Комбинированное применение белков vip3ab и cry1fa для вырабатывания резистентности к насекомым

Комбинированное применение белков vip3ab и cry1fa для вырабатывания резистентности к насекомым

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предшествующий уровень техники

Человек выращивает кукурузу для употребления в пищу и для энергетических целей. Человек также выращивает множество других культур, включая сою и хлопок. Насекомые поедают и повреждают растения, и тем самым наносят ущерб деятельности человека. Для борьбы с насекомыми-вредителями ежегодно тратятся миллиарды долларов, и еще миллиарды уходят на возмещение ущерба, наносимого этими вредителями. Инсектициды, синтезированные методами органической химии, являются главным инструментом, используемым для борьбы с насекомыми-вредителями, но в некоторых регионах, в борьбе с насекомыми-вредителями важную роль играют биологические инсектициды, такие как инсектицидные белки, происходящие от Bacillus thuringiensis (Bt). Возможность культивировать резистентные к насекомым растения посредством трансформации этих растений генами инсектицидных белков Bt явилась революцией в современном сельском хозяйстве и доказала важность и ценность инсектицидных белков и их генов.

Некоторые белки Bt были использованы для создания резистентных к насекомым трансгенных растений, которые успешно прошли испытания, и в настоящее время их производят в промышленном масштабе. Такими белками являются Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F и Cry3Bb, вводимые в кукурузу, Cry1Ac и Cry2Ab, вводимые в хлопок, и Cry3A, вводимый в картофель.

Коммерчески доступные продукты, экспрессирующие эти белки, экспрессируют только один из этих белков, за исключением случаев, когда желательно получить комбинированный инсектицидный спектр из 2 белков (например, в кукурузе, Cry1Ab и Cry3Bb объединены для вырабатывания резистентности к чешуекрылым вредителям и корневым личинкам, соответственно), или случаев, когда независимое действие этих белков делает их ценным инструментом для замедления развития резистентности к инсектицидам у восприимчивых популяций насекомых (например, Cry1Ac и Cry2Ab в хлопчатнике объединяют в целях вырабатывания у растений резистентность к табачной листовертке). См. также патент США 20090313717, который относится к белкам Cry2 плюс Vip3Aa, Cry1F или Cry1A, используемым для борьбы с Helicoverpa zea или armigerain. Заявка WO 2009132850 относится к Cry1F или Cry1A и Vip3Aa, используемым для борьбы с Spodoptera frugiperda. Патент США 2008 0311096 относится частично к белку Cry1Ab, используемому для борьбы с Cry1F-резистентным ECB.

То есть, некоторые сорта резистентных к насекомым трансгенных растений, которые быстро и повсеместно адаптируются к этой технологии, также имеют тот недостаток, что популяции вредителей вырабатывают резистентность к инсектицидным белкам, продуцируемым этими растениями. Было предложено несколько стратегий для сохранения ценных признаков резистентности к Bt-насекомым, где указанные стратегии включают использование высоких доз белков в комбинации с сохранением площадей «убежищ» нетрансгенных растений, и чередования или совместного использования различных токсинов (McGaughey et al.(1998), «Bt-Resistance Management» Nature Biotechnol. 16: 144-146).

Необходимо, чтобы белки, отобранные для использования в IRM-кластерах, обладали независимым инсектицидным действием, при котором резистентность, вырабатываемая к одному белку, не распространялась на другой белок (то есть, не наблюдалась перекрестная резистентность к белкам). Так, например, если популяция насекомых, выбранных на резистентность к «белку А», является восприимчивой к «белку В», то можно сделать вывод, что в данном случае перекрестная резистентность отсутствует, и комбинация «белок А и белок В» будет эффективной для замедления вырабатывания резистентности к одному белку А.

В случае отсутствия популяции резистентных насекомых, оценка может быть сделана исходя из других характеристик, которые, как предполагается, относятся к механизму действия и возможной перекрестной резистентности. Было высказано предположение, что применение опосредуемого рецептором связывания при идентификации инсектицидных белков, очевидно, не будет приводить к вырабатыванию перекрестной резистентности. (van Mellaert et al. 1999). Ключевым прогностическим фактором отсутствия перекрестной резистентности, появляющейся при таком подходе, является то, что инсектицидные белки не конкурируют за связывание с рецепторами у восприимчивых видов насекомых.

