Варианты альбумина

Варианты альбумина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Ссылка на перечень последовательностей

Данная заявка содержит перечень последовательностей в форме, адаптированной для чтения на компьютере, который включен в данный документ ссылкой.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к вариантам альбумина или его фрагментам или к химерным полипептидам, включающим вариант альбумина или его фрагменты, у которых изменен период полужизни по сравнению с альбумином, его фрагментом или химерным полипептидом, включающим альбумин или его фрагмент.

Описание предшествующего уровня техники

Альбумин является белком, естественно встречающимся в плазме крови млекопитающих, где он является наиболее представленным белком. Он играет важные роли в поддержании целевого осмотического давления, а также в транспорте различных веществ в кровотоке.

Альбумины описаны в различных видах, включая человека, свинью, мышь, крысу, кролика и козу, и они имеют между собой высокую степень гомологии последовательностей и структуры.

Альбумин связывается in vivo со своим рецептором, неонатальным Fc-рецептором (FcRn) «Brambell», и известно, что это взаимодействие является важным для периода полужизни альбумина в плазме. FcRn представляет собой белок, связанный с мембраной, экспрессирующийся во многих типах клеток и тканей. Было обнаружено, что FcRn предохраняет альбумин от внутриклеточной деградации (Roopenian D. С. and Akilesh, S. (2007), Nat. Rev. Immunol 7, 715-725.). FcRn представляет собой бифункциональную молекулу, которая способствует поддержанию высокого уровня IgG и альбумина в сыворотке млекопитающих, таких как люди.

В то время как взаимодействие FcRn-иммуноглобулин (IgG) описано в данной области, взаимодействие FcRn-альбумин описано в меньшей степени. Главный сайт связывания с FcRn локализован внутри DIII (381-585). Andersen et al (2010). Clinical Biochemistry 43, 367-372. Данные демонстрируют, что IgG и альбумин связываются по отдельности с отдельными сайтами на FcRn (Andersen et al. (2006), Eur. J. Immunol 36, 3044-3051; Chaudhury et al. (2006), Biochemistry 45, 4983-4990.).

Известно, что мышиный FcRn связывается с IgG мышей и людей, тогда как человеческий FcRn, по-видимому, является более селективным (Ober et al. (2001) Int. Immunol 13, 1551-1559). Andersen et al. (2010). В публикации Journal of Biological Chemistry 285(7):4826-36 описана аффинность человеческого и мышиного FcRn для каждого альбумина, мышиного и человеческого (все возможные комбинации). Не наблюдали никакого связывания альбумина из каждого вида с каждым рецептором при физиологическом рН. При кислом рН наблюдали 100-кратное отличие в аффинности связывания. Во всех случаях связывание альбумина и IgG из каждого вида с обоими рецепторами было аддитивным.

Человеческий сывороточный альбумин (англ. human serum albumin, HSA) хорошо описан в виде полипептида из 585 аминокислот, последовательность которого можно обнаружить в Peters, Т., Jr. (1996) All about Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical, Applications pp10, Academic Press, Inc., Orlando (ISBN 0-12-552110-3). Он обладает характерным связыванием с рецептором FcRn, с которым он связывается при рН 6, но не при рН 7,4.

Было обнаружено, что период полужизни HSA в плазме составляет приблизительно 19 дней. Был идентифицирован природный вариант, имеющий более низкий период полужизни в плазме (Peach, R. J. and Brennan, S. 0., (1991) Biochim Biophys Acta. 1097:49-54), содержащий замену D494N. Замена дает в данном варианте сайт N-гликозилирования, который отсутствует в альбумине дикого типа. Неизвестно, является ли гликозилирование или аминокислотная замена ответственной за изменение периода полужизни.

Альбумин обладает продолжительным периодом полужизни в плазме и благодаря этому свойству предполагается его использование при доставке лекарственных средств. Альбумин конъюгировали с фармацевтически полезными соединениями (WO 2000/69902А), и было обнаружено, что конъюгат поддерживал продолжительный период полужизни альбумина в плазме. Полученный в результате период полужизни конъюгата в плазме, как правило, был продолжительнее, чем период полужизни в плазме индивидуального полезного терапевтического соединения.

Кроме того, альбумин сливали с терапевтически полезными пептидами (WO 2001/79271 А и WO 2003/59934 А), что обычно приводило в результате к тому, что химерный продукт обладал активностью терапевтически полезного пептида и обладал значительно более продолжительным периодом полужизни в плазме, чем индивидуально терапевтически полезные пептиды.

