Композиция для лечения диабета, содержащая конъюгат инсулина длительного действия и конъюгат инсулинотропного пептида длительного действия

Композиция для лечения диабета, содержащая конъюгат инсулина длительного действия и конъюгат инсулинотропного пептида длительного действия

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композиции для предупреждения или лечения диабета, содержащей конъюгат инсулина длительного действия и конъюгат инсулинотропного пептида длительного действия, и к способу лечения диабета, включающему стадию введения данной композиции.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Инсулин представляет собой пептид, секретируемый бета-клетками поджелудочной железы, и играет важную роль в контроле уровня глюкозы в организме. Метаболическое заболевание, диабет, ассоциировано с повышенными уровнями глюкозы в крови, вызванными нарушением секреции или функции инсулина. Диабет 1-го типа вызван повышенными уровнями глюкозы в крови из-за нарушения образования инсулина поджелудочной железой, а диабет 2-го типа вызван повышенными уровнями глюкозы в крови из-за нарушения секреции или функции инсулина. Пациентов с диабетом 2-го типа обычно лечат пероральными гипогликемическими агентами, в которых главным ингредиентом является химическое вещество, и которые в некоторых случаях применяются с инсулином, тогда как для пациентов с диабетом 1-го типа требуется лечение инсулином.

Самая обычная инсулиновая терапия включает инъекции инсулина до и/или после еды. В настоящее время доступен инъекционный инсулин, и, как правило, его вводят подкожно. Способ введения варьирует, в зависимости от его периода действия. Инъекция инсулина демонстрирует более быстрый гипогликемический эффект, чем пероральное введение, и может безопасно использоваться, когда пероральное введение невозможно. Также для применения инсулина нет ограничения по дозе. Однако долговременное использование инсулина три раза в сутки может приводить к затруднениям, таким как неприятие игл, трудности в обращении с инъекционным устройством, гипогликемия и увеличение массы тела. Увеличение массы тела из-за долговременного использования инсулина может повысить риск возникновения сердечно-сосудистого заболевания и резистентности к инсулину. В то же время, делается множество попыток максимизировать эффективность путем поддержания долговременных, повышенных уровней инсулиновых пептидных лекарственных средств после поглощения организмом. Например, были разработаны и имеются в продаже композиции инсулина длительного действия, такие как Лантус (инсулин гларгин; Sanofi Aventis) и Левемир (инсулин детемир; Novo Nordisk). В отличие от НПХ-инсулина (нейтральный протамин Хагедорна), данные лекарственные средства длительного действия снижают риск развития гипогликемии во время сна, а Левемир, в частности, ассоциирован с несколько замедленным увеличением массы тела. Однако данные композиции лекарственных средств также имеют недостатки в том, что их необходимо применять один раз или дважды в сутки.

В то же время, один инсулинотропный пептид - глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1) представляет собой инкретиновый гормон, секретируемый L-клетками подвздошной кишки и толстой кишки. Глюкагоноподобный пептид-1 функционирует, увеличивая глюкозозависимое высвобождение инсулина для предотвращения эпизодов гипогликемии. Благодаря этому свойству, он привлек внимание в качестве потенциального лечения диабета 2-го типа. Однако главным препятствием для применения GLP-1 в качестве терапевтического агента является его крайне короткий период полувыведения, составляющий меньее 2-х минут в плазме. В настоящее время эксендин-4 имеется в продаже в качестве агониста рецептора глюкагоноподобного пептида-1, и он представляет собой аналог глюкагоноподобного пептида-1, выделенный из слюнной железы ящерицы ядозуба. Эксендин-4 обладает устойчивостью к DPP IV (дипептидилпептидаза-4) и более высокой физиологической активностью, чем глюкагоноподобный пептид-1. В результате он имел период полувыведения in vivo от 2 до 4 часов, который был дольше, чем период полувыведения глюкагоноподобного пептида-1 (US 5424286). Однако физиологическая активность не поддерживается в достаточной мере при использовании лишь способа увеличения устойчивости к DPP IV, и например, в случае имеющегося в продаже эксендина-4 (эксенатид), его нужно инъецировать пациенту дважды в сутки, и пациенты, которых лечат эксенатидом, все же испытывают такие побочные эффекты, как тошнота и рвота.

