Терапевтические средства и их применение

Терапевтические средства и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в общем относится к области терапевтических средств и способов, в частности к области лечения рака предстательной железы (простаты).

Уровень техники

Упоминание и обсуждение в настоящей заявке документов, которые по-видимому опубликованы ранее, не обязательно означает признание того, что данный документ является частью предшествующего уровня техники или относится к общеизвестным познаниям.

Рак предстательной железы (простаты) в настоящее время является наиболее распространенной формой рака среди мужчин. Предстательная железа размером с грецкий орех вырабатывает жидкость, которая является компонентом спермы. Предстательная железа имеет две или больше долей или сегментов, окруженных наружным слоем ткани. Предстательная железа располагается перед прямой кишкой и чуть ниже мочевого пузыря и окружает мочеиспускательный канал.

Встречаемость рака простаты наиболее высока в северо-западной части Европы и в США. Процесс роста опухоли обычно происходит в течение длительного времени. В норме рак простаты является мягкой формой рака. Так, большинство мужчин с диагнозом рака простаты выживают, и только у меньшей части мужчин встречается более агрессивная форма рака простаты, которая дает метастазы на ранней стадии. Эта форма рака простаты поддается лечению только, если диагноз поставлен на ранней стадии, еще до того, как рак распространится на внекапсулярные ткани.

Современная диагностика и мониторинг рака простаты могут осуществляться путем измерения концентрации специфического антигена простаты (PSA) в крови у пациента. Если концентрация PSA заметно повышена при нескольких последовательных измерениях, выполненных в различные моменты времени, то существует вероятность наличия рака простаты. В этот момент может проводиться биопсия для проверки на наличие рака простаты.

Белок PSA (также известный как калликреин III) состоит из одной цепи в 237 аминокислот и вырабатывается в секреторных клетках предстательной железы. Эти секреторные клетки встречаются по всей предстательной железе. PSA является признанным и тщательно изученным маркером в отношении рака простаты. По сравнению со здоровыми клетками, уровень PSA понижен в злокачественных клетках и повышен в гиперплазированных клетках. Следовательно, это противоречит тому, что концентрация PSA повышена в крови у мужчин, страдающих раком простаты. Однако одним из объяснений может быть то, что у злокачественных клеток нарушена структура клеток, поэтому они более проницаемы для PSA.

Другой важной сериновой протеазой, которая может подойти для будущей терапии рака простаты, является железистый (или гландуллярный) калликреин 2 (hK2) человека. Кодирующий hK2 ген располагается на хромосоме 19, вместе с геном, кодирующим PSA. В основном hK2 экспрессируется в ткани предстательной железы, так же, как и PSA. В предстательной железе PSA присутствует в виде неактивной проформы и активируется под действием пептидазы hK2. Иммуногистохимические исследования в отношении hK2 показали, что hK2 экспрессируется в зависимости от уровня дифференцировки. Это означает, что hK2 экспрессируется в большей степени в слабодифференцированной ткани типа ткани, пораженной раком простаты, и в меньшей степени в сильнодифференцированной ткани типа ткани, пораженной доброкачественной гиперплазией простаты (BPH), которая является еще одним распространенным заболеванием предстательной железы.

Современные способы лечения рака простаты представлены хирургией (например, радикальная простатэктомия), лучевой терапией (включая брахитерапию и наружную лучевую терапию), сфокусированным ультразвуком высокой интенсивности (HIFU), химиотерапией и пероральными химиотерапевтическими препаратами, криохирургией (замораживание опухоли), гормональной терапией (типа антиандрогенной терапии), кастрацией или комбинацией вышеперечисленного.

Однако большая часть этих способов лечения (хирургия и наружная лучевая терапия) применима только (или преимущественно) для лечения первичных опухолей и крупных метастазов. Химиотерапия применяется при диссеминировании рака, но у большинства таких пациентов она дает лишь паллиативный эффект и/или продлевает выживание. Следовательно, необходимы другие или дополнительные способы лечения, чтобы добиться значительного улучшения при диссеминированных злокачественных заболеваниях, особенно в случае микрометастазов.

Терапия типа иммунотерапии или радиоиммунотерапии с использованием наводящих молекул типа антител и фрагментов могла бы дать возможность лечения диссеминированных заболеваний.

Таким образом, существует потребность в новых терапевтических средствах и методах для лечения рака простаты, особенно в случаях диссеминированного заболевания, метастазов и микрометастазов.