В публикации Otagiri et al (2009), Biol. Pharm, Bull. 32(4), 527-534, раскрыто, что известно 77 вариантов альбумина, из которых 25 обнаружены в домене III. Было продемонстрировано, что природный вариант, лишенный последних 175 аминокислот на С-конце, обладает уменьшенным периодом полужизни (Andersen et al (2010), Clinical Biochemistry 43, 367-372). Iwao et al.(2007) изучали период полужизни природных вариантов человеческого альбумина с использованием мышиной модели и обнаружили, что K541E и K560E обладали уменьшенным периодом полужизни, Е501К и Е570К обладали увеличенным периодом полужизни, и К573Е почти не имел влияния на период полужизни (Iwao, et. al. (2007) В.В.А. Proteins and Proteomics 1774, 1582-1590).

Galliano et al (1993) Biochim. Biophys. Acta 1225, 27-32 раскрывают природный вариант E505K. Minchiotti et al. (1990) раскрывают природный вариант K536E. Minchiotti et al (1987) Biochim. Biophys. Acta 916, 411-418 раскрывают природный вариант K574N. Takahashi et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4413-4417, раскрывают природный вариант D550G. Carison et al (1992). Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89, 8225-8229, раскрывают природный вариант D550A.

Альбумин обладает способностью связываться с рядом лигандов, и они становятся ассоциированными (ассоциаты) с альбумином. Это свойство применяли для увеличения периода полужизни лекарственных средств в плазме, обладающих способностью нековалентно связываться с альбумином. Этого можно добиться путем связывания фармацевтически полезного соединения, которое обладает слабыми свойствами связывания с альбумином, или не обладает ими, с компонентом, обладающим свойствами связывания с альбумином. См. обзорную статью и ссылку в ней, Kratz (2008). Journal of Controlled Release 132, 171-183.

Альбумин используется в препаратах фармацевтически полезных соединений, в которых таким препаратом может быть, например, в частности, наночастица или микрочастица альбумина. В этих примерах доставка фармацевтически полезного соединения или смеси соединений может выигрывать от изменения аффинности альбумина к его рецептору, причем было продемонстрировано, что полезное соединение ассоциируется с альбумином для доставки.

Неясно, что определяет период полужизни образованных ассоциатов в плазме (в частности, например, «Levemir®», Kurtzhals P et al. Biochem. J. 1995; 312:725-731), конъюгатов или химерных полипептидов, но, по-видимому, этот период является результатом комбинации альбумина и выбранного фармацевтически полезного соединения/полипептида. Была бы целесообразной возможность контроля периода полужизни в плазме данных конъюгатов альбумина, ассоциатов или химерных полипептидов альбумина, так чтобы можно было добиваться более продолжительного или более короткого периода полужизни в плазме, чем данный, с помощью ассоциации, конъюгации или слияния с целью возможности конструирования конкретного лекарственного средства согласно особенностям признаков, которые предназначены для лечения.

Известно, что альбумин накапливается и катаболизируется в опухолях, также было продемонстрировано, что он накапливается в воспаленных суставах индивидуумов, страдающих ревматоидным артритом. См. обзорную статью и ссылку в ней, Kratz (2008). Journal of Controlled Release 132, 171-183. Предполагается, что варианты HSA с увеличенной аффинностью к FcRn будут предпочтительными для доставки фармацевтически полезных соединений.

Еще более целесообразным может быть получение вариантов альбумина, которые обладают слабой способностью связывания с FcRn или не связываются с ним, с целью получения более коротких периодов полужизни или контролируемой фармакокинетики в сыворотке, как описано в работе Kenanova et al (2009) J. Nucl. Med.; 50 (Supplement 2):1582).

Сущность изобретения

В настоящем изобретении предлагаются варианты исходного альбумина с улучшенными свойствами по сравнению с исходным альбумином. Конкретно, в изобретении предлагаются варианты исходного альбумина, у которых период полужизни в плазме отличается от периода полужизни исходного альбумина.

Настоящее изобретение относится к выделенным вариантам альбумина или его фрагментам, или к химерным полипептидам, включающим вариант альбумина или его фрагменты, из исходного альбумина, включающего изменение в одном или нескольких позициях, соответствующих позициям 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 и 584 зрелого полипептида SEQ ID NO:2, где вариант не является вариантом, состоящим из SEQ ID NO:2, содержащей замену D494N, E501K, K541E, D550G,A, K573E или K574N.

Изменение в одном или нескольких положениях независимо может быть выбрано из замен, вставок и делеций, где замена является предпочтительной.

Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим варианты; к конструктам нуклеиновых кислот, векторам и клеткам-хозяевам, включающим полинуклеотиды; а также к способам получения вариантов.

Настоящее изобретение также относится к конъюгатам или ассоциатам, включающим вариант альбумина или его фрагмент по изобретению, а также полезный терапевтический компонент, или к химерному полипептиду, включающему вариант альбумина или его фрагмент по изобретению и полипептид-партнер по слиянию.

