевания.

[33] Соответственно, в другом варианте реализации, настоящее изобретение также относится к способу получения указанного очищенного экстракта, фракционированного с использованием бутанола (ATC1), выделенного из Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, согласно которому: добавляют по меньшей мере один экстрагирующий растворитель, выбранный из воды, C1-С4-низшего спирта, такого как метанол, этанол, бутанол и т.д. или их смеси, предпочтительно смесь воды и этанола, более предпочтительно 30-80 (мас./мас.) этанола в воде, к высушенному Pseudolysimachion rotundum var subintegrum на 1-м этапе; экстрагируют по меньшей мере одним способом экстракции, выбранным из экстракции горячей водой с обратным холодильником, экстракции холодной водой, экстракции ультразвуком или обычной экстракции, предпочтительно экстрагируют холодной водой с последующей экстракцией с обратным холодильником при температуре в диапазоне от 10 до 100°C, предпочтительно от 20 до 90°C, в течение периода от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 часов до 48 часов, более предпочтительно экстрагируют холодной водой при температуре в диапазоне от 10 до 60°C, предпочтительно от 20 до 50°C, в течение периода от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 часов до 48 часов, с последующей экстракцией с обратным холодильником при температуре от 40 до 120°C, предпочтительно от 60 до 90°C, в течение периода от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 часов до 48 часов, повторяют указанные этапы, чтобы получить указанный 1-й экстракт на 2-м этапе; суспендируют указанный 1-й экстракт в приблизительно 0,5-10-кратном объеме (об./об.), предпочтительно в приблизительно 1-5-кратном объеме (об./об.), воды с получением суспендированного экстракта на 3-м этапе; и добавляют приблизительно 0,5-20-кратный объем (об./об.), предпочтительно приблизительно 1-10-кратный объем (об./об.), бутанола, фракционируют в водном слое и бутанольном слое и собирают бутанольный слой с получением указанного очищенного экстракта, фракционированного с использованием бутанола (ATC1), содержащего 15-50% (мас./мас.) верпрозида, 0,3-10% (мас./мас.) вератровой кислоты, 0,5-10% (мас./мас.) каталпозида, 0,3-10% (мас./мас.) пикрозида II, 0,3-10% (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 0,3-10% (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола в расчете на общую массу экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, для лечения и предотвращения воспалительного, аллергического или астматического заболевания.

[34]

[35] В частности, термин «очищенный экстракт после вторичного фракционирования (АТС2)» характеризуется содержанием 30-60% (мас./мас.) верпрозида, 0,5-10% (мас./мас.) вератровой кислоты, 2-20% (мас./мас.) каталпозида, 1-10% (мас./мас.) пикрозида II, 1-10% (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 2-20% (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола в расчете на общую массу экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum; предпочтительно 40-50% (мас./мас.) верпрозида, 1-5% (мас./мас.) вератровой кислоты, 3-10% (мас./мас.) каталпозида, 2-5% (мас./мас.) пикрозида II, 2-8% (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 3-8% (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола в расчете на общую массу экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum;

[36] или характеризуется содержанием 36,5-91% (мас./мас.) производных каталпола в общем экстракте (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum и относительным смешанным отношением (мас./мас.) каждого из производных каталпола, составляющим 13,0-16,0 (мас./мас.) верпрозида, 2,20-2,50 (мас./мас.) каталпозида, 1 (мас./мас.) пикрозида II, 1,10-1,40 (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 2,00-2,20 (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола; предпочтительно 14,0-15,0 (мас./мас.) верпрозида, 2,30-2,45 (мас./мас.) каталпозида, 1 (мас./мас.) пикрозида II, 1,20-1,35 (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 2,00-2,10 (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола; более предпочтительно 14,50-14,99 (мас./мас.) верпрозида, 2,35-2,43 (мас./мас.) каталпозида, 1 (мас./мас.) пикрозида II, 1,25-1,34 (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 2,01-2,09 (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола.