Сущность изобретения

Соответственно, настоящее изобретение направлено на смягчение, ослабление или устранение одного или нескольких из вышеприведенных недостатков в данной области поодиночке или в любой комбинации и решает по крайней мере указанные выше проблемы, предусматривая способ лечения в соответствии с прилагаемой формулой изобретения.

Первый аспект настоящего изобретения предусматривает средство, содержащее или состоящее из связывающей молекулы со специфичностью к белку калликреина, для применения при лечении рака простаты.

Иными словами, первый аспект настоящего изобретения касается применения средства, содержащего или состоящего из связывающей молекулы со специфичностью к белку калликреина, для применения при изготовлении лекарственных препаратов для лечения рака простаты.

Соответственно, первый аспект также предусматривает способ лечения рака простаты у пациентов, который включает стадию введения терапевтически эффективного количества средства, содержащего или состоящего из связывающей молекулы со специфичностью к белку калликреина.

Под "связывающей молекулой" подразумеваются все типы химических соединений (например, олигонуклеотиды, полинуклеотиды, полипептиды, пептидомиметики и небольшие соединения), которые способны специфически связываться с белком калликреина. Предпочтительно связывающая молекула способна избирательно (т.е. предпочтительно) связываться с белком калликреина в физиологических условиях.

Как указано выше, средства по изобретению могут содержать или состоять из любого подходящего химического соединения, представляющего собой связывающую молекулу со специфичностью к белку калликреина.

Методы, которые подходят для выявления взаимодействия между исследуемым химическим соединением и белком калликреина, хорошо известны в данной области. Например, можно использовать методы ультрафильтрации с масс-спектрометрией с ионизацией распылением / HPLC или другие физические и аналитические методы. Кроме того, можно использовать методы резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), в которых можно измерить связывание двух флуоресцентно меченых соединений по измерению взаимодействия флуоресцентных меток, когда они находятся в непосредственной близости друг от друга.

Альтернативные методы выявления связывания белка калликреина с такими макромолекулами, как ДНК, РНК, белки и фосфолипиды, включают метод поверхностного плазмонного резонанса, к примеру, как описано в Plant et al., 1995, Analyt Biochem. 226(2), 342-348. В таких методах могут использоваться полипептиды, помеченные, к примеру, радиоактивной или флуоресцентной меткой.

Еще один способ идентификации химических соединений, способных связываться с белком калликреина, состоит в том, что белок калликреина подвергается обработке соединением и выявляется и/или измеряется любое связывание соединения с данным белком калликреина. Можно определить константу связывания соединения с белком калликреина. Подходящие методы выявления и/или (количественного) измерения связывания соединения с белком калликреина хорошо известны специалистам и могут выполняться, к примеру, с помощью метода, подходящего для высокопроизводительной обработки, к примеру, метода на основе чипа. Новая технология, называемая VLSIPS™, позволяет производить чрезвычайно маленькие чипы, содержащие сотни тысяч и больше различных молекулярных зондов. В таких биологических чипах зонды располагаются в массивах, и каждому зонду присваивается определенное место. Уже получены такие биологические чипы, в которых каждое положение имеет размеры, к примеру, в десять микрон. Такие чипы можно использовать для определения того, что данные молекулы взаимодействуют с каким-либо зондом на чипе. После проведения взаимодействия массива с молекулами-мишениями при выбранных условиях сканирующее устройство может проверить каждое положение в массиве и определить, происходило ли взаимодействие данной молекулы с зондом в этом положении.

Другой способ идентификации соединений со сродством связывания к белку калликреина представлен дрожжевой двухгибридной системой, в которой полипептиды по изобретению могут использоваться для "захвата" тех белков, которые связываются с белком калликреина. Дрожжевая двухгибридная система описана в Fields & Song, Nature 340: 245-246 (1989).

В одном воплощении связывающая молекула может содержать или состоять из полипептида.

Например, связывающая молекула может содержать или состоять из антитела или его антиген-связывающего фрагмента со специфичностью связывания с белком калликреина, либо варианта, слитого белка или производного данного антитела или антиген-связывающего фрагмента, либо слитого белка данного варианта или производного, сохраняющего специфичность связывания с белком калликреина.

Таким образом, в одном воплощении первого аспекта настоящего изобретения, связывающей молекулой может быть антитело или его антиген-связывающий фрагмент.

Под "антителом" подразумеваются практически интактные молекулы антител, а также химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела (при этом по меньшей мере одна аминокислота подверглась мутации по сравнению с природными антителами человека), одноцепочечные антитела, диатела, биспецифичные антитела, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры тяжелых и/или легких цепей антител и их антиген-связывающие фрагменты и производные.