Для того чтобы решить вышеупомянутые проблемы, авторы настоящего изобретения предложили пептидный конъюгат длительного действия, который был получен связыванием физиологически активного полипептида и области Fc иммуноглобулина через непептидильный полимер в качестве линкера посредством ковалентной связи, тем самым одновременно поддерживая активность и улучшая стабильность белкового лекарственного средства (корейский патент №10-0725315). В частности, авторы изобретения обнаружили, что и конъюгат инсулина длительного действия, и конъюгат эксендина-4 длительного действия оказывает заметно усиленный эффект in vivo (заявки на корейские патенты №10-2008-0001479 и 10-2010-0054068).

Однако при инъекции инсулина или эксендина-4 в количестве, которое поддерживает стабильный уровень глюкозы в крови, все еще сохраняются проблемы увеличения массы тела, или тошноты и рвоты. Таким образом, имеется острая потребность в разработке терапевтического способа, демонстрирующего превосходные терапевтические эффекты на диабет при меньших дозах и менее частом применении лекарственного средства.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая проблема

Авторы настоящего изобретения сделали множество попыток разработать терапевтический агент для лечения диабета, который имеет долговременную терапевтическую эффективность и одновременно уменьшает такие побочные эффекты, как тошнота и рвота. Авторы изобретения пытались осуществлять сопутствующее введение конъюгата эксендина-4 длительного действия и конъюгата инсулина длительного действия, что одновременно стимулирует рецептор глюкагоноподобного пептида-1 и рецептор инсулина. В результате, авторы изобретения обнаружили, что сопутствующее введение конъюгата инсулина длительного действия и конъюгата эксендина-4 длительного действия увеличивает продолжительность эффекта и стабильность in vivo, и заметно уменьшает дозы лекарственных средств, приводя к стабильному уровню глюкозы в крови. Дополнительно, авторы изобретения обнаружили, что оно уменьшает такие побочные эффекты, как рвота и тошнота, индуцированные агонистом глюкагоноподобного пептида-1 и эксендином-4 или их производными, и что применение конъюгата эксендина-4 длительного действия замедляет увеличение массы тела, вызванное применением инсулина, тем самым дополняя настоящее изобретение.

Решение проблемы

Целью настоящего изобретения является предложение фармацевтической композиции для предупреждения или лечения диабета, содержащей конъюгат инсулина длительного действия и конъюгат инсулинотропного пептида длительного действия.

Другой целью настоящего изобретения является предложение способа предупреждения или лечения диабета, включающего стадию введения композиции субъекту, имеющему диабет или подверженному риску диабета.

Другой целью настоящего изобретения является предложение фармацевтической композиции для предупреждения или лечения диабета, содержащей конъюгат инсулина длительного действия и инсулинотропный пептид.

Другой целью настоящего изобретения является предложение фармацевтической композиции для предупреждения или лечения диабета, содержащей инсулин и конъюгат инсулинотропного пептида длительного действия.

Полезные эффекты изобретения

Конъюгат инсулина длительного действия и конъюгат эксендина-4 длительного действия по настоящему изобретению демонстрируют превосходные терапевтические эффекты в отношении диабета и, в частности, их сопутствующее введение стимулирует одновременно рецептор инсулина и рецептор глюкагоноподобного пептида-1, что увеличивает продолжительность их эффекта и стабильности in vivo и заметно уменьшает требующиеся дозы лекарственных средств, и устойчиво контролирует концентрацию глюкозы в крови на стабильном уровне, что приводит к замедлению развития гипогликемии и увеличения массы тела. Дополнительно, оно ингибирует тошноту и рвоту и характеризуется улучшенным соблюдением схемы приема лекарственного средства в качестве терапевтического агента для лечения диабета. В частности, оно дает заметно повышенную стабильность и продолжительность эффекта in vivo, обеспечивая уменьшение частоты терапии, что способствует удобству пациента.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

ФИГ.1 представляет собой график, на котором показаны изменения уровней глюкозы в крови в течение 7-суточного периода после сопутствующего введения конъюгата инсулина длительного действия и конъюгата эксендина-4 длительного действия мышам с диабетом, индуцированным STZ (стрептозотоцин);