Изобретение дополнительно относится к композициям, включающим вариант альбумина, его фрагмент, химерный полипептид, включающий вариант альбумина или его фрагмент по изобретению, или к конъюгатам, включающим вариант альбумина или его фрагмент по изобретению, или к ассоциатам, включающим вариант альбумина или его фрагмент по изобретению. Композиции предпочтительно являются фармацевтическими композициями.

Изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, включающей вариант альбумина, его фрагмент, химерный полипептид, включающий вариант альбумина или его фрагмент, или к конъюгатам, включающим вариант альбумина или его фрагмент, или к ассоциатам, включающим вариант альбумина или его фрагмент, где указанный вариант альбумина, его фрагмент, химерный полипептид, включающий вариант полипептида или его фрагмент, или конъюгаты, включающие вариант альбумина или его фрагмент, или ассоциаты, включающие вариант альбумина или его фрагмент, обладают отличающимся периодом полужизни в плазме по сравнению с соответствующим периодом полужизни в плазме HSA или его фрагмента, химерного полипептида, включающего HSA или его фрагмент, или конъюгатов или ассоциатов HSA или его фрагментов, включающих HSA или его фрагмент.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 представлена карта рестрикции экспрессирующей плазмиды pDB4082.

На фигуре 2 представлена карта рестрикции экспрессирующей плазмиды pDB2305.

На фигуре 3 представлена карта рестрикции экспрессирующей плазмиды pDB4005.

На фигуре 4 представлены SPR сенсограммы 10 мкМ альбумина, инъецированного поверх shFcRn HSA (JTA) = свободный от жирных кислот HSA, приобретенный у «Sigma-Aldrich» (A3782), HSA (Novozymes) = Коммерческий Рекомбинантный человеческий сывороточный альбумин (РЕКОМБУМИН).

На фигуре 5 представлено тИФА-связывание shFcRn-GST с вариантами человеческого сывороточного альбумина (HSA) (100-0,045 μг/мл). Связывание WT, D494N, D494Q и D494A, рН 6 и рН 7,4. Связывание WT, D494N, D494N/T496A и Т496А при рН 6 и рН 7,4. Связывание WT, E495Q и Е495А при рН 6 и рН 7,4.

На фигуре 6 представлены сенсограммы связывания 0,2 цМ вариантов HSA с иммобилизованным shFcRn (~4600 РЕ). WT, D494N, D494Q, D494A, D494N/T496A и Т496А.

На фигуре 7 представлены характерные сенсограммы связывания 1 [М вариантов HSA с иммобилизованным shFcRn (~1400 РЕ). WT, D494N, D494Q, D494A, D494N/T496A и Т496А.

На фигуре 8 представлено относительное связывание вариантов HSA по сравнению с WT на основе двух независимых SPR-экспериментов, представленных (А) на фигуре 6 и (В) на фигуре 7.

На фигуре 9 представлен тИФА-анализ: (А) связывания shFcRn с альбуминами человека, осла, быка, овцы, козы или кролика при рН 6. (В) связывания shFcRn с альбумином морской свинки, хомяка, крысы и курицы при рН 6. (С) связывания shFcRn с альбуминами человека, осла, быка, овцы, козы или кролика при рН 7,4. (D) связывания shFcRn с альбумином морской свинки, хомяка, крысы и курицы при рН 7,4. (Е) относительного связывания различных альбуминов. Относительное связывание человеческого альбумина с shFcRn определено как равное 1. Значения тИФА-анализа соответствуют средним значениям дублированных экспериментов.

На фигуре 10 представлено SPR: Связывание shFcRn-GST с альбумином из различных видов при рН 6 и рН 7,4. Характерные сенсограммы, демонстрирующие связывание 5 рМ альбумина из различных видов; (А) человек, (В) осел, (С) бык, (D) коза, (Е) овца, (F) кролик, (G) собака, (Н) морская свинка, (I) хомяк, (J) крыса, (K) мышь и (L) курица. Варианты альбумина инъецировали поверх иммобилизованного связанного с GST shFcRn (~2100 РЕ). Инъекции осуществляли при 25°С со скоростью 40 мкл/мин.