[37] Более конкретно, термин «очищенный экстракт после вторичного фракционирования (АТС2)» характеризуется тем, что в соответствии со способом его получения: добавляют по меньшей мере один экстрагирующий растворитель, выбранный из воды, С1-С4-низшего спирта, такого как метанол, этанол, бутанол и т.д. или их смеси, предпочтительно смесь воды и этанола, более предпочтительно 30-80% (мас./мас.) этанола в воде, к высушенному Pseudolysimachion rotundum var subintegrum на 1-м этапе; экстрагируют по меньшей мере одним способом экстракции, выбранным из экстракции горячей водой с обратным холодильником, экстракции холодной водой, экстракции ультразвуком или обычной экстракции, предпочтительно экстрагируют холодной водой с последующей экстракцией с обратным холодильником при температуре в диапазоне от 10 до 100°C, предпочтительно от 20 до 90°C, в течение периода от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 часов до 48 часов, более предпочтительно экстрагируют холодной водой при температуре в диапазоне от 10 до 60°C, предпочтительно от 20 до 50°C, в течение периода от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 часов до 48 часов, с последующей экстракцией с обратным холодильником при температуре от 40 до 120°C, предпочтительно от 60 до 90°C, в течение периода от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 часов до 48 часов, повторяют указанные этапы, чтобы получить указанный 1-й экстракт на 2-м этапе; суспендируют указанный 1-й экстракт в приблизительно 0,5-10-кратном объеме (об./об.), предпочтительно в приблизительно 1-5-кратном объеме (об./об.), воды с получением суспендированного экстракта на 3-м этапе; добавляют приблизительно 0,5-20-кратный объем (об./об.), предпочтительно приблизительно 1-10-кратный объем (об./об.), бутанола, фракционируют в водном слое и бутанольном слое и собирают бутанольный слой с получением указанного очищенного экстракта, фракционированного с использованием бутанола (ATC1), на 3-м этапе; и очищают указанный очищенный экстракт, фракционированный с использованием бутанола (ATC1), по меньшей мере одним способом очистки, выбранным из группы, состоящей из распределительной хроматографии с обращенной фазой, распределительной хроматографии с нормальной фазой, ионообменной хроматографии и гель-проникающей хроматографии, чтобы получить указанный очищенный экстракт после вторичного фракционирования (АТС2), содержащий 30-60% (мас./мас.) верпрозида, 0,5-10% (мас./мас.) вератровой кислоты, 2-20% (мас./мас.) каталпозида, 1-10% (мас./мас.) пикрозида II, 1-10% (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 2-20% (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола в расчете на общую массу экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, для лечения и предотвращения воспалительного, аллергического или астматического заболевания.

[38] Соответственно, в другом варианте реализации, настоящее изобретение также относится к способу получения указанного очищенного экстракта после вторичного фракционирования (АТС2), выделенного из Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, в соответствии с которым: добавляют по меньшей мере один экстрагирующий растворитель, выбранный из воды, C1-С4-низшего спирта, такого как метанол, этанол, бутанол и т.д. или их смеси, предпочтительно смесь воды и этанола, более предпочтительно 30-80% (мас./мас.) этанола в воде, к высушенному Pseudolysimachion rotundum var subintegrum на 1-м этапе; экстрагируют по меньшей мере одним способом экстракции, выбранным из экстракции горячей водой с обратным холодильником, экстракции холодной водой, экстракции ультразвуком или обычной экстракции, предпочтительно экстрагируют холодной водой с последующей экстракцией с обратным холодильником при температуре в диапазоне от 10 до 100°C, предпочтительно от 20 до 90°C, в течение периода от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 часов до 48 часов, более предпочтительно экстрагируют холодной водой при температуре в диапазоне от 10 до 60°C, предпочтительно от 20 до 50°C, в течение периода от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 часов до 48 часов, с последующей экстракцией с обратным холодильником при температуре от 40 до 120°C, предпочтительно от 60 до 90°C, в течение периода от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 часов до 48 часов, повторяют указанные этапы, чтобы получить указанный 1-й экстракт на 2-м этапе; суспендируют указанный 1-й экстракт в приблизительно 0,5-10-кратном объеме (об./об.), предпочтительно в приблизительно 1-5-кратном объеме (об./об.), воды с получением суспендированного экстракта на 3-м этапе; добавляют приблизительно 0,5-20-кратный объем (об./об.), предпочтительно приблизительно 1-10-кратный объем (об./об.), бутанола, фракционируют в водном слое и бутанольном слое, и собирают бутанольный слой с получением указанного очищенного экстракта, фракционированного с использованием бутанола (ATC1), на 3-м этапе; и очищают указанный очищенный экстракт, фракционированный с использованием бутанола (ATC1), по меньшей мере одним способом очистки, выбранным из группы, состоящей из распределительной хроматографии с обращенной фазой, распределительной хроматографии с нормальной фазой, ионообменной хроматографии и гель-проникающей хроматографии, с получением указанного очищенного экстракта после вторичного фракционирования (АТС2), содержащего 30-60% (мас./мас.) верпрозида, 0,5-10% (мас./мас.) вератровой кислоты, 2-20% (мас./мас.) каталпозида, 1-10% (мас./мас.) пикрозида II, 1-10% (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 2-20% (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола в расчете на общую массу экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, для лечения и предотвращения воспалительного, аллергического или астматического заболевания.