ФИГ.2 представляет собой график, на котором показаны изменения уровня глюкозы в крови натощак (ΔFBG) после сопутствующего введения конъюгата инсулина длительного действия и конъюгата эксендина-4 длительного действия мышам db/db (*Р меньше 0,05, **Р меньше 0,01, ***Р меньше 0,001 при использовании критерия множественных сравнений Даннета) и

ФИГ.3 представляет собой график, на котором показаны изменения массы тела (ΔBW) после сопутствующего введения конъюгата инсулина длительного действия и конъюгата эксендина-4 длительного действия мышам db/db (*Р меньше 0,05, **Р меньше 0,01, ***Р меньше 0,001 при использовании критерия множественных сравнений Даннета).

ЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения диабета, содержащая конъюгат инсулина длительного действия и конъюгат инсулинотропного пептида длительного действия. Композиция по настоящему изобретению характеризуется сопутствующим введением конъюгата инсулина длительного действия и конъюгата инсулинотропного пептида длительного действия.

Термин «конъюгат инсулина длительного действия» в том виде, как он здесь используется, обозначает инсулин, связанный с областью Fc иммуноглобулина через непептидильный линкер.

Конъюгат инсулина длительного действия по настоящему изобретению имеет повышенную продолжительность эффекта in vivo по сравнению с нативным инсулином, и конъюгат инсулина длительного действия может включать инсулин, полученный модификацией, заменой, вставкой или делецией аминокислотных последовательностей нативного инсулина, инсулин, конъюгированный с биодеградируемым полимером, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ), инсулин, конъюгированный с белком длительного действия, таким как альбумин или иммуноглобулин, инсулин, конъюгированный с жирной кислотой, обладающей способностью связываться с альбумином в организме, или инсулин, инкапсулированный в биодеградируемые наночастицы, но тип конъюгата инсулина длительного действия не ограничивается ими.

Термин «инсулин» в том виде, как он здесь используется, означает пептид, который секретируется поджелудочной железой в ответ на повышенные уровни глюкозы в крови, для поглощения глюкозы в печени, мышцах или жировой ткани и превращения ее в гликоген и для остановки использования жира в качестве источника энергии, и, таким образом, он контролирует уровень глюкозы в крови. Этот пептид включает нативный инсулин, базальный инсулин, агонисты инсулина, его предшественники, производные, фрагменты и его варианты.

«Нативный инсулин» представляет собой гормон, который секретируется поджелудочной железой для стимулирования поглощения глюкозы и ингибирования распада жира, и, таким образом, он функционирует в контроле уровня глюкозы в крови. Инсулин образуется из предшественника, не имеющего функции регуляции уровня глюкозы в крови, известного как проинсулин, посредством процессинга. Аминокислотные последовательности инсулина являются следующими:

Альфа-цепь:

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO:1)

Бета-цепь:

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO:2)

Термин «базальный инсулин» означает пептид, который управляет нормальными суточными колебаниями уровня глюкозы в крови, например, левемир, гларгин, деглюдек и т.д.

Термин «агонист инсулина» означает соединение, которое связывается с рецептором инсулина с демонстрацией биологической активности, равной активности инсулина, структура которого не соответствует структуре инсулина.

«Вариант инсулина» представляет собой пептид, имеющий одну или более чем одну аминокислотную последовательность, отличную от последовательностей нативного инсулина, и данный термин означает пептид, который сохраняет функцию контроля уровня глюкозы в крови в организме, и он может быть получен посредством любого из следующих способов: замена, вставка, делеция и модификация или их комбинация в части аминокислотных последовательностей нативного инсулина.

Термин «производное инсулина» означает пептид, имеющий по меньшей мере 80%-ю гомологию аминокислотной последовательности с нативным инсулином, в котором некоторые группы аминокислотных остатков могут быть химически замещены (например, альфа-метилирование, альфа-гидроксилирование), удалены (например, дезаминирование) или модифицированы (например, N-метилирование), и он имеет функцию регулирования уровня глюкозы в крови в организме.

Термин «фрагмент инсулина» означает фрагмент, имеющий вставку или делецию одной или более чем одной аминокислоты на N-конце или C-конце нативного инсулина, в котором могут быть добавлены аминокислоты, не встречающиеся в природе (например, аминокислота D-типа), и он имеет функцию регулирования уровня глюкозы в крови в организме.