На фигуре 11 представлены SPR-сенсограммы выбранных HSA-мутантов по сравнению с HSA дикого типа. 20 мкМ (А) WT и Р499А (В) WT и K500A, (С) WT и K536A, (D) WT и Р537А и (Е) WT и K538A и (F) WT и K537A инъецировали поверх иммобилизованного shFcRn при рН 6 (~1500 РЕ)

На фигуре 12 представлены SPR-сенсограммы HSA-мутантов по сравнению с WT HSA. 10 мкМ (А) WT и K573A (В) WT и K573C, (С) WT и K573F, (D) WT и K573G и (Е) WT и K573L и (F) WT и K573M, (G) WT и K573Q, (Н) WT и K573R и (I) WT и К573Т и (J) WT и K573V инъецировали поверх иммобилизованного shFcRn при рН 5,5 и рН7,4. Инъекции осуществляли при 25°С со скоростью потока 80 мкл/мин.

На фигуре 13 представлены SPR-сенсограммы HSA-мутантов по сравнению с HSA дикого типа. 10 мкМ (А) WT и K573D (В) WT и K573E, (С) WT и K573H, (D) WT и K573I и (Е) WT и K573N и (F) WT и K573P, (G) WT и K573S, (Н) WT и К573* и (I) WT и K573W и (J) WT и K573Y инъецировали поверх иммобилизованного shFcRn при рН 5,5 и рН 7,4. Инъекции осуществляли при 25°С со скоростью потока 80 мкл/мин.

На фигуре 14 представлены SPR-сенсограммы HSA-мутантов по сравнению с HSA дикого типа. 20 мкМ (A) WT и E492G+K538H+K541N+E542D (В) WT и E492T+N503K+K541A, (С) WT и E492P+N503K+K541G+E542P, (D) WT и E492H+E501P+N503H+E505D +T506S+T540S+K541E и (Е) WT и A490D+E492T+V493L+E501P+N503D+A504E +E505K+T506F+K541D и (F) WT и E492G+V493P+K538H+K541N+E542D инъецировали поверх иммобилизованного shFcRn при рН 6. Инъекции осуществляли при 25°С со скоростью потока 80 мкл/мин.

На фигуре 15 представлены SPR-сенсограммы HSA-мутантов по сравнению с HSA дикого типа. Двадцать мкМ (А) WT, (В) H440Q, (С) H464Q и (D) H535Q инъецировали поверх иммобилизованного shFcRn при рН 6. Инъекции осуществляли при 25°С со скоростью потока 80 мкл/мин.

На фигуре 16 представлены SPR-сенсограммы HSA-мутанта K500E по сравнению с HSA дикого типа. Десять мкМ HSA-мутанта K500E инъецировали поверх иммобилизованного shFcRn при рН 5,75. Инъекции осуществляли при 25°С со скоростью потока 30 мкл/мин.

На фигуре 17 представлена карта рестрикции экспрессирующей плазмиды pDB3017.

На фигуре 18 представлена карта рестрикции экспрессирующей плазмиды pDB3021.

На фигуре 19 представлена карта рестрикции экспрессирующей плазмиды pDB3056.

На фигуре 20 представлена карта рестрикции экспрессирующей плазмиды pDB3165.

На фигуре 21 представлена карта рестрикции экспрессирующей плазмиды pDB4172.

На фигуре 22 представлена карта рестрикции экспрессирующей плазмиды pDB4267.

На фигуре 23 представлена карта рестрикции экспрессирующей плазмиды pDB4285.

На фигуре 24 представлена хроматограмма ГП-ВЭЖХ HSA дикого типа и конъюгатов мутанта K573P-HRP для анализа shFcRn. Инъецировали по 25 осуществляли на колонку «TSK G3000SWXL» (Tosoh Bioscience), как описано в материалах и методах.

На фигуре 25 представлено разделение в полиакриламидном геле с додецилсульфатом магния (ДСН-ПААГ) с последующими визуальной (А) и в ультрафиолете (В) детекцией Флуоресцеина, конъюгированного с альбумином. HSA::F5M (Дорожка 1), K573P::F5M (Дорожка 2) и rHA стандарт (Дорожка 3).

На фигуре 26 представлены свойства связывания shFcRn с вариантами HSA. 10 мкМ WT rHA и Е492Т(А), WT rHA и D494N/E495Q/T496A(B), WT rHA и N503D(C), WT rHA и N503K(D), WT rHA и E492T/N503D(E), WT rHA и E495Q/T496A(F), WT rHA и K538H(G), WT rHA и E492D(H) инъецировали поверх иммобилизованного shFcRn при рН5,5.

На фигуре 27 представлены свойства связывания shFcRn с вариантами HSA. 10 мкМ WT rHA и K541A(1) и WT rHA и K541N(J) инъецировали поверх иммобилизованного shFcRn при рН 5,5

На фигуре 28 представлено конкурентное связывание K573A и K573P, измеренное с помощью инъекции shFcRn (100 нМ) поверх иммобилизованного HSA (~2500 РЕ) при рН 6 отдельно или с предварительной инкубацией с различными количествами HSA.