Под "антиген-связывающим фрагментом" подразумеваются функциональные фрагменты антител, которые способны связываться с белком калликреина. Сродство связывания различных производных антител, приведенных выше, можно определить по методу Скетчарда при фиксированной концентрации иммобилизованного фрагмента антитела и различных концентрациях индикатора Eu-PSA. С другой стороны, сродство связывания можно определить по технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе Biacore. Методы анализа дополнительно описаны в примере 8.

В частности, антиген-связывающий фрагмент выбирается из группы, состоящей из Fv-фрагментов (например, одноцепочечных Fv и связанных дисульфидной связью Fv), Fab-подобных фрагментов (например, Fab-фрагментов, Fab'-фрагментов и F(ab)₂-фрагментов), одиночных вариабельных доменов (например, доменов V_H и V_L) и доменных антител (dAbs, включая одиночные и двойные форматы [т.е. dAb-линкер-dAb]).

Есть несколько преимуществ в использовании фрагментов антител, а не целых антител. Меньшие размеры фрагментов могут приводить к улучшению фармакологических свойств типа лучшего проникновения в твердые ткани и/или более быстрого клиренса в крови, что позволит повысить терапевтическое соотношение. Кроме того, такие антиген-связывающие фрагменты антител, как Fab, Fv, scFv и dAb, могут экспрессироваться и секретироваться из микроорганизмов типа Е. coli, что позволяет легко получать большие количества таких фрагментов.

Также в рамки изобретения входят модифицированные варианты антител и их антиген-связывающих фрагментов, например, модифицированные путем ковалентного присоединения полиэтиленгликоля или другого подходящего полимера (см. ниже).

Способы получения антител и фрагментов антител хорошо известны в данной области. Например, антитела могут быть получены любым из нескольких способов, в которых применяется индукция вырабатывания молекул антител in vivo, скрининг библиотек иммуноглобулинов (Orlandi et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 3833-3837; Winter et al., 1991, Nature 349: 293-299) или получение молекул моноклональных антител в культуре клеточных линий. Они включают, без ограничения, метод гибридомы, метод гибридомы с В-клетками человека и метод гибридомы с вирусом Эпштейна-Барра (EBV) (Kohler et al., 1975, Nature 256: 495-497; Kozbor et al., 1985, J. Immunol. Methods 81: 31-42; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030; Cole et al., 1984, Mol. Cell. Biol. 62: 109-120).

Подходящие моноклональные антитела к выбранным антигенам могут быть получены по известным методикам, к примеру, изложенным в "Monoclonal Antibodies: А Manual of Techniques", H. Zola (CRC Press, 1988) и в "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J.G.R Hurrell (CRC Press, 1982).

Точно так же фрагменты антител могут быть получены хорошо известными в данной области методами (к примеру, см. Harlow & Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Например, фрагменты антител по настоящему изобретению могут быть получены путем протеолитического гидролиза антител или путем экспрессии в Е. coli или клетках млекопитающих (например, в культуре клеток яичников китайского хомячка или в других системах экспрессии белков) ДНК, кодирующей данный фрагмент. С другой стороны, фрагменты антител могут быть получены путем расщепления пепсином или папаином целых антител стандартными методами.

Специалистам в данной области известно, что для терапии или диагностики людей могут использоваться человеческие или гуманизированные антитела. Гуманизированные формы антител не человека, а других (например, мыши) представляют собой генетически сконструированные химерные антитела или фрагменты антител, содержащие минимальные участки, происходящие не из антител человека. Гуманизированные антитела включают такие антитела, у которых определяющие комплементарность участки антитела человека (реципиентного антитела) заменены остатками из определяющей комплементарность области от другого вида, чем человек (донорского антитела), как-то мыши, крысы или кролика, обладающими требуемой функциональностью. В некоторых случаях каркасные участки Fv антител человека заменяются соответствующими остатками не от человека. Гуманизированные антитела также могут содержать остатки, которые не встречаются ни в реципиентом антителе, ни в импортируемой определяющей комплементарность области или каркасных последовательностях. В общем, гуманизированные антитела обычно содержат практически все из по меньшей мере одного, а чаще двух вариабельных доменов, у которых все или практически все определяющие комплементарность участки соответствуют таковым у антитела не от человека, а все или практически все каркасные участки соответствуют таковым у соответствующей консенсусной последовательности человека. Гуманизированные антитела оптимально также содержат по меньшей мере часть константной области антител типа области Fc, которая обычно происходит из антител человека (к примеру, см. Jones et al, 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-329; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596).