Все способы получения агонистов, производных, фрагментов и вариантов инсулина можно использовать индивидуально или в комбинации. Например, настоящее изобретение включает пептид, который имеет одну или более чем одну аминокислоту, отличную от аминокислот нативного пептида, и дезаминирование N-концевого аминокислотного остатка, и имеет функцию регулирования уровня глюкозы в крови в организме.

В конкретном воплощении инсулин, используемый в настоящем изобретении, можно получать методами генной инженерии, и его также можно синтезировать с использованием способа твердофазного синтеза.

Дополнительно, инсулин, используемый в настоящем изобретении, характеризуется тем, что с аминоконцом бета-цепи инсулина связан непептидильный полимер. Данный непептидильный полимер может быть использован в настоящем изобретении в качестве линкера. Непептидильный полимер связан в качестве линкера, посредством этого поддерживая активность и улучшая стабильность инсулина.

Термин «непептидильный полимер» в том виде, как он здесь используется, относится к биосовместимому полимеру, включающему две или более чем две повторяющиеся единицы, связанные друг с другом любой ковалентной связью, за исключением пептидной связи. В настоящем изобретении термин «непептидильный полимер» может использоваться взаимозаменяемо с непептидильным линкером.

Непептидильный полимер, полезный в настоящем изобретении, может быть выбран из группы, состоящей из биодеградируемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты и их комбинаций, и предпочтительно биодеградируемый полимер может представлять собой полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, сополимер этиленгликоля-пропиленгликоля, полиоксиэтилированный полиол, поливиниловый спирт, полисахарид, декстран, поливинилэтиловый эфир, полимолочную кислоту (PLA) или полимолочную-гликолевую кислоту (PLGA), и более предпочтительно представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ). Дополнительно, в объем настоящего изобретения могут быть включены его производные, известные в данной области, и производные, которые можно легко получить способом, известным в данной области.

Пептидный линкер, который используется в слитом белке, полученном традиционным способом слияния в рамке считывания, имеет недостатки, заключающиеся в том, что он легко расщепляется in vivo протеолитическим ферментом, и, таким образом, не может быть получен ожидаемый достаточный эффект увеличения периода полувыведения в сыворотке активного лекарственного средства посредством носителя. Однако в настоящем изобретении для поддержания периода полувыведения пептида в сыворотке на уровне, аналогичном периоду полувыведения носителя, можно использовать полимер, имеющий устойчивость к протеолитическому ферменту. Следовательно, можно использовать любой непептидильный полимер без ограничения, при условии, что он представляет собой полимер, имеющий вышеупомянутую функцию, то есть, полимер, имеющий устойчивость к протеолитическому ферменту in vivo. Данный непептидильный полимер имеет молекулярную массу в интервале от 1 до 100 кДа и предпочтительно - от 1 до 20 кДа. Непептидильный полимер по настоящему изобретению, связанный с областью Fc иммуноглобулина, может представлять собой один полимер или комбинацию разных типов полимеров.

Непептидильный полимер, используемый в настоящем изобретении, имеет реакционноспособную группу, способную связываться с областью Fc иммуноглобулина и с белковым лекарственным средством. Данный непептидильный полимер имеет реакционноспособную группу на обоих концах, которая предпочтительно выбрана из группы, состоящей из реакционноспособного альдегида, пропиональдегида, бутиральдегида, малеимида и производного сукцинимида. Производное сукцинимида может представлять собой сукцинимидилпропионат, гидроксисукцинимидил, сукцинимидилкарбоксиметил или сукцинимидилкарбонат. В частности, когда непептидильный полимер имеет реакционноспособную альдегидную группу на его обоих концах, он эффективно связывается на обоих концах с физиологически активным полипептидом и иммуноглобулином с минимальными неспецифичными реакциями. Конечный продукт, образованный восстановительным алкилированием посредством альдегидной связи, значительно стабильнее, чем продукт, связанный амидной связью. Альдегидная реакционноспособная группа селективно связывается с N-концом при низком рН и связывается с остатком лизина с образованием ковалентной связи при высоком рН, таком как рН 9,0. Реакционноспособные группы на обоих концах непептидильного полимера могут быть одинаковыми или разными. Например, непептидильный полимер может иметь малеимидную группу на одном конце и альдегидную группу, пропиональдегидную группу или бутиральдегидную группу на другом конце. При использовании в качестве непептидильного полимера полиэтиленгликоля, имеющего на его обоих концах реакционноспособную гидроксильную группу, данную гидроксильную группу можно активировать с образованием разных реакционноспособных групп посредством известных химических реакций, или можно использовать полиэтиленгликоль, имеющий доступную в продаже модифицированную реакционноспособную группу, так, чтобы получать конъюгат инсулина длительного действия по настоящему изобретению. Предпочтительно непептидильный полимер может быть связан с N-концом бета-цепи инсулина.