В случае, когда два токсина Bt конкурируют за связывание с одним и тем же рецептором, и если этот рецептор мутирует у насекомого так, что один из токсинов больше не связывается с этим рецептором, а поэтому не обладает инсектицидным действием против насекомого, то такое насекомое может приобретать резистентность ко второму токсину (который конкурентно связывается с тем же рецептором). То есть, можно сказать, что такое насекомое будет обладать перекрестной резистентностью к обоим токсинам Bt. Однако если два токсина связываются с двумя различными рецепторами, то это означает, что такое насекомое не обладает одновременной резистентностью к этим двум токсинам.

Cry1Fa может быть использован для борьбы с чешуекрылыми вредителями многих видов, включая европейского кукурузного пилильщика (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)) и совку травяную (FAW; Spodoptera frugiperda), и обладает активностью против свекловичного пилильщика (SCB; Diatraea saccharalis). Белок Cry1Fa, продуцирующийся в растениях кукурузы, содержащих TC1507, ответственен за вырабатывание признака резистентности к насекомым, и этот белок применяется в ведущих областях промышленности для борьбы с совкой травяной (FAW). Cry1Fa также используется в продуктах Herculex^®, SmartStax™ и WideStrike™.

Возможность проводить исследование на связывание с рецептором (конкурентное или гомологичное) с использованием белка Cry1Fa имеет определенные ограничения, поскольку при применении большинства методов мечения белков для детектирования в анализах на связывание с рецептором происходит инактивация инсектицидной активности белка Cry1Fa.

Дополнительные токсины Cry перечислены на web-сайте офиса Комитета по номенклатуре B.t. (Crickmore et al; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). В настоящее время известно примерно 60 основных групп токсинов «Cry» (Cry1-Cry59), и кроме того, существуют другие токсины, такие как токсины Cyt и токсины VIP и т.п. Многие токсины из каждой пронумерованной группы имеют подгруппы, обозначенные прописными буквами, а подгруппы, обозначенные прописными буквами, в свою очередь, подразделяются на подгруппы (суб-подгруппы), обозначенные строчными буквами (например, Cry1 имеет подгруппу A-L, а Cry1A имеет подгруппу a-i).

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение частично основано на неожиданном обнаружении того факта, что популяция травяной совки (Spodoptera frugiperda; FAW), отобранная на резистентность к инсектицидной активности белка Cry1Fa, не является резистентной к инсектицидной активности белка Vip3Ab. Рассматриваемая пара токсинов не обладает перекрестной резистентностью по отношению к FAW.

Для специалиста в данной области очевидно, что преимущество такого открытия состоит в том, что растения, экспрессирующие Vip3Ab и Cry1Fa или их инсектицидные части, могут быть использованы для замедления или предупреждения развития резистентности к любому из этих отдельно взятых инсектицидных белков.

Настоящее изобретение также подтверждается обнаружением того факта, что Vip3Ab и Cry1Fa не конкурируют друг с другом за сайты связывания в кишечнике FAW.

Таким образом, настоящее изобретение относится, в частности, к применению белка Vip3Ab в комбинации с белком Cry1Fa. Растения (и площади, засеянные такими растениями), которые продуцируют Vip3Ab плюс Cry1Fa, входят в объем настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится, в частности, к трехкомпонентным кластерам или «пирамидам» из трех (или более) токсинов, где токсины Vip3Ab и Cry1Fa представляет собой базовую пару. В некоторых предпочтительных вариантах пирамиды, выбранный(ые) токсин(ы) не обладает(ют) перекрестной резистентностью по отношению к FAW. Некоторыми предпочтительными белками для этих трехкомпонентных комбинаций пирамиды являются Cry1Fa плюс Vip3Ab плюс Cry1C плюс Cry1D, Cry1Be или Cry1E. В соответствии с настоящим изобретением, эти конкретные трехкомпонентные кластеры, как было неожиданно обнаружено авторами изобретения, преимущественно, не обладают перекрестной резистентностью по отношению к FAW. Это позволяет снизить или вообще избежать потребности в площадях-«убежищах» нетрансгенных культур.