Методы гуманизирования чужих антител хорошо известны в данной области. Обычно гуманизированные антитела содержат один или несколько аминокислотных остатков, введенных в них из других источников, чем человек. Эти чужие аминокислотные остатки, которые часто называют импортированными остатками, как правило, берут из импортируемого вариабельного домена. Гуманизация в основном может проводиться так, как описано (к примеру, см. Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Reichmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-15361; US 4,816,567) путем замены определяющих комплементарность участков на соответствующие определяющие комплементарность участки грызунов. Соответственно, такие гуманизированные антитела являются химерными антителами, у которых существенно меньшая часть чем интактный вариабельный домен человека заменена на соответствующую последовательность из другого вида, чем человек. На практике гуманизированные антитела, как правило, являются такими антителами человека, у которых некоторые остатки из определяющих комплементарность участков и возможно некоторые остатки из каркасных участков заменены остатками из аналогичных участков у антител грызунов.

Антитела человека также можно идентифицировать различными известными методами, в том числе библиотеки фагового дисплея (к примеру, см. Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227: 381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581; Cole et al., 1985, In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77; Boerner et al., 1991, J. Immunol. 147: 86-95).

После того, как получены подходящие антитела, их можно протестировать на активность, к примеру, методом ELISA.

В альтернативном воплощении первого аспекта изобретения, связывающая молекула содержит или состоит из неиммуноглобулиновой связывающей молекулы, например, как описано в Skerra, Curr Opin Biotechnol. 2007, 18(4): 295-304.

В другом альтернативном воплощении связывающая молекула содержит или состоит из аптамера. Например, она может содержать или состоять из пептидного аптамера или из нуклеинового аптамера (см. Hoppe-Seyler & Butz, 2000, J Mol Med. 78(8): 426-30; Bunka DH & Stockley PG, 2006, Nat Rev Microbiol. 4(8): 588-96; и Drabovich et al., 2006, Anal Chem. 78(9): 3171-8).

В еще одном альтернативном воплощении связывающая молекула содержит или состоит из небольшой химической молекулы. Такие молекулы со свойствами связывания калликреина могут быть идентифицированы путем скрининга коммерческих библиотек небольших соединений (к примеру, фирмы ChemBridge Corporation, San Diego, USA).

Соответственно, связывающая молекула, которая присутствует в средстве согласно первому аспекту настоящего изобретения, специфически связывается с белком калликреина. При этом выражение "специфически связывается" означает, что связывающая молекула избирательно связывается с намеченным белком калликреина в предпочтении к другим белкам, необязательно включая другие белки калликреина. Специалистам должны быть хорошо известны разнообразные способы оценки специфичности связывания связывающей молекулы с мишенью. Например, если связывающая молекула является антителом или на основе антитела, то ее способность к специфическому связыванию с белком калликреина можно определить методом иммуноанализа типа ELISA, радиоиммуноанализа и др.

В одном воплощении принимается, что связывающая молекула специфически связывается с белком калликреина, если она связывается с белком калликреина при иммуноанализе и/или в физиологических условиях (типа условий в предстательной железе или других участках для лечения, как изложено здесь) со сродством связывания больше чем 1×10⁵, 1×10⁶, 1×10⁷, 2×10⁷, 1×10⁸, 2×10⁸, 1×10⁹, 2×10⁹, 1×10¹⁰, 2×10¹⁰, 3×10¹⁰, 1×10¹¹ или больше, как-то в пределах от 1×10⁵ до 3×10¹⁰ или больше.

Связывающая молекула, используемая в первом аспекте настоящего изобретения, может обладать специфичностью к белку калликреина человека. Белок калликреина человека представляет собой сериновую протеазу, принадлежащую к семейству генов тканевых калликреинов человека, которое состоит из по меньшей мере 15 представителей (Hsieh ML, Cancer Res. 1997, 57: 2651-6). Калликреины являются термоустойчивыми гликопротеинами, состоящими из одной полипептидной цепи с м.в. в пределах 27-40 кДа.

Связывающая молекула, используемая в первом аспекте настоящего изобретения, может обладать специфичностью к белку калликреина, выбранному из группы, состоящей из специфического антигена простаты (PSA; hK3, калликреин-3 человека) и гландулярного калликреина человека (hK2).