[39]

[40] В частности, термин «дополнительный способ очистки» выбран из (i) распределительной хроматографии с обращенной фазой, (ii) распределительной хроматографии с нормальной фазой, (iii) ионообменной хроматографии или (iv) гель-проникающей хроматографии, предпочтительно распределительной хроматографии с обращенной фазой или любого хроматографического метода, в котором в качестве неподвижной фазы используется любая смола, которая может удерживать неполярное вещество во время элюирования полярного вещества, например смола сефадекс, такая как сефадекс, сефадекс LH20, сефадекс G-25, сефадекс G-10, сефароза, супердекс, метилакрилатная смола, карбоксиметилцеллюлоза, сульфопропилцеллюлоза, карбоксиметилсефадекс, сульфопропилсефадекс, карбоксиметилсефароза, сульфопропилсефароза и т.п.; смола на основе обратного полимера, в которой используется сополимер стирола и дивинилбензола, такой как полимер X, НР20, полимер PPvP-h1 и т.п., или смола-носитель на основе метакрилата и т.д.; стандартный силикагель, такой как продукт ВРС (хроматография на неподвижной фазе), продукт диоксида кремния, закупленный у YMC Co. Ltd., продукт диоксида кремния, закупленный у DAISO Co. Ltd., продукт диоксида кремния, закупленный у ASAHI Co. Ltd., продукт диоксида кремния, закупленный у COSMOSYL Co. Ltd., и т.п.; продукт октадецилсиликагеля, использованный в качестве наполнителя для ВЭЖХ, такой как продукт октадецилсиликагеля, закупленный у YMC Co. Ltd., продукт октадецилсиликагеля, закупленный у DAISO Co. Ltd., продукт октадецилсиликагеля, закупленный у ASAHI Со. Ltd., продукт октадецилсиликагеля, закупленный у СНЕМСО Co. Ltd., продукт октадецилсиликагеля, закупленный у Merck Co. Ltd., продукт октадецилсиликагеля, закупленный у COSMOSYL Co. Ltd., продукт октадецилсиликагеля, закупленный у FUJI Co. Ltd., и т.п.

[41]