Инсулин по настоящему изобретению может быть модифицирован непептидильным полимером. На самом деле, модификация ПЭГ (полиэтиленгликоль) для предупреждения гипогликемии и увеличения продолжительности эффекта делает титр физиологически активного пептида весьма низким. Однако этот недостаток становится преимуществом при разработке конъюгатов инсулина длительного действия с использованием фрагментов иммуноглобулинов. Таким образом, инсулин, модифицированный ПЭГ, может быть связан с областью Fc иммуноглобулина через непептидильный полимер. Непептидильный полимер, используемый при модификации инсулина, может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля-пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинилэтилового эфира, биодеградируемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты и их комбинации, и предпочтительно представляет собой полиэтиленгликоль. ПЭГ модификация в инсулине, модифицированном ПЭГ, характеризуется тем, что ПЭГ селективно связывается с N-концом альфа-цепи или с конкретным остатком лизина бета-цепи инсулина. Инсулин, модифицированный ПЭГ, предпочтительно включает реакционноспособные альдегидную и сукцинильную группы на его концах, и более конкретно, реакционноспособную сукцинильную группу.

Способ получения и эффективность конъюгата инсулина длительного действия по настоящему изобретению подробно описана в корейских заявках на патент №2010-0054068, 2010-0054067 и 2011-0030868. В одном Примере настоящего изобретения моно-ПЭГилирование проводили на N-конце области Fc иммуноглобулина, и фенилаланин в положении 1 бета-цепи инсулина модифицировали им с получением конъюгата инсулина длительного действия (Пример 1).

Термин «конъюгат инсулинотропного пептида длительного действия» в том виде, как он здесь используется, означает инсулинотропный пептид, связанный с областью Fc иммуноглобулина через непептидильный линкер.

В настоящем изобретении термин «инсулинотропный пептид» означает пептид, который сохраняет функцию высвобождения инсулина и стимулирует синтез или экспрессию инсулина в бета-клетках поджелудочной железы. Предпочтительно инсулинотропный пептид представляет собой GLP (глюкагоноподобный пептид)-1, эксендин-3 или эксендин-4, но не ограничивается ими. Инсулинотропный пептид включает нативные инсулинотропные пептиды, его предшественники, его агонисты, его производные, его фрагменты и его варианты.

Производное инсулинотропного пептида по настоящему изобретению может включать дезаминогистидильное производное, где N-концевая аминогруппа инсулинотропного пептида удалена, бета-гидроксиимидазопропионильное производное, где аминогруппа замещена гидроксильной группой, диметилгистидильное производное, где аминогруппа модифицирована двумя метильными группами, бета-карбоксиимидазопропионильное производное, где N-концевая аминогруппа замещена карбоксильной группой, или имидазоацетильное производное, где удален альфа-углерод N-концевого остатка гистидина так, что остается только имидазоацетильная группа, и, таким образом, удаляется положительный заряд аминогруппы, и в объем настоящего изобретения включены другие производные с модифицированной N-концевой аминогруппой.