В одном воплощении связывающая молекула обладает специфичностью к PSA. Термин PSA служит для обозначения всех известных форм PSA, к примеру, свободного PSA, предшественников PSA, форм PSA с внутренними разрывами, низкомолекулярного свободного PSA, свободного PSA со стандартной молекулярной массой, неактивного зрелого PSA, усеченных форм PSA, гликозилированных вариантов PSA, BPSA, неактивного про-PSA и всяческих комплексов PSA типа PSA, связанного с α1-антихимотрипсином (ACT), ингибитором α1-протеазы (API) и α2-макроглобулином (AMG). Типичная первичная аминокислотная структура PSA представлена на фиг. 14 (см. SEQ ID NO: 16).

Секретируемый из раковых клеток PSA находится в более активном состоянии, чем PSA, секретируемый из пораженной ВРН ткани. Во внеклеточной жидкости PSA может подвергаться протеолитическому расщеплению, что приводит к потере активности и образованию комплексов. Таким образом, в объем настоящего изобретения также входит введение метки в такие соединения или молекулы, как ACT, API и AMG, связанные или комплексированные с PSA.

В одном предпочтительном воплощении связывающая молекула обладает специфичностью к свободной (то есть некомплексированной) форме PSA по сравнению с комплексированной формой PSA. Связывающие молекулы со специфичностью к свободной форме PSA могут обладать специфичностью связывания к эпитопу, который экспонирован у свободной формы PSA, но не экспонирован у комплексированной формы PSA, типа конформационного (т.е. нелинейного) эпитопа. К примеру, такой конформационный эпитоп образуется из аминокислотных остатков, входящих в состав калликреиновой петли, окружающей каталитическую расщелину PSA, и может включать в себя триаду активного сайта из His41, Asn96 и Ser189. Насчет дальнейшего обсуждения и раскрытия многочисленных подходящих эпитопов на PSA см. Leinonen et al., Clinical Chemistry 48: 12, 2208-2216 (2002), которая включена сюда путем ссылки.

Если связывающая молекула, используемая в первом аспекте настоящего изобретения, обладает специфичностью к PSA, то она может конкурировать за связывание с PSA (типа свободной формы PSA) или пептидом, содержащим активный эпитоп PSA при связывании со связывающей молекулой, с антителом, выбранным из группы, состоящей из PSA30, 4D4, 5C3 и 5A10 и их антиген-связывающих фрагментов. Дальнейшее обсуждение таких антител можно найти в Pettersson et al., Clin. Chem., 41: 10, 1480-1488 (1995); Nilsson et al., Brit. J. Cancer, 75: 6, 789-797 (1997); Leinonen et al., Clinical Chemistry 48:12, 2208-2216 (2002); Väisänen et al., Anal. Chem., 78: 7809-7815 (2006); Evans-Axelsson et al., Cancer Biother. Radiopharm. 27:4, 243-51; EP 1320756 B1; и US 2004/101914, содержание которых включено сюда путем ссылки.

Аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи, входящих в состав типичного антитела 5A10 против PSA, приведены ниже (при этом последовательности CDR подчеркнуты).

Тяжелая цепь 5А10

EVQLVESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTTGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHLYWDEDKRYNPSLKSRLTISEDSSRNQVFLKITSVGPADSATYYCARKGYYGYFDYWGQGTALTVSS [SEQ ID NO: 1]

Легкая цепь 5А10

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVNTDVAWYQQKPGQSPKALIFSTSYRSSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLAEYFCQQYSNYPLTFGAGTKVDLN [SEQ ID NO: 2]

В этом контексте термин "конкурирует" означает то, что присутствие средства, содержащего связывающую молекулу, при конкурентном анализе вместе с контрольным антителом, выбранным из числа PSA30, 4D4, 5С3 и 5А10, может понизить уровень детектируемого связывания контрольного антитела с PSA (типа свободного PSA) на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или 100% (например, если средство и контрольное антитело присутствуют при тестировании в эквимолярном количестве, при этом необязательно тестирование проводится в физиологических условиях). Такой анализ может проводиться методом иммунорадиометрического анализа (IRMA), как описано в примере 9.

Если связывающая молекула, используемая в первом аспекте настоящего изобретения, обладает специфичностью к PSA, то она может содержать один или несколько определяющих комплементарность участков (CDRs) антитела, выбранного из группы, состоящей из PSA30, 4D4, 5С3 и 5А10 (которые выделены подчеркиванием выше).

Как хорошо известно в данной области, полные антитела содержат шесть CDRs, три из которых присутствуют в вариабельной области легкой (V_L) цепи, а другие три присутствуют в вариабельной области тяжелой цепи (V_H).