[42] В предпочтительном варианте реализации, в соответствии с которым в качестве дополнительного процесса очистки согласно настоящему изобретению используется (i) распределительная хроматография с обращенной фазой, «неподвижная фаза вышеописанной распределительной хроматографии с обращенной фазой» может представлять собой любые неподвижные фазы, например, неподвижной фазой может быть вещество, используемое в качестве обращенной фазы, которое может удерживать неполярное вещество во время элюирования полярного вещества, предпочтительно неподвижная фаза на основе силикагеля, неподвижная фаза на основе полимера, такого как полистирол и т.д., и т.п., более предпочтительно неподвижная фаза на основе производных силикагеля, таких как С2, С4, С6, С8, C10, С12, С14, С16, С18 и т.п.; или неподвижная фаза на основе полимера, такого как PS-2, Oasis HLB и т.п., более предпочтительно в качестве обращенной фазы используют силикагель (C18(IV)-D), продукт ODS-A/ODS-AQ от YMC Co. Ltd., продукт SP-C-ODS от СНЕМСО Co. Ltd., продукт SP-ODS-RPS от DAISO Co. Ltd., продукт 5C18 от COSMOSYL Co. Ltd., продукт Chromatorex от FUJI Co. Ltd. и т.д.

[43] В предпочтительном варианте реализации, в соответствии с которым в качестве дополнительного способа очистки согласно настоящему изобретению используется (i) распределительная хроматография с обращенной фазой, «подвижная фаза в вышеописанной (i) распределительной хроматографии с обращенной фазой» может представлять собой по меньшей мере один растворитель, выбранный из воды, ацетонитрила, низшего спирта, такого как метанол, этанол, бутанол и т.д., тетрагидрофурана (ТГФ) или его смеси, предпочтительно представляет собой воду, низший спирт, такой как метанол, этанол, бутанол и т.д., или их смесь, более предпочтительно смесь из растворителей воды и метанола, более предпочтительно смесь из растворителей воды и метанола в соотношении от 90:10 (об./об.) до 60:40 (об./об.), для элюирования полярного вещества.

[44] В предпочтительном варианте реализации, в соответствии с которым в качестве дополнительного способа очистки согласно настоящему изобретению используется (ii) распределительная хроматография с нормальной фазой, «неподвижная фаза в вышеописанной распределительной хроматографии с нормальной фазой» может представлять собой любые неподвижные фазы, например, в качестве неподвижной фазы можно использовать вещество с нормальной фазой, которое может задерживать полярное вещество во время элюирования неполярного вещества, предпочтительно может быть использована неподвижная фаза на основе силикагеля, Fluorosyl^® или глинозема, или неподвижная фаза на основе полимера, содержащего фрагменты -CN, диол, -NH₂, и т.п., более предпочтительно неподвижная фаза на основе силикагеля, Fluorosyl^® или глинозема и т.д.

[45] В предпочтительном варианте реализации, в соответствии с которым в качестве дополнительного способа очистки согласно настоящему изобретению используется распределительная хроматография с нормальной фазой (ii), «подвижная фаза в вышеописанной (ii) распределительной хроматографии с нормально фазой» может представлять собой по меньшей мере один растворитель, выбранный из гексана, гептана, этилацетата, этанола, диэтилового эфира, 2-пропанола или их смеси, предпочтительно гексан, гептан, этилацетат или их смесь, для элюирования неполярного вещества.

[46]

[47] В предпочтительном варианте реализации, в соответствии с которым в качестве дополнительного способа очистки согласно настоящему изобретению используется (iii) ионообменная хроматография, «неподвижная фаза в вышеописанной (iii) ионообменной хроматографии» может представлять собой любые высокомолекулярные неподвижные фазы, которые содержат заряженный сшивающий фрагмент, предпочтительно катионообменную смолу, анионообменную смолу или синтетический адсорбент и т.п., более предпочтительно сильно кислую катионообменную смолу, такую как Amberlite IR-120, Dowex 60W-x8, SKIB и т.д.; слабокислую катионообменную смолу, такую как Amberlite IRA-67, Dowex 3-х4А и т.д.; сильно основную катионообменную смолу, такую как DIAION SKIB, DIAION РК216, DIAJON CR20, DIAION UBK555 (Mitsubishi Chemical Co.), TRILITE SPC 160H, TRILITE SPC 180H, TRILITE SPC 400JH (Samyang Co. Ltd.), AMBERLITE 200C Na, AMBERLITE CG50, AMBERLITE CR1310 Na, AMBERJET 200H, AMBERLYST 131 WET, ALBERLYST 232 WET (ROHM и HAAS Co. Ltd.), Lewatit VP ОС 1800, Lewatit VP ОС 1812, Lewatit MDS1368 Na, Lewaitit K1221 (Bayer Co. Ltd.), PUROLITE PCR833CA, PUROLITE C145 (Purolite Co. Ltd.), MFG210, MFG 250 (Finex Co. Ltd.) и т.д.; сильно основную анионообменную смолу, такую как SA11A, SA20A, SA21A и т.д.; или CaptoQ (GE Healthcare Co. Ltd.), или смолу, обладающую аналогичными свойствами, такую как Toyopearl QEA (Tosoh Co. Ltd.), Q Sepharose FF (GE Healthcare Co. Ltd.), Fractogel EMD, Fractogel TMAE, Fractogel HICAP (Merck KGaA Co. Ltd или Darmstadt Co. Ltd.); более предпочтительно SA21A; адсорбент, такой как SP207, HP20SS, НР20 и т.д., более предпочтительно НР20.