В настоящем изобретении используется производное инсулинотропного пептида, более предпочтительно производное эксендина-4, имеющее химически модифицированную N-концевую аминогруппу (или амин) или аминокислотный остаток, даже более предпочтительно производное эксендина-4, которое получают удалением или замещением альфа-аминогруппы, присутствующей в альфа-углероде N-концевого остатка His1 эксендина-4, или удалением или замещением альфа-углерода. Еще более предпочтительно используется дезамино-гистидил-эксендин-4 (DA-эксендин-4) с удалением N-концевой аминогруппы, бета-гидроксиимидазопропил-эксендин-4 (HY-эксендин-4), полученный замещением аминогруппы гидроксильной группой, бета-карбоксиимидазопропил-эксендин-4 (СХ-эксендин-4), полученный замещением аминогруппы карбоксильной группой, диметил-гистидил-эксендин-4 (DM-эксендин-4), полученный модификацией аминогруппы двумя метильными остатками, или имидазоацетил-эксендин-4 (СА-эксендин-4) с удалением альфа-углерода N-концевого остатка гистидина.

GLP-1 представляет собой гормон, секретируемый тонким кишечником, и обычно он стимулирует биосинтез и секрецию инсулина, ингибирует секрецию глюкагона, и стимулирует поглощение глюкозы клетками. В тонком кишечнике предшественник глюкагона распадается на три пептида, то есть, глюкагон, GLP-1 и GLP-2. Здесь GLP-1 означает GLP-1 (1-37), который исходно находится в форме, не имеющей инсулинотропной функции, но затем подвергается процессингу и превращается в одну из активированных форм GLP-1 (7-37). Последовательность аминокислот GLP-1 (7-37) является следующей:

GLP-1 (7-37)

HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G (SEQ ID NO:3)

Термин «производное GLP-1» означает пептид, который демонстрирует по меньшей мере 80%-ю гомологию аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью GLP-1, и он может находиться в химически модифицированной форме, и демонстрирует по меньшей мере эквивалентную или большую инсулинотропную функцию относительно инсулинотропной функции GLP-1.

Термин «фрагмент GLP-1» означает GLP-1, находящийся в такой форме, в которой один или более чем один аминокислотный остаток добавлен или удален на N-конце или С-конце нативного GLP-1, в котором добавленный аминокислотный остаток возможно представляет собой аминокислоту, не встречающуюся в природе (например, аминокислоту D-типа).

Термин «вариант GLP-1» означает пептид, обладающий инсулинотропной функцией, который имеет одну или более чем одну аминокислотную последовательность, отличную от аминокислотной последовательности GLP-1.

Эксендин-3 и эксендин-4 представляют собой инсулинотропные пептиды, состоящие из 39 аминокислот, которые имеют 53%-ю гомологию аминокислтной последовательности с GLP-1. Аминокислотные последовательности эксендина-3 и эксендина-4 являются следующими:

Эксендин-3

HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS (SEQ ID NO:4)

Эксендин-4 HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS (SEQ ID NO:5)

Термин «агонист эксендина» означает соединение, реагирующее с рецепторами in vivo и имеющее биологическую активность, эквивалентную биологической активности эксендина.

Термин «производное эксендина» означает пептид, имеющий по меньшей мере 80%-ю гомологию аминокислотной последовательности с нативным эксендином, у которого некоторые группы аминокислотного остатка могут быть химически замещены (например, альфа-метилирование, альфа-гидроксилирование), удалены (например, дезаминирование) или модифицированы (например, N-метилирование), и он имеет инсулинотропную функцию.

Термин «фрагмент эксендина» означает фрагмент, имеющий вставку или делецию одной или более чем одной аминокислоты на N-конце или C-конце нативного эксендина, в котором могут быть добавлены аминокислоты, не встречающиеся в природе (например, аминокислота D-типа), и он имеет инсулинотропную функцию.

Термин «вариант эксендина» означает пептид, имеющий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, отличную от аминокислотной последовательности нативного эксендина, который имеет инсулинотропную функцию, и вариант эксендина включает пептиды, полученные заменой лизина в положении 12 эксендина-4 серином или аргинином.

Все способы получения агониста, производного, фрагмента и варианта эксендина может быть использован индивидуально или в комбинации. Например, настоящее изобретение включает инсулинотропный пептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере одну аминокислоту, отличную от аминокислот нативного инсулинотропного пептида, и имеющий дезаминированный аминокислотный остаток на N-конце.

В конкретном воплощении нативный инсулинотропный пептид и модифицированный инсулинотропный пептид, используемые в настоящем изобретении, можно синтезировать с использованием метода твердофазного синтеза, и большинство нативных пептидов, включающих нативный инсулинотропный пептид, можно получать методами генной инженерии.