Связывающие молекулы не обязательно должны содержать все шесть CDRs какого-либо из этих антител для того, чтобы сохранить антиген-связывающую активность, хотя в одном воплощении связывающая молекула может содержать все шесть CDRs из антитела, выбранного из группы, состоящей из PSA30, 4D4, 5С3 и 5А10.

В качестве альтернативы связывающая молекула может содержать менее шести CDRs, как-то:

- пять CDRs (т.е. 3 CDRs из области V_H или V_L, 2 CDRs из другой вариабельной области);

- четыре CDRs (т.е. 3 CDRs из области V_H или V_L, 1 CDR из другой вариабельной области; либо по 2 CDRs из каждой из областей V_H и V_L);

- три CDRs (т.е. все 3 CDRs из одной области V_H или V_L и ни одного из другой; либо 2 CDRs из области V_H или V_L, 1 CDR из другой вариабельной области);

- два CDRs (т.е. два CDRs из одной области V_H или V_L и ни одного из другой; либо по 1 CDR из каждой из областей V_H и V_L); или

- один CDR из любой из областей V_H и V_L,

из антитела, выбранного из группы, состоящей из PSA30, 4D4, 5C3 и 5A10.

Хорошо известно, что три или меньше участков CDR (в некоторых случаях всего лишь один CDR или его часть) способны сохранять антиген-связывающую активность того антитела, из которого они происходят:

Laune et al. (1997), JBC, 272: 30937-44 - показано, что целый ряд гексапептидов, полученных из CDR, проявляют антиген-связывающую активность (см. реферат), и отмечено, что синтетические пептиды из полного одиночного CDR проявляют сильную связывающую активность (см. стр. 30942, правая колонка);

Monnet et al. (1999) JBC, 274: 3789-96 - показано, что целый ряд 12-мерных пептидов и связанных с ними каркасных участков обладают антиген-связывающей активностью (см. реферат), и отмечено, что CDR3-подобный пептид сам по себе способен связывать антиген (см. стр. 3785, левая колонка);

Qiu et al. (2007) Nature Biotechnology, 25: 921-9 - показано, что молекула, состоящая из двух связанных CDRs, способна связывать антиген (см. реферат и стр. 926, правая колонка);

Ladner et al. (2007) Nature Biotechnology, 25: 875-7 - это обзорная статья, в которой изложена работа Qiu et al. (выше) с комментарием, что молекулы, содержащие два CDRs, способны сохранять антиген-связывающую активность (см. стр. 875, правая колонка);

Heap et al. (2005) J. Gen. Virol., 86: 1791-1800 - сообщается, что "микроантитело" (молекула, содержащая один CDR) способно связывать антиген (см. реферат и стр. 1791, левая колонка), и показано, что циклический пептид из антитела против HIV обладает антиген-связывающей активностью и функцией;

Nicaise et al. (2004) Protein Science, 13: 1882-91 - показано, что одиночный CDR может придавать антиген-связьшающую активность и сродство к своему антигену лизоциму;

Vaughan and Sollazzo (2001) Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 4: 417-430 - это обзорная статья, в которой описаны минитела, содержащие менее трех участков CDR. Например, на стр. 418 (правая колонка - 3 Our Strategy for Design) описано минитело, содержащее только гипервариабельные участки H1 и Н2 CDR, встроенные в каркасные участки. Минитело описано, как способное связываться с мишенью;

Quiocho (1993) Nature, 362: 293-4 - еще одна статья обзорного типа, в которой представлена сводка по технологии минител (т.е. миниатюрных антител - в данном случае менее трех CDRs);

Pessi et al. (1993) Nature, 362: 367-9 и Bianchi et al. (1994), J. Mol. Biol., 236: 649-59 - эти работы приведены в обзоре Vaughan и Sollazzo и в них более подробно описаны минитела H1 и H2 и их свойства;

Gao et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 32389-93 - отмечается, что полная цепь V_L (включая все три CDRs) обладает высоким сродством к своему субстрату, вазоактивному кишечному пептиду, как свидетельство того, что не обязательно иметь обе цепи V_H и V_L.

Эти документы были опубликованы еще до даты приоритета настоящей заявки и поэтому должны были быть доступны специалистам тогда, когда осуществлялось настоящее изобретение. В них представлены четкие данные о том, что молекулы, содержащие не все шесть CDRs, могут сохранять антиген-связывающие свойства тех антител, из которых они происходят.