[48]

[49] В предпочтительном варианте реализации, в соответствии с которым в качестве дополнительного способа очистки согласно настоящему изобретению используется (iv) гель-проникающая хроматография, «неподвижная фаза в вышеописанной (iv) гель-проникающей хроматографии» может представлять собой неподвижные фазы на основе любого типа геля, который может осуществлять разделение в зависимости от размера образца, предпочтительно гель на основе декстрана, такой как сефадекс (например, сефадекс G-25), гель на основе полиакриламида, такой как сефакрил (например, сефакрил-S400), гель на основе агарозы, такой как супероза или сефароза (например, сефароза CL-4 В), или их комбинации, такие как супердекс 200, комбинированный декстран (например, Sephadex™) или сшитый агарозный гель (Superose™) и т.п., однако подходящие гели не ограничиваются теми, которые перечислены в настоящем документе. «Подвижная фаза в вышеописанной (iv) гель-проникающей хроматографии» может представлять собой буферный раствор, выбранный из группы, состоящей из натрий-ацетатного буфера, натрий-фосфатного буфера, аммоний-ацетатного буфера, MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты), Бис-Трис [2-бис(2-гидроксиэтил)амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиола], ADA (N-(2-ацетамидо)иминодиацетата), PIPES [пипераксин-N,N'-бис(2-этансульфоновой кислоты)], BES (N,N'-бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновой кислоты), MOPS [3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты)], TES (N-трис(гидроксиметил)метил-2-аминоэтансульфоновой кислоты), HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты) и т.п.; предпочтительно натрий-ацетатный буфер, натрий-фосфатный буфер или аммоний-ацетатный буфер.

[50]

[51] В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения, в дополнение к (i) распределительной хроматографии с обращенной фазой, (ii) распределительной хроматографии с нормальной фазой, (iii) ионообменной хроматографии, (iv) гель-проникающей хроматографии или их комбинации, может быть проведена (v) гель-проникающая хроматография или гель-фильтрационная хроматография в качестве еще одного способа очистки, раскрытого в настоящем документе.

[52]

[53] В настоящем изобретении также предложен новый очищенный экстракт, такой как (а) очищенный экстракт, фракционированный с использованием бутанола (в дальнейшем обозначенный как «ATC1»), или (b) очищенный экстракт после вторичного фракционирования (в дальнейшем обозначенный как «АТС2»), полученный в соответствии со способами получения, описанными выше.

[54] В настоящем изобретении также предложен новый очищенный экстракт, фракционированный с использованием бутанола (ATC1) из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, полученный в соответствии со способами получения, описанными выше, который содержит 12,3-47% (мас./мас.) производных каталпола в общем экстракте (100%) из Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, при этом указанные производные каталпола состоят из 15-50% (мас./мас.) верпрозида, 0,3-10% (мас./мас.) вератровой кислоты, 0,5-10% (мас./мас.) каталпозида, 0,3-10% (мас./мас.) пикрозида II, 0,3-10% (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 0,3-10% (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола, предпочтительно 20-25% (мас./мас.) верпрозида, 0,5-5% (мас./мас.) вератровой кислоты, 1-5% (мас./мас.) каталпозида, 0,5-5% (мас./мас.) пикрозида II, 0,5-5% (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 1-5% (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола в расчете на общую массу экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum.