Что касается Cry1Fa, обладающего активностью против FAW и европейского кукурузного пилильщика (ECB), то исходя из представленных здесь данных, можно сделать вывод, что может быть также выбрана кластер-тетрада (из четырех компонентов) для использования четырех белков, где три из этих четырех белков не обладают перекрестной резистентностью по отношению к ЕСВ, и три из этих четырех белков не обладают перекрестной резистентностью по отношению к FAW. Это может быть достигнуто с использованием Cry1Be (обладающего активностью против ЕСВ и FAW) вместе с рассматривамой парой белков плюс один дополнительный белок, обладающий активностью против ЕСВ. Такими кластерами-тетрадами согласно изобретению являются: Cry1F плюс Cry1Be плюс Vip3Ab (активный против FAW) плюс Cry1Ab, Cry2A, Cry1I или DIG-3 (активный против ECB).

Краткое описание графического материала

Фиг. 1. Гистограмма ингибирования роста (столбцы) и гибели насекомых (♦) в зависимости от дозы полноразмерного Vip3Ab1, направленного против Spodoptera frugiperda дикого типа (J.E. Smith), (FAW) и Cry1Fa-резистентной Spodoptera frugiperda (J.E. Smith), (rFAW). Процент ингибирования роста вычисляли путем сравнения средней массы 8 личинок, обработанных только буфером, с массой личинок, обработанных токсином в течение 5 дней.

Фиг. 2. Флуоресцентная визуализация ¹²⁵I-Cry1Fa, связанного с BBMV от S. frugiperda, с последующим разделением с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ. Образцы брали в дубликате. Концентрация ¹²⁵I-Cry1Fa составляла 1 нМ. Контроль означает уровень связывания ¹²⁵I-Cry1Fa с BBMV в отсутствии любого конкурентно связывающегося лиганда. 1000 нМ Cry1Fa означает уровень связывания ¹²⁵I-Cry1Fa с BBMV в присутствии 1000 нМ Cry1Fa, не содержащего радиоактивной метки, где указанный уровень связывания указывает на полное вытеснение радиоактивно меченного лиганда из белка BBMV. 1000 нМ Vip3Ab1 означает уровень связывания ¹²⁵I-Cry1Fa с BBMV в присутствии 1000 нМ Vip3Ab1, не содержащего радиоактивной метки, где указанный уровень связывания указывает на то, что этот белок не обладает способностью вытеснять ¹²⁵I-Cry1Fa из BBMV S. frugiperda даже при концентрации, в 1000 раз превышающей концентрацию радиоактивно меченного лиганда.

Фиг. 3. Флуоресцентная визуализация ¹²⁵I-Cry1Fa, связанного с BBMV S. frugiperda дикого типа (FAW) или Cry1Fa-резистентной S. frugiperda (rFAW), с последующим разделением с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН. Образцы брали в дубликате. Концентрация ¹²⁵I-Cry1Fa составляла 2,5 нМ. FAW-0 означает уровень связывания ¹²⁵I-Cry1Fa с BBMV S. frugiperda дикого типа в отсутствии какого-либо конкурентно связывающегося лиганда. FAW-1000 нМ Cry1Fa означает уровень связывания ¹²⁵I-Cry1Fa с BBMV S. frugiperda дикого типа в присутствии 1000 нМ не меченного радиоактивной меткой Cry1Fa, где такой уровень связывания указывает на вытеснение радиоактивно меченного лиганда из белка BBMV. rFAW-0 означает уровень связывания ¹²⁵I- Cry1Fa с BBMV Cry1Fa-резистентной S. frugiperda в отсутствии любого конкурентно связывающегося лиганда. Следует обратить внимание на отсутствие связывания ¹²⁵I-Cry1Fa с BBMV, происходящими от резистентной FAW. rFAW-1000 нМ Cry1Fa означает уровень связывания ¹²⁵I-Cry1Fa с BBMV в присутствии 1000 нМ Vip3Ab1, не содержащего радиоактивную метку, где такой уровень связывания также указывает на неспособность ¹²⁵I-Cry1Fa связываться с BBMV от Cry1Fa-резистентной S. frugiperda.