На фигуре 29 представлено конкурентное связывание вариантов HSA-FLAG, измеренное с помощью инъекции shFcRn (100 нМ) поверх иммобилизованного HSA (~2500 РЕ) при рН 6 отдельно или вместе с различными количествами вариантов HSA-FLAG.

На фигуре 30 представлено конкурентное связывание вариантов HSA-IL1Ra, измеренное с помощью инъекции shFcRn (100 нМ) поверх иммобилизованного HSA (~2500 РЕ) при рН 6 отдельно или вместе с различными количествами вариантов HSA-IL1Ra.

На фигуре 31 представлено конкурентное связывание scFv-химерных вариантов HSA, измеренное с помощью инъекции shFcRn (100 нМ) поверх иммобилизованного HSA (~2500 РЕ) при рН 6 отдельно или вместе с различными количествами (А) вариантов scFv-HSA-FLAG или (В) вариантов HSA-scFv-FLAG.

На фигуре 32 представлено связывание HSA, его вариантов с одной, двумя и тремя мутациями с shFcRn. Образцы по 10 мкМ каждого варианта HSA инъецировали поверх иммобилизованного shFcRn при рН 5,5 или при рН 7,4.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к выделенным вариантам альбумина или его фрагментов, или к химерным полипептидам, включающим вариант альбумина или его фрагменты, из исходного альбумина, включающего изменение в одном или в нескольких позициях, соответствующих позициям 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500. 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 и 584 зрелого полипептида SEQ ID NO:2, где вариант не является вариантом, состоящим из SEQ ID NO:2, содержащей замену D494N, Е501К, K541E, D550G,A, K573E или K574N.

Изменение в одном или нескольких положениях независимо может быть выбрано из замен, вставок и делеций, где замена является предпочтительной.

Определения

Вариант: Термин «вариант» обозначает полипептид, полученный из исходного альбумина с помощью одного или нескольких изменений, т.е. замены, вставки и/или делеций в одном или более (в нескольких) положениях. Замена обозначает замещение аминокислоты, занимающей положение, другой аминокислотой; делеция обозначает удаление аминокислоты, занимающей положение; и вставка обозначает добавление 1 или нескольких, предпочтительно, 1-3 аминокислот непосредственно по соседству с аминокислотой, занимающей положение.

Мутант: Термин «мутант» обозначает полинуклеотид, кодирующий вариант.

Альбумин дикого типа: Термин альбумин «дикого типа» (WT) обозначает альбумин, имеющий такую же аминокислотную последовательность, что и природный, обнаруженный у животных или человека.

Предшественник или исходный альбумин: «предшественник» или «исходный альбумин» обозначает альбумин, в котором специалистом были осуществлены изменения с получением вариантов альбумина по настоящему изобретению. Предшественник может быть природным (дикого типа) полипептидом или его аллелем или даже его вариантом.

FcRn и shFcRn: Термин «FcRn» обозначает человеческий неонатальный Fc-рецептор (FcRn). «shFcRn» представляет собой растворимую рекомбинантную форму FcRn.

smFcRn: Термин «smFcRn» представляет собой растворимую рекомбинантную форму мышиного неонатального Fc-рецептора.

Выделенный вариант: Термин «выделенный вариант» обозначает вариант, который модифицирован специалистом и отделен полностью или частично, по меньшей мере, от одного компонента, с которым он существует в естественном состоянии. В одном аспекте, вариант является чистым, по меньшей мере, на 1%, например, по меньшей мере, на 5%, по меньшей мере, на 10%, по меньшей мере, на 20%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 80% и, по меньшей мере, на 90%, как определено с помощью ДСН-ПААГ или ГП-ВЭЖХ.

По существу чистый вариант: Термин «по существу чистый вариант» обозначает препарат, который содержит, по большей мере, 10%, по большей мере, 8%, по большей мере, 6%, по большей мере, 5%, по большей мере, 4%, по большей мере, 3%, по большей мере, 2%, по большей мере, 1%. и, по большей мере, 0,5% по массе другого полипептидного материала, с которым он ассоциирован в естественном или рекомбинантном виде. Предпочтительно, если вариант является чистым, по меньшей мере, на 92%, например, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 99%, по меньшей мере, на 99,5% и 100% чистым относительно массы суммарного пептидного материала, присутствующего в препарате. Варианты по настоящему изобретению предпочтительно представлены по существу в чистом виде. Этого можно добиться, например, получением варианта с помощью хорошо известных рекомбинантных методов и с помощью методов очистки.