В одном предпочтительном воплощении, если связывающая молекула, используемая в первом аспекте настоящего изобретения, обладает специфичностью к PSA, то связывающая молекула представляет собой антитело либо его антиген-связывающий фрагмент или производное, содержащее все 6 CDRs типичного антитела 5A10 против PSA.

В альтернативном воплощении, если связывающая молекула, используемая в первом аспекте настоящего изобретения, обладает специфичностью к PSA, то связывающая молекула может содержать или состоять из антитела, выбранного из группы, состоящей из PSA30, 4D4, 5C3 и 5A10 и их антиген-связывающих фрагментов.

В другом воплощении первого аспекта настоящего изобретения связывающая молекула обладает специфичностью к гландулярному калликреину человека (hK2).

Термин hK2 служит для обозначения всех изомерных форм hK2 и любых молекул или белков в комплексе с hK2. Типичная последовательность hK2 описана как Transcript: KLK2-201 (ENST00000325321), продукт гена ENSG00000167751, и приведена в сводной базе данных, которая находится по следующему адресу во всемирной паутине: ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Sequence_Protein?g=ENSG00000167751; r=19:51376689-51383822; t=ENST00000325321 и имеет следующую последовательность:

Большая часть hK2 в семенной жидкости неактивна и находится в комплексе с ингибиторным белком С (PCI). Возможно, что hK2 образует комплексы и с другими ингибиторами внеклеточных протеаз. Опыты in vitro показали, что hK2 может связываться с α2-антиплазмином (α2-АР), ACT, AMG, антитромбином III (ATIII), инактиватором C1 и ингибитором-1 активатора плазминогена (PAI-1).

Таким образом, в объем настоящего изобретения также входит введение метки в такие соединения, молекулы, белки или вещества, как PCI, α2-антиплазмин (α2-АР), ACT, AMG, антитромбин III (ATIII), инактиватор C1 и ингибитор-1 активатора плазминогена (PAI-1), связанные или комплексированные с PSA.

В одном воплощении связывающая молекула может обладать специфичностью к свободной (то есть некомплексированной) форме hK2 по сравнению с комплексированной формой hK2. Связывающие молекулы со специфичностью к свободной форме hK2 могут обладать специфичностью связывания к эпитопу, который экспонирован у свободной формы hK2, но не экспонирован у комплексированной формы hK2, который может быть линейным или же конформационным (т.е. нелинейным) эпитопом. К примеру, связывающая молекула может обладать специфичностью к такому эпитопу, который включает один или несколько аминокислотных остатков, входящих в состав каталитической расщелины hK2, которая выходит на поверхность у свободного hK2, но не выходит у комплексированной формы типа той формы, которая присутствует в семенной жидкости при комплексировании hK2 с PCI. Картирование эпитопов у hK2 описано в Väisänen et al., Clinical Chemistry 50: 9, 1607-1617 (2004), содержание которой включено сюда путем ссылки.

Если связывающая молекула, используемая в первом аспекте настоящего изобретения, обладает специфичностью к hK2, то она может конкурировать за связывание с hK2 или пептидом, содержащим активный эпитоп hK2 при связывании со связывающей молекулой, с антителом, выбранным из группы, состоящей из 11B6 и 7G1. Дальнейшее обсуждение таких антител можно найти в Väisänen et al., Clinical Chemistry, 50:9, 1607-1617 (2004); и Väisänen et al., Anal. Chem., 78: 7809-7815 (2006), содержание которых включено сюда путем ссылки.

Аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи, входящих в состав типичного антитела 11B6 против hK2, приведены ниже (при этом последовательности CDR подчеркнуты).

Тяжелая цепь 11В6

DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGNSITSDYAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGSTTYSPSLKSRFSITRDTSKNQFFLQLNSVTPEDTATYFCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS

[SEQ ID NO: 4]

Легкая цепь 11B6

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYFGTSLMHWYRQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIQPVEEDDFSMYFCQQTRKVPYTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO: 5]

В этом контексте термин "конкурирует" означает, что присутствие средства, содержащего связывающую молекулу, при конкурентном анализе вместе с контрольным антителом, выбранным из числа 11B6 и 7G1, может снижать уровень детектируемого связывания контрольного антитела с hK2 на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или 100% (например, если средство и контрольное антитело присутствуют при тестировании в эквимолярном количестве, при этом тестирование необязательно проводится в физиологических условиях). Такой анализ может проводиться методом иммунорадиометрического анализа (IRMA), как описано в примере 9.

Если связывающая молекула, используемая в первом аспекте настоящего изобретения, обладает специфичностью к hK2, то она может содержать один или несколько определяющих комплементарность участков (CDRs) антитела, выбранного из группы, состоящей из 11B6 и 7G1 (которые выделены подчеркиванием выше).