Подробное описание изобретения

Как сообщается в настоящей заявке, токсин Vip3Ab, продуцируемый в трансгенной кукурузе и в других растениях (например, в хлопчатнике и сое), обнаруживает высокую эффективность в борьбе против совки травяной (FAW; Spodoptera frugiperda), у которой вырабатывается резистентность к активности Cry1Fa. Таким образом, настоящее изобретение частично основано на неожиданном обнаружении того факта, что совка травяная, резистентная к действию Cry1Fa, является восприимчивой (то есть, не обладает перекрестной резистентностью) к действию Vip3Ab. В соответствии с другим вариантом, настоящее изобретение также частично основано на неожиданном обнаружении того факта, что токсин Vip3Ab является эффективным для защиты растений (таких как растения кукурузы) от поражения Cry1Fa-резистентной совки травяной. Обсуждение этого вредителя приводится, например, в публикации Tabashnik, PNAS (2008), vol. 105 no. 49, 19029-19030.

Настоящее изобретение включает применение токсина Vip3Ab для защиты кукурузы и других экономически ценных видов растений от поражения вредителями, и снижения урожайности, вызываемого поеданием этих растений совкой травяной или популяциями совки травяной, у которых вырабатывается резистентность к Cry1Fa.

Настоящее изобретение также относится к IRM-кластеру, используемому для предупреждения или замедления развития резистентности совки травяной к Cry1Fa.

Настоящее изобретение также относится к композициям, используемым для борьбы с чешуекрылыми вредителями, в клетках которых продуцируется белок, содержащий коровый токсин Cry1Fa, и белок, содержащий коровый токсин Vip3Ab.

Настоящее изобретение также относится к хозяину, трансформированному так, чтобы он продуцировал белок, содержащий коровый токсин Cry1Fa, и белок, содержащий коровый токсин Vip3Ab, где указанным хозяином является клетка микроорганизма или растения. Рассматриваемый(ые) полинуклеотид(ы) предпочтительно присутствует(ют) в генетической конструкции под контролем промотора (функционально присоединенного к промотору или содержащего этот промотор), не являющегося промотором Bacillus thuringiensis. Рассматриваемые полинуклеотиды могут содержать обычно встречающиеся в этом растении кодоны, способствующие повышению уровня экспрессии в растении.

Настоящее изобретение также относится к способу борьбы с чешуекрылыми вредителями, включающему контактирование указанных вредителей или среды их обитания с эффективным количеством композиции, которая содержит белок, включающий коровый токсин Cry1Fa, а также белок, включающий коровый токсин Vip3Ab.

В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к растению кукурузы, включающему экспрессируемый в этом растении ген, который кодирует белок, содержащий коровый токсин Vip3Ab, и экспрессируемый в этом растении ген, который кодирует белок, содержащий коровый токсин Cry1Fa, и к семенам такого растения.

В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к растению кукурузы, где экспрессируемый в этом растении ген, который кодирует белок, содержащий коровый токсин Vip3Ab, и экспрессируемый в этом растении ген, который кодирует белок, содержащий коровый токсин Cry1Fa, были введены в указанные растения кукурузы и в семена таких растений путем интрогрессии.

Как описано в примерах, исследования по конкурентному связыванию, проводимые с использованием радиоактивно меченного белка, содержащего коровый токсин Vip3Ab, показали, что белок, содержащий коровый токсин Cry1Fa, не конкурирует за связывание в тканях насекомого FAW, с которыми связывается Vip3Ab. Полученные результаты также показали, что комбинации белков Cry1Fa и Vip3Ab представляют собой эффективное средство для снижения вырабатывания резистентности популяции FAW к Cry1Fa (и аналогичным образом, вырабатывания резистентности к Vip3Ab), и следовательно, для повышения уровня резистентности растений кукурузы, экспрессирующих оба белка, к этому вредителю. Таким образом, исходя частично из описанных данных, можно сделать вывод, что совместное продуцирование (кластеризация) белков Vip3Ab и Cry1Fa может быть применено в целях получения IRM-кластера с высокой дозой для борьбы с FAW. Что касается Cry1Fa, обладающего активностью против FAW и европейского кукурузного пилильщика (ECB), то рассматриваемая пара токсинов обладает не-конкурентным действием против FAW.