Фраза «конъюгат инсулинотропного пептида длительного действия», используемая в настоящем изобретении, означает инсулинотропный пептид, связанный с фрагментом иммуноглобулина, таким как Fc иммуноглобулина, через непептидильный линкер. Непептидильный линкер является таким же, как описано выше. Конъюгат инсулинотропного пептида длительного действия представляет собой конъюгат, в котором используется фрагмент иммуноглобулина, как и в конъюгате инсулина длительного действия, и он сохраняет традиционные активности инсулинотропного пептида in vivo, такие как стимуляция синтеза и секреции инсулина, контроль аппетита, потеря массы тела, увеличение чувствительности бета-клеток к уровню глюкозы в крови, стимуляция пролиферации бета-клеток, замедленное опорожнение желудка и подавление глюкагона, и он, дополнительно, заметно увеличивает период полувыведения инсулинотропного пептида в крови и, следовательно, эффективность in vivo длительного эффекта пептида. Таким образом, он является полезным при лечении диабета и ожирения.

Тип и способ получения конъюгата инсулинотропного пептида длительного действия подробно описаны в заявках на корейский патент №2008-001479, 2008-0069234 и 2010-0047019.

В одном Примере настоящего изобретения лизин (Lys) имидазо-ацетилэксендина-4 (СА эксендин-4) модифицировали ПЭГ, и эксендин-4, модифицированный ПЭГ, связывали с Fc иммуноглобулина для получения конъюгата эксендина-4 длительного действия (Пример 2).

Инсулин и инсулинотропный пептид, используемый в настоящем изобретении, связывают с веществом-носителем с использованием непептидильного полимера в качестве линкера. Вещество-носитель, полезное в настоящем изобретении, может быть выбрано из группы, состоящей из области Fc иммуноглобулина, альбумина, трансферрина и ПЭГ, и предпочтительно - из области Fc иммуноглобулина.

И конъюгат инсулина длительного действия, и конъюгат инсулинотропного пептида по настоящему изобретению получают связыванием инсулина или инсулинотропного пептида с областью Fc иммуноглобулина через непептидильный линкер, посредством этого обеспечивая устойчивость и стабильность. В настоящем изобретении Fc иммуноглобулина можно использовать взаимозаменимо с фрагментом иммуноглобулина.

Фрагмент Fc также является полезным с точки зрения получения, очистки и выхода комплекса с фрагментом Fc, поскольку он имеет низкую молекулярную массу относительно молекул цельных иммуноглобулинов. Дополнительно, поскольку удалена область Fab, демонстрирующая высокую негомогенность из-за различий аминокислотных последовательностей между антителами, фрагмент Fc имеет значительно повышенную гомогенность вещества и низкий потенциал к индукции антигенности сыворотки.

Термин «область Fc иммуноглобулина» в том виде, как он здесь используется, относится к белку, который содержит константную область 2 тяжелой цепи (СН2) и константную область 3 тяжелой цепи (СН3) иммуноглобулина, за исключением вариабельных областей тяжелых и легких цепей, константной области 1 тяжелой цепи (СН1) и константной области 1 легкой цепи (CL1) иммуноглобулина. Она дополнительно может включать шарнирную область константной области тяжелой цепи. Также область Fc иммуноглобулина по настоящему изобретению может содержать часть или всю область Fc, включая константную область 1 тяжелой цепи (СН1) и/или константную область 1 легкой цепи (CL1), за исключением вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, при условии, что она имеет по существу аналогичную или лучшую физиологическую функцию, чем нативный белок. Также область Fc иммуноглобулина может представлять собой фрагмент, имеющий делецию в относительно длинной части аминокислотной последовательности СН2 и/или СН3. То есть, область Fc иммуноглобулина по настоящему изобретению может содержать 1) домен СН1, домен СН2, домен СН3 и домен СН4, 2) домен СН1 и домен СН2, 3) домен СН1 и домен СН3, 4) домен СН2 и домен СН3, 5) комбинацию одного или более чем одного домена и шарнирной области иммуноглобулина (или части шарнирной области) и 6) димер каждого домена константных областей тяжелой цепи и константной области легкой цепи.