Зрелый полипептид: Термин «зрелый полипептид» обозначает полипептид в его конечной форме после трансляции и любых пост-трансляционных модификаций, таких как N-концевое процессирование, C-концевое укорачивание, гликозилирование, фосфорилирование и т.д. В одном аспекте, зрелый полипептид содержит аминокислоты 1-585 SEQ ID NO:2, с включением посттрансляционных модификаций.

Последовательность, кодирующая зрелый полипептид: Термин «последовательность, кодирующая зрелый полипептид» обозначает полинуклеотид, который кодирует зрелый полипептид альбумина. В одном аспекте, последовательность кодирующая зрелый полипептид содержит нуклеотиды 1-1758 SEQ ID NO:1.

Идентичность последовательности; Родство двух аминокислотных или двух нуклеотидных последовательностей описывается параметром «идентичность последовательности».

Для целей настоящего изобретения, степень идентичности последовательности между двумя аминокислотными последовательностями определяется с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453) осуществляемого в программе «Needle» пакета «EMBOSS» (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277), предпочтительно, версии 3.0.0 или более поздней. Оптимальные используемые параметры: штраф за открытие делеции 10, штраф за продолжение делеции 0,5, и подстановочная матрица «EBLOSUM62» (EMBOSS версия BLOSUM62). Данные на выходе программы «Needle», отмеченные как «самая протяженная идентичность», (полученные с использованием параметра -nobrief) используют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:

(Идентичные остатки × 100)/(Длина выравнивания - Суммарное количество дедеций в выравнивании)

Для целей настоящего изобретения степень идентичности последовательности между двумя дезоксирибонуклеотидными последовательностями определяется с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, выше), который осуществляется в программе «Needle» пакета программ «EMBOSS» (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, выше), предпочтительно, версии 3.0.0 или более поздней. Оптимальные используемые параметры: штраф за открытие делеции 10, штраф за продолжение делеции 0,5, и подстановочная матрица «EDNAFULL» (EMBOSS версия NCBI NUC4.4). Данные на выходе программы «Needle», отмеченные как «самая протяженная идентичность», (полученные с использованием параметра -nobrief) используют в качестве процента идентичности и рассчитываются следующим образом:

(Идентичные дезоксирибонуклеотиды × 100)/(Длина выравнивания - Суммарное количество делеции в выравнивании)

Фрагмент: термин «фрагмент» обозначает полипептид, содержащий одну или более (несколько) аминокислот, делегированных с N- и/или С-конца альбумина, и/или внутренний участок альбумина, который сохраняет способность связываться с FcRn. Фрагменты могут состоять из одной непрерывной последовательности, полученной из HSA, или они могут содержать две или несколько последовательностей, полученных из HSA. Фрагменты по изобретению имеют размер более чем приблизительно 20 аминокислотных остатков, предпочтительно, более чем 30 аминокислотных остатков, более предпочтительно, более чем 40 аминокислотных остатков, более предпочтительно, более чем 50 аминокислотных остатков, более предпочтительно, более чем 75 аминокислотных остатков, более предпочтительно, более чем 100 аминокислотных остатков, более предпочтительно, более чем 200 аминокислотных остатков, более предпочтительно, более чем 300 аминокислотных остатков, более предпочтительно, более чем 400 аминокислотных остатков, и наиболее предпочтительно, более чем 500 аминокислотных остатков.

Аллельный вариант: Термин «аллельный вариант» обозначает любую из двух или более альтернативных форм гена, занимающего тот же хромосомный локус. Аллельный вариант в естественной среде образуется посредством мутации и может приводить в результате к появлению полиморфизма внутри популяций. Генные мутации могут быть молчащими (без изменений в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененные аминокислотные последовательности. Аллельный вариант полипептида представляет собой полипептид, кодируемый аллельным вариантом гена.

Кодирующая последовательность: термин «кодирующая последовательность» обозначает полинуклеотид, который непосредственно определяет аминокислотную последовательность транслируемого полипептидного продукта. Границы кодирующей последовательности, как правило, определяются открытой рамкой считывания, которая обычно начинается со старт-кодона ATG или с альтернативных старт-кодонов, таких как GTG и TTG, и заканчивается стоп-кодоном, таким как ТАА, TAG и TGA. Кодирующая последовательность может представлять собой ДНК, кДНК, синтетический или рекомбинантный полинуклеотид.

кДНК: термин «кДНК» обозначает ДНК-молекулу, которая может быть получена с помощью обратной транскрипции из зрелой, сплайсированной мРНК-молекулы, полученной из эукариотической клетки. кДНК лишена интронных последовательностей, которые могут присутствовать в соответствующей геномной ДНК. Исходный первичный РНК-транскрипт представляет собой предшественник мРНК, которая процессируется через ряд стадий, включающих сплайсинг, перед появлением зрелой сплайсированной мРНК.