Для расширения спектра действия против насекомых, к этой паре могут быть добавлены и другие белки. В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к применению белков Cry1Fa и Vip3Ab в комбинации с другим третьим токсином/геном, и к применению такого трехкомпонентного кластера для снижения развития резистентности у FAW к любому из этих токсинов. Таким образом, в другом своем варианте, настоящее изобретение относится к применению двух, трех или более белков в сельскохозяйственных регионах, в которых могут развиваться резистентные популяции FAW.

В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится, в частности, к трехкомпонентным кластерам или «пирамидам» из трех (или более) токсинов, где указанные токсины Cry1Fa и Vip3Ab представляют собой базовую пару.

В некоторых предпочтительных вариантах пирамиды, три выбранных белка не обладают перекрестной резистентностью против FAW. Некоторые предпочтительные комбинации пирамид «тройного действия» представляют собой Cry1Fa плюс Vip3Ab плюс любой из Cry1C или Cry1D. См., заявку США рег.№ 61/284281 (поданную 16 декабря, 2009), в которой показано, что Cry1C является активным против Cry1F-резистентной FAW, и заявку США рег.№ 61/284252 (поданную 16 декабря, 2009), в которой показано, что Cry1D является активным против Cry1F-резистентной FAW. В этих двух заявках также показано, что Cry1C не конкурирует с Cry1F за связывание с мембранными препаратами FAW, и что Cry1D не конкурирует с Cry1F за связывание с мембранными препаратами FAW. В некоторых вариантах изобретения, Cry1Be или Cry1E могут быть объединены с Vip3A и Cry1F в качестве третьего белка против FAW. Описание применения Cry1Be вместе с Cry1F можно найти в заявке США рег.№ 61/284290 (поданной 16 декабря, 2009). Описание применения Cry1E вместе с Cry1F можно найти в заявке США рег.№ 61/284278 (поданной 16 декабря, 2009). В соответствии с настоящим изобретением, эти конкретные трехкомпонентные кластеры белков, как было неожиданно обнаружено авторами изобретения, преимущественно не обладают перекрестной резистентностью по отношению к FAW. Это позволяет снизить или вообще избежать потребности в площадях-«убежищах» нетрансгенных культур.

Исходя из представленных здесь данных, можно сделать вывод, что может быть также выбрана кластер-тетрада (из четырех компонентов) для использования четырех белков, где три из этих четырех белков не обладают перекрестной резистентностью по отношению к ЕСВ, и три из этих четырех белков не обладают перекрестной резистентностью по отношению к FAW. Это может быть достигнуто с использованием Cry1Be (обладающего активностью против ЕСВ и FAW) и Cry1Fa (обладающим активностью против ЕСВ и FAW), вместе с рассматривамым Vip3Ab (обладающим активностью против FAW) и с четвертым белком, токсичным по отношению к ЕСВ. (См. заявку США рег.№ 61/284290, поданную 16 декабря, 2009 и относящуются к комбинациям Cry1Fa и Cry1Be). Примерами кластеров-тетрад согласно изобретению являются:

Cry1F плюс Cry1Be плюс Vip3Ab (активный против FAW) плюс Cry1Ab, Cry2A, Cry1I или DIG-3 – все они активны против ECB).

DIG-3 описан в патенте США 2010 00269223.

Растения (и площади, засеянные такими растениями), которые продуцируют любую из рассматриваемых комбинаций белков, входят в объем настоящего изобретения. Могут быть также добавлены дополнительные токсины/гены, и эти конкретные трехкомпонентные кластеры, обсуждаемые выше, будут, как было неожиданно обнаружено, преимущественно действовать против FAW и/или ЕСВ по нескольким механизмам. Это позволяет снизить или избежать потребности в площадях-«убежищах» нетрансгенных культур. Таким образом, в настоящем изобретении рассматривается посевная площадь свыше 10 акров.

Для получения последовательностей любых описанных или упомянутых здесь генов и белков можно также обратиться в GENBANK. См. ниже Приложение A.