Область Fc иммуноглобулина по настоящему изобретению включает нативную аминокислотную последовательность и производное (мутировавшую версию) данной последовательности. Производное аминокислотной последовательности представляет собой последовательность, которая отличается от нативной аминокислотной последовательности из-за делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены одного или более чем одного аминокислотного остатка, или их комбинаций. Например, в Fc IgG в качестве подходящей мишени для модификации могут быть использованы аминокислотные остатки в положениях 214-238, 297-299, 318-322 или 327-331, для которых известно, что они важны при связывании.

Также возможны разные другие производные, включая производное, в котором удалена область, способная к образованию дисульфидной связи, или устранены определенные аминокислотные остатки в N-конце нативной формы Fc, или к ней добавлен остаток метионина. Дополнительно, для устранения эффекторных функций, в сайте связывания комплемента может происходить делеция, как, например, в сайте связывания C1q и в сайте ADCC (зависимая от антитела клеточно-опосредованная цитотоксичность). Методики получения таких производных последовательности области Fc иммуноглобулина раскрыты в WO 97/34631 и WO 96/32478.

Замены аминокислот в белках и пептидах, которые обычно не изменяют активность белков или пептидов, известны в данной области (Н. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Чаще всего встречающимися заменами являются Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly в обоих направлениях. Дополнительно, область Fc, если это желательно, может быть модифицирована фосфорилированием, сульфатированием, акрилированием, гликозилированием, метилированием, фарнезилированием, ацетилированием, амидированием и тому подобным.

Вышеупомянутые производные Fc представляют собой производные, которые имеют идентичную биологическую активность с областью Fc по настоящему изобретению или улучшенную структурную стабильность, например, в отношении нагревания, рН или тому подобного.

Дополнительно, данные области Fc можно получать из нативных форм, выделенных у людей и других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, или они могут быть их рекомбинантами или производными, полученными из трансформированных животных клеток или микроорганизмов. Здесь их можно получать из нативного иммуноглобулина путем выделения цельных иммуноглобулинов из человеческих или животных организмов и их обработки протеолитическим ферментом. Папаин расщепляет нативный иммуноглобулин на области Fab и Fc, и обработка пепсином приводит к образованию фрагментов pF'c и F(ab)₂. Для выделения Fc и pF'c данные фрагменты можно подвергать, например, гель-фильтрации. Предпочтительно область Fc человеческого происхождения представляет собой рекомбинантную область Fc иммуноглобулина, которую получают из микроорганизма.

Дополнительно, область Fc иммуноглобулина по настоящему изобретению может находиться в форме, содержащей нативные цепи Сахаров, увеличенные цепи Сахаров по сравнению с нативной формой или уменьшенные цепи Сахаров по сравнению с нативной формой, или может находиться в дегликозилированной форме. Увеличение, уменьшение или удаление цепей Сахаров Fc иммуноглобулина может достигаться обычными в данной области способами, такими как химический способ, ферментативный способ и способ генной инженерии с использованием микроорганизма. Удаление цепей Сахаров из области Fc приводит к резкому снижению аффинности связывания с частью C1q первого компонента комплемента С1 и к уменьшению или потере зависимой от антитела клеточно-опосредованной цитотоксичности или комплементзависимой цитотоксичности, посредством этого не индуцируя нетребующиеся иммунные ответы in vivo. В данном отношении область Fc иммуноглобулина в дегликозилированной или агликозилированной форме может быть более подходящей для цели настоящего изобретения в качестве носителя лекарственного средства.

Термин «дегликозилирование» в том виде, как он здесь используется, относится к ферментативному удалению сахарных группировок из области Fc, и термин «агликозилирование» означает то, что область Fc образуется в негликозилированной форме прокариотом, предпочтительно Е.coli.

Тем временем, область Fc иммуноглобулина может происходить от человека или других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, и предпочтительно от человека.

Дополнительно, область Fc иммуноглобулина может представлять собой область Fc, которая происходит из IgG, IgA, IgD, IgE или IgM, или которую получают посредством их комбинаций или их гибридов. Предпочтительно ее получают из IgG или IgM, которые принадлежат к числу самых многочисленных белков в человеческой крови, и н