Связывающие молекулы не обязательно должны содержать все шесть CDRs какого-либо из этих антител для того, чтобы сохранить антиген-связывающую активность, хотя в одном воплощении связывающая молекула может содержать все шесть CDRs из антитела, выбранного из группы, состоящей из 11B6 и 7G1.

В качестве альтернативы связывающая молекула может содержать менее шести CDRs, как-то:

- пять CDRs (т.е. 3 CDRs из области V_H или V_L, 2 CDRs из другой вариабельной области);

- четыре CDRs (т.е. 3 CDRs из области V_H или V_L, 1 CDR из другой вариабельной области; либо по 2 CDRs из каждой из областей V_H и V_L);

- три CDRs (т.е. все 3 CDRs из одной области V_H или V_L и ни одного из другой; либо 2 CDRs из области V_H или VL, 1 CDR из другой вариабельной области);

- два CDRs (т.е. два CDRs из одной области V_H или V_L и ни одного из другой; либо по 1 CDR из каждой из областей V_H и V_L); или

- один CDR из любой из областей V_H и V_L,

из антитела, выбранного из группы, состоящей из 11B6 и 7G1.

В одном предпочтительном воплощении, если связывающая молекула, используемая в первом аспекте настоящего изобретения, обладает специфичностью к hK2, то связывающая молекула представляет собой антитело либо его антиген-связывающий фрагмент или производное, содержащее все 6 CDRs типичного антитела 11B6 против hK2 (см. подчеркнутые последовательности в SEQ ID NOs: 4 и 5).

В альтернативном воплощении, если связывающая молекула, используемая в первом аспекте настоящего изобретения, обладает специфичностью к hK2, то связывающая молекула может содержать или состоять из антитела, выбранного из группы, состоящей из 11B6 и 7G1 и их антиген-связывающих фрагментов.

Необязательно средство, используемое в первом аспекте настоящего изобретения, может дополнительно содержать терапевтическую молекулу. Соответственно, средство может содержать или состоять из связывающей молекулы, описанной выше, и терапевтической молекулы. Связывающая молекула может соединяться с терапевтической молекулой непосредственно или опосредованно.

В том случае, когда средство содержит или состоит из связывающей молекулы, описанной выше, и терапевтической молекулы, оно может проявлять характеристики поглощения опухолью, к примеру, при тестировании в условиях, используемых в приведенных ниже примерах, которые практически эквивалентны характеристикам поглощения опухолью у средства, состоящего только из связывающей молекулы. При этом практически эквивалентные включают значения более чем 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или практически 100%.

Можно использовать любые подходящие терапевтические молекулы. Подходящими терапевтическими молекулами являются такие, которые способны уменьшать или подавлять рост или же в особенности уничтожать клетки рака простаты. Например, терапевтическим средством может быть цитотоксическая молекула. Цитотоксическая молекула может содержать или состоять из одного или нескольких радиоизотопов. К примеру, один или несколько радиоизотопов могут быть независимо выбраны из группы, состоящей из бета-излучателей, излучателей Оже, излучателей конверсионных электронов, альфа-излучателей и излучателей низкоэнергетических фотонов. Может быть желательно, чтобы один или несколько радиоизотопов каждый независимо имел такой профиль излучения локально поглощаемой энергии, который дает большую поглощенную дозу в непосредственной близости от средства. Типичными радиоизотопами являются длиннопробежные бета-излучатели, такие как ⁹⁰Y, ³²P, ¹⁸⁶Re/¹⁸⁸Re, ¹⁶⁶Ho, ⁷⁶As/⁷⁷As, ⁸⁹Sr, ¹⁵³Sm; среднепробежные бета-излучатели, такие как ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ⁶⁷Cu, ¹⁶¹Tb, ¹⁰⁵Rh; низкоэнергетические бета-излучатели, такие как ⁴⁵Са или ³⁵S; конверсионные или излучатели Оже, такие как ⁵¹Cr, ⁶⁷Ga, ⁹⁹Tc^m, ¹¹¹In, ^114mIn, ¹²³I, ¹²⁵I, ²⁰¹Tl; и альфа-излучатели, такие как ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²²³Ac, ²²⁵Ac, ²¹²Pb, ²⁵⁵Fm, ²²³Ra, ¹⁴⁹Tb и ²²¹At. Другие примеры терапевтических радионуклидов приведены на фиг. 9. Доступны и другие радионуклиды, которые могу