В патенте США No. 5188960 и в патенте США No. 5827514 описаны белки, которые содержат коровый токсин Cry1Fa, и которые могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения. В патенте США № 6218188 описаны оптимизированные для растения последовательности ДНК, кодирующие белки, которые содержат коровый токсин Cry1Fa, и которые могут быть использованы в настоящем изобретении.

Cry1Fa также используется в продуктах Herculex^®, SmartStax™ и WideStrike™. Ген vip3Ab может быть введен, например, в продукт Cry1Fa, такой как Herculex^®, SmartStax™ и WideStrike™. В соответствии с этим, применение Vip3Ab позволяет значительно снизить давление отбора на эти и другие промышленные продукты. Таким образом, Vip3Ab может быть использован в комбинации из 3 генов для кукурузы и других растений (например, хлопчатника и сои).

Комбинации белков, описанных в настоящем изобретении, могут быть использованы для борьбы с чешуекрылыми вредителями. Взрослые чешуекрылые, например, бабочки и моли, питаются, главным образом, нектаром и играют значительную роль в опылении. Почти все личинки чешуекрылых, то есть, гусеницы, поедают растения, и многие из них являются опасными вредителями. Гусеницы живут на листьях или поедают внутреннюю часть листьев, либо они повреждают корни или стебли растения, что приводит к истощению питательных веществ у растения, и в большинстве случаев, к разрушению основной физической структуры растения. Кроме того, гусеницы повреждают плоды, ткани и хранящееся зерно и муку, в результате чего продукты либо вообще становятся непригодными для продажи, либо их коммерческая ценность значительно снижается. Используемый здесь термин «чешуекрылые вредители» также относится к различным стадиям жизненного цикла вредителя, включая стадии развития личинок.

Некоторые химерные токсины согласно изобретению содержат полноразмерную часть N-концевого корового токсина Bt, и в определенном положении, расположенном за концом части корового токсина, этот белок переходит в гетерологичную последовательность протоксина. N-концевая, инсектицидно активная часть токсина Bt называется «коровым токсином». Переход от корового сегмента токсина в гетерологичный сегмент протоксина может происходить приблизительно в области стыка токсин/протоксин, или альтернативно, часть нативного протоксина (простирающаяся за пределы коровой части токсина) может сохраняться, причем, переход в гетерологичную часть протоксина может происходить ниже.

В качестве примера может служить один химерный токсин согласно изобретению, который представляет собой полноразмерную часть корового токсина Cry1Fa (примерно первые 600 аминокислот) и гетерологичный протоксин (остальной белок до С-конца). В одном предпочтительном варианте изобретения, часть химерного токсина, содержащая протоксин, происходит от токсина белка Cry1Ab. В предпочтительном варианте изобретения, часть химерного токсина, содержащая протоксин, происходит от токсина белка Cry1Ab.

Для специалистов в данной области очевидно, что токсины Bt, даже токсины, принадлежащие к определенному классу, такому как Cry1F, могут до некоторой степени варьироваться по своей длине и точной локализации перехода от части корового токсина в часть протоксина. Обычно, токсин Cry1Fa имеет длину примерно от 1150 до 1200 аминокислот. Переход от части корового токсина в часть протоксина обычно происходит на участке между частями, составляющими примерно от 50% и примерно до 60% от всей длины токсина. Химерный токсин согласно изобретению включает полноразмерную область N-концевой части корового токсина. Таким образом, химерный токсин содержит по меньшей мере примерно 50% полноразмерного белка Cry1Fa токсина Bt. Этот белок имеет длину, обычно составляющую по меньшей мере примерно 590 аминокислот. Что касается части протоксина, то полноразмерная область части протоксина Cry1Ab простирается от конца части корового токсина до С-конца молекулы.

Гены и токсины. Гены и токсины, используемые в настоящем изобретении, включают не только описанные здесь полноразмерные последовательности, но также и фрагменты этих последовательностей, варианты, мутанты и гибридные белки, которые сохраняют характерную пестицидную активность токсинов, конкретно описанных в настоящей заявке. Используемые здесь термины «варианты» или «модификации» генов означают нуклеотидные последовательности, которые кодируют те же самые токсины или токсины, эквивалентные токсинам, обладающим пестицидной активностью. Используемый здесь термин «эквивалентные токсины» означает токсины, обладающие такой же или, по существу, такой же биологической активностью против вредителей-мишеней, как и заявленные токсины.