Конструкт нуклеиновой кислоты: термин «конструкт нуклеиновой кислоты» обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, либо одноцепочечную либо двухцепочечную, которая выделена из природного гена или модифицирована так, чтобы содержать сегменты нуклеиновых кислот, не существующие в естественной среде или которые являются синтетическими. Термин конструкт нуклеиновой кислоты является синонимом термину «экспрессирующая кассета», если конструкт нуклеиновой кислоты содержит контрольные последовательности, требующиеся для экспрессии кодирующей последовательности по настоящему изобретению.

Контрольные последовательности: термин «контрольные последовательности» обозначает все компоненты, необходимые для экспрессии полинуклеотида, кодирующего вариант по настоящему изобретению. Каждая контрольная последовательность может быть нативной или чужеродной полинуклеотиду, кодирующему вариант, или нативной или чужеродной друг другу. Такие контрольные последовательности включают в частности лидер, последовательность полиаденилирования, пропептидную последовательность, промотор, последовательность сигнального пептида и терминатор транскрипции. Минимально контрольные последовательности включают промотор и стоп-сигналы транскрипции и трансляции. Контрольные последовательности могут быть обеспечены линкерами для целей введения специфических сайтов рестрикции, облегчающих лидирование контрольных последовательностей внутри кодирующей области полинуклеотида, кодирующего вариант.

Функционально связанная: термин «функционально связанная» обозначает конфигурацию, в которой контрольная последовательность расположена в подходящем положении относительно кодирующей последовательности полинуклеотида, так чтобы контрольная последовательность направляла экспрессию кодирующей последовательности.

Экспрессия: термин «экспрессия» включает любую стадию, вовлеченную в продукцию варианта, включающую в частности транскрипцию, пост-транскрипционные модификации, трансляцию, пост-трансляционные модификации и секрецию.

Экспрессирующий вектор; термин «экспрессирующий вектор» обозначает линейную или циклическую молекулу ДНК, которая включает полинуклеотид, кодирующий вариант, и который функционально связан с дополнительными нуклеотидами. обеспечивающими его экспрессию.

Клетка-хозяин: термин «клетка-хозяин» обозначает любой тип клетки, которая восприимчива к трансформации, трансфекции, трансдукции и так далее, конструктом нуклеиновой кислоты или экспрессирующим вектором, включающим полинуклеотид по настоящему изобретению. Термин «клетка-хозяин» охватывает любое потомство родительской клетки, которое не идентично родительской клетке благодаря мутациям, встречающимся во время репликации.

Период полужизни в плазме: период полужизни в плазме идеально определяется in vivo у подходящих индивидуумов. Однако в связи с тем, что определение занимает много времени и дорого и неизбежны этические проблемы при осуществлении эксперимента на животных или на человеке, целесообразно использование in vitro анализа для определения того, уменьшается или увеличивается период полужизни в плазме. Известно, что связывание альбумина с его рецептором FcRn важно для периода полужизни в плазме, и корреляция между связыванием рецептора и периодом полужизни в плазме такова, что более высокая аффинность альбумина к его рецептору приводит к более продолжительному периоду полужизни в плазме. Таким образом, для настоящего изобретения более высокая аффинность альбумина к FcRn рассматривается как показатель увеличенного периода полужизни в плазме, а более низкая аффинность альбумина к его рецептору рассматривается как показатель уменьшенного периода полужизни в плазме.

В данной заявке и в формуле изобретения связывание альбумина с его рецептором FcRn описано с использованием термина аффинность и выражений «более сильная» или «более слабая». Таким образом, следует понимать, что предполагается, что молекула, имеющая более высокую аффинность к FcRn, чем HSA, связывается более сильно с FcRn, чем HSA, и предполагается, что молекула, имеющая более низкую аффинность к FcRn, чем HSA, связывается слабее с FcRn, чем HSA.

Под терминами «более продолжительный период полужизни в плазме» или «более короткий период полужизни в плазме» и под аналогичными выражениями понимают связь с соответствующей молекулой исходного альбумина. Таким образом, более продолжительный период полужизни в плазме по отношению к варианту альбумина по изобретению означает, что вариант обладает более продолжительным периодом полужизни в плазме, чем соответствующий альбумин, имеющий ту же последовательность за исключением изменения(ий) в позициях, соответствующих 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 и 584 в SEQ ID NO:2.