[55]

[56] В настоящем изобретении также предложен новый очищенный экстракт, фракционированный с использованием бутанола (ATC1) из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, полученный в соответствии со способами получения, описанными выше, который характеризуется относительным смешанным отношением (мас./мас.) каждого из производных каталпола, составляющим 15,0-18,0 (мас./мас.) верпрозида, 2,10-2,60 (мас./мас.) каталпозида, 1 (мас./мас.) пикрозида II, 1,00-1,30 (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 2,00-2,30 (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола; предпочтительно 16,0-17,0 (мас./мас.) верпрозида, 2,20-2,50 (мас./мас.) каталпозида, 1 (мас./мас.) пикрозида II, 1,10-1,20 (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 2,10-2,20 (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола; более предпочтительно 16,20-16,99 (мас./мас.) верпрозида, 2,40-2,45 (мас./мас.) каталпозида, 1 (мас./мас.) пикрозида II, 1,10-1,19 (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 2,10-2,19 (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола.

[57]

[58] В настоящем изобретении также предложен новый очищенный экстракт после вторичного фракционирования (АТС2) из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, полученный в соответствии со способами получения, описанными выше, который содержит 36,5-91% (мас./мас.) производных каталпола в общем экстракте (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, при этом указанные производные каталпола состоят из 30-60% (мас./мас.) верпрозида, 0,5-10% (мас./мас.) вератровой кислоты, 2-20% (мас./мас.) каталпозида, 1-10% (мас./мас.) пикрозида II, 1-10% (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 2-20% (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола в расчете на общую массу экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum; предпочтительно 40-50% (мас./мас.) верпрозида, 1-5% (мас./мас.) вератровой кислоты, 3-10% (мас./мас.) каталпозида, 2-5% (мас./мас.) пикрозида II, 2-8% (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 3-8% (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола в расчете на общую массу экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum.

[59]

[60] В настоящем изобретении также предложен новый очищенный экстракт после вторичного фракционирования (АТС2) из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, полученный в соответствии со способами получения, описанными выше, который характеризуется относительным смешанным отношением (мас./мас.) каждого из производных каталпола, составляющим 13,0-16,0 (мас./мас.) верпрозида, 2,20-2,50 (мас./мас.) каталпозида, 1 (мас./мас.) пикрозида II, 1,10-1,40 (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 2,00-2,20 (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола; предпочтительно 14,0-15,0 (мас./мас.) верпрозида, 2,30-2,45 (мас./мас.) каталпозида, 1 (мас./мас.) пикрозида II, 1,20-1,35 (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 2,00-2,10 (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола; более предпочтительно 14,50-14,99 (мас./мас.) верпрозида, 2,35-2,43 (мас./мас.) каталпозида, 1 (мас./мас.) пикрозида II, 1,15-1,24 (мас./мас.) изованиллоилкаталпола и 2,01-2,09 (мас./мас.) 6-О-вератроилкаталпола.

[61]

[62] «Очищенный экстракт», раскрытый в настоящем документе, можно использовать в сухой форме, полученной методом вакуумного испарения, методом сублимационной сушки или методом высушивания горячим воздухом и т.д.

[63]

[64] В настоящем документе термин «воспалительное заболевание» включает экзему, атопический дерматит, конъюнктивит, пародонтоз, ринит, отит среднего уха, ларингофарингит, тонзиллит, пневмонию, язву желудка, гастрит, болезнь Крона, колит, геморрой, подагру, анкилозирующий спондилоартрит, ревматическую лихорадку, системную красную волчанку, фибромиалгию, псориатический артрит, остеоартрит, ревматоидный артрит, периартрит плеча, тендинит, тендосиновит, тендовагинит, миозит, гепатит, цистит, нефрит, синдром Шегрена, рассеянный склероз, хроническое воспалительное заболевание,