Используемые здесь пределы идентичности составляют приблизительно 95% (Cry1F и Vip3Ab), 78% (Cry1F и Vip3Ab) и 45% (Cry1 и Vip3) в соответствии с «изменениями номенклатуры для пестицидных кристаллических белков Bacillus thuringiensis» («Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins», N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813). Такие пределы могут быть также применены только для коровых токсинов (например, для Cry1Fa).

Для специалистов в данной области очевидно, что гены, кодирующие активные токсины, могут быть идентифицированы и получены несколькими способами. Специфические гены или части генов, описанные в настоящей заявке, могут быть получены из изолятов, депонированных в депозитариях культур. Эти гены или их части или варианты могут быть также сконструированы путем синтеза, например, на синтезаторе генов. Варианты генов могут быть легко сконструированы стандартными методами получения точковых мутаций. Кроме того, фрагменты этих генов могут быть получены с использованием коммерчески доступных экзонуклеаз или эндонуклеаз в соответствии со стандартными процедурами. Так, например, для систематического отщепления нуклеотидов от концов этих генов могут быть использованы ферменты, такие как Bal31, либо может быть применен сайт-направленный мутагенез. Гены, кодирующие активные фрагменты, могут быть также получены с использованием различных рестриктирующих ферментов. Для непосредственного получения активных фрагментов этих белков-токсинов могут быть использованы протеазы.

Фрагменты и эквиваленты, которые сохраняют пестицидную активность описанных здесь токсинов, входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, вследствие избыточности генетического кода, ряд различных последовательностей ДНК может кодировать описанные здесь аминокислотные последовательности. Специалист в данной области может легко получить такие альтернативные последовательности ДНК, кодирующие те же самые или, по существу, те же самые токсины. Такие варианты последовательностей ДНК входят в объем настоящего изобретения. Используемый здесь термин «по существу, те же самые» последовательности означает последовательности, имеющие аминокислотные замены, делеции, добавления или инсерции, которые фактически не оказывают влияния на пестицидную активность. В это определение также входят фрагменты генов, кодирующих белки, сохраняющие пестицидную активность.

Другим методом идентификации генов, кодирующих токсины и части генов, используемых в настоящем изобретении, является применение олигонуклеотидных зондов. Такими зондами являются детектируемые нуклеотидные последовательности. Эти последовательности могут быть детектированы с помощью соответствующей метки, либо они могут быть изначально сделаны флуоресцентными, как описано в Международной заявке No. WO93/16094. Специалистам хорошо известно, что если молекула-зонд и образец нуклеиновой кислоты гибридизуются посредством образования прочной связи между двумя молекулами, то разумно предположить, что такой зонд и образец будут обладать значительной гомологией. Гибридизацию, предпочтительно, проводят в жестких условиях с применением методов, хорошо известных специалистам, например, описанных Keller, G. Н., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Ниже приводятся некоторые примеры комбинаций концентраций соли и температур (в порядке возрастания жесткости): 2 х SSPE или SSC при комнатной температуре; 1 х SSPE или SSC при 42°C; 0,1 х SSPE или SSC при 42°C; 0,1 х SSPE или SSC при 65°C. Детектирование зонда представляет собой известный метод, применяемый для того, чтобы определить, происходит гибридизация или нет. Такой анализ с использованием зонда представляет собой быстрый метод идентификации токсин-кодирующих генов согласно изобретению. Нуклеотидные сегменты, используемые в качестве зондов согласно изобретению, могут быть синтезированы на синтезаторе ДНК в соответствии со стандартными процедурами. Эти нуклеотидные последовательности могут быть также использованы в качестве ПЦР-праймеров для амплификации генов согласно изобретению.