Правила обозначений вариантов

Для целей настоящего изобретения, зрелый полипептид, раскрытый в SEQ ID NO:2, используют для определения соответствующего аминокислотного остатка в другом альбумине. Аминокислотная последовательность другого альбумина выравнивается со зрелым полипептидом, раскрытым в SEQ ID NO:2, и на основании выравнивания номер аминокислотного положения, соответствующий любому аминокислотному остатку в зрелом полипептиде, раскрытом в SEQ ID NO:2, определяется с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453) осуществляемого в программе «Needle» пакета «EMBOSS» (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277), предпочтительно, версии 3.0.0 или более поздней.

Идентификация соответствующего аминокислотного остатка в другом альбумине можно подтвердить выравниванием множества полипептидных последовательностей с использованием «ClustalW» (Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23:2947-2948).

Если другой полипептид (или белок) отличается от зрелого полипептида SEQ ID NO:2 так, что традиционное сравнение на основе последовательностей не способно детектировать их связь (Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295:613-615), то возможно применение других алгоритмов сравнения парных последовательностей. Можно достичь более высокой чувствительности поиска на основании последовательностей с использованием программ поиска, которые применяют вероятностные представления семейства полипептидов (профили) для поиска в базах данных. Например, программа «PSI-BLAST» генерирует профили через итерационный поиск в базах данных и способна детектировать отдаленные гомологи (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). Еще более высокой чувствительности можно добиться, если семейство или суперсемейство полипептида имеет одного или нескольких представителей в базах данных белковых структур. Программы, такие как «GenTHREADER» (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287:797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19:874-881) используют информацию из различных источников («PSI-BLAST», предсказание вторичной структуры, профили структурного выравнивания и потенциал сольватации) на входе в нейтральную сеть, которая предсказывает сворачивание структуры для рассматриваемой последовательности. Аналогично, метод Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313:903-919, можно применить для выравнивания последовательности неизвестной структуры в моделях суперсемейств, присутствующих в базе данных SCOP. Эти выравнивания в свою очередь можно использовать для получения моделей гомологии полипептидов, и такие модели можно оценивать на предмет точности с использованием различных средств, разработанных для таких целей.

Для выявления и получения структурных выравниваний белков известной структуры доступны несколько инструментов и ресурсов. Например, было проведено структурное выравнивание суперсемейства белков SCOP и результаты выравнивания доступны для загрузки. Две или большее количество белковых структур можно выровнять с помощью различных алгоритмов, таких как матрица расстояний (Holm and Sander, 1998, Proteins 33:88-96) или комбинаторное удлинение (Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11:739-747), а осуществление этих алгоритмов можно дополнительно применять к базам данных для рассматриваемой структуры с использованием представляющей интерес структуры с целью обнаружения возможных структурных гомологов (например, Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16:566-567).

В описании вариантов альбумина по настоящему изобретению, номенклатура, описанная ниже, адаптирована для простоты поиска. Применяют принятые IUPAC однобуквенное или трехбуквенное сокращения названий аминокислот.

Замены. Для аминокислотной замены используют следующую номенклатуру: Исходная аминокислота, положение, замененная аминокислота. Соответственно, например, замена треонина на аланин в положении 226 обозначается как «Thr226Ala» или «Т226А». Множественные мутации разделены добавлением знаков («+»), например, «Gly205Arg+Ser411Phe» или «G205R+S411F», характеризующих замены в положениях 205 и 411 глицина (G) на аланин (R) и серина (S) на фенилаланин (F), соответственно. На фигурах также используются знаки («/»), например, «E492T/N503D», которые следует рассматривать как взаимозаменяемые со знаком («+»).

Делеции. Для аминокислотной делеции используют следующую номенклатуру: Исходная аминокислота, положение*. Соответственно, делеция глицина в положении 195 обозначается как «Gly195*» или «G195*». Множественные делеции разделяются знаками («+»), например, «Gly195*+Ser411*» или «G195*+S411*».

Вставки. Для вставки аминокислот используют следующую номенклатуру: Исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, вставленная аминокислота. Соответственно, вставка лизина после глицина в положении 195 обозначается как «Gly195GlyLys» или «G195GK». Вставка множества аминокислот обозначается [Исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, вставленная аминокислота #1, вставленная аминокислота #2; и т.д.]. Например, вставка лизина и аланина после глицина в положении 195 обозначается как «Gly195GlyLysAla» или «G195GKA».

В таких случаях вставленные аминокислотный остаток(остатки) нумеруются путем добавления буквы нижнего регистра к положению аминокислотного остатка, предшествующего вставленному аминокислотному остатку (остаткам). В вышеописанном примере последовательность, таким образом, будет следующей:

Предшественник:	Вариант:
195	195 195a 195b
G	G - K - A

Множественные изменения. Варианты, включающие множественные изменения, разделяются путем добавления знаков («+»), например, «Arg170Tyr+Gly195Glu» или «R170Y+G195E», описывают замену на тирозин и глутаминовую кислоту аргинин