Варианты токсинов. Некоторые токсины согласно изобретению конкретно описаны в настоящей заявке. Поскольку эти токсины приводятся здесь просто в качестве примеров токсинов согласно изобретению, то следует отметить, что настоящее изобретение включает варианты токсинов или эквивалентные токсины (и нуклеотидные последовательности, кодирующие эквивалентные токсины), обладающие такой же пестицидной активностью, как и представленный здесь токсин, или аналогичной активностью. Эквивалентные токсины имеют аминокислотную последовательность, гомологичную аминокислотной последовательности представленного здесь токсина. Такая гомология аминокислотных последовательностей обычно составляет более чем 75%, предпочтительно, более чем 90%, а наиболее предпочтительно, более, чем 95%. Гомология аминокислотных последовательностей является наивысшей в критических областях токсина, ответственных за биологическую активность или определяющих трехмерную конфигурацию, которая, в конечном счете, ответственна за биологическую активность. В соответствии с этим, некоторые аминокислотные замены являются допустимыми и могут присутствовать в тех областях, которые не играют важной роли в сообщении активности, или являются консервативными аминокислотными заменами, которые не влияют на трехмерную конфигурацию молекулы. Так, например, аминокислоты могут быть подразделены на следующие классы: неполярные, незаряженные полярные, основные и кислотные. Таким образом, при консервативных заменах, аминокислоту одного класса заменяют другой аминокислотой того же типа, и такая замена входит в объем настоящего изобретения, при условии, что она, фактически, не будет влиять на биологическую активность соединения. Ниже представлен список примеров аминокислот, принадлежащих к каждому классу.

Таблица 1
Класс аминокислот	Примеры аминокислот
Неполярные	Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp
Незаряженные полярные	Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
Кислотные	Asp, Glu
Основные	Lys, Arg, His

В некоторых случаях могут быть также сделаны неконсервативные замены. Важным фактором является то, что такие замены не должны значительно снижать биологическую активность токсина.

Рекомбинантные хозяева. Гены, кодирующие токсины согласно изобретению, могут быть введены микробным или растительным хозяевам широкого ряда. Экспрессия гена токсина приводит, прямо или опосредованно, к продуцированию пестицида внутри клеток и к его сохранению в этих клетках. Для получения штамма Bt, экспрессирующего оба токсина согласно изобретению, может быть применен конъюгативный и рекомбинантный перенос. Другие организмы-хозяева могут быть также трансформированы одним или обоими генами токсинов, используемыми для достижения синергического эффекта. С использованием подходящих микробов-хозяев, например, Pseudomonas, эти микробы могут быть внесены в места обитания вредителей, где они могут размножаться и поедать эти микробы. Это будет приводить к уничтожению вредителей. Альтернативно, микроб, содержащий ген токсина, может быть обработан в условиях, способствующих пролонгированию активности токсина и стабилизации клетки. Обработанная клетка, которая сохраняет токсическую активность, может быть затем внесена в среду обитания вредителей-мишеней.

Если ген токсина Bt вводят микробу-хозяину посредством подходящего вектора, и если указанный хозяин вносят в среду обитания в живом виде, то важно, чтобы были использованы определенные микробы-хозяева. При этом, выбирают такие микроорганизмы-хозяева, которые, как известно, занимают определенную «фитосферу» (филлоплан, филлосферу, ризосферу и/или ризоплан) одного или нескольких представляющих интерес культур. Эти микроорганизмы выбирают так, чтобы они обладали способностью успешно конкурировать в конкретных условиях (в культуре и в другой среде обитания насекомых) с микроорганизмами дикого типа, и обеспечивали стабильное сохранение и экспрессию генов, кодирующих полипептид-пестицид, а желательно, лучшую защиту пестицида от разрушения и инактивации в условиях окружающей среды.

Известно, что большое число микроорганизмов обитает на филлоплане (на поверхности листьев растений) и/или на ризосфере (в почве, окружающей корни растений) ценных сельскохозяйственных культур широкого ряда. Такими микроорганизмами являются бактерии, водоросли и грибы. Особый интерес представляют такие микроорганизмы, как бактерии, например, бактерии рода Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc и Alcaligenes; грибы, а в частности, дрожжи, например, дрожжи рода Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula и Aureobasidium. Особый интерес представляют такие виды бактерий фитосфер, как Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus и Azotobacter vinlandii; и дрожжей-фитосфер, таких как Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae и Aureobasidium pollulans. Особый интерес представляют пигментированные микроорганизмы.

Для введения гена Bt, кодирующего токсин, микроорганизму-хозяину в условиях, обеспечивающих стабильное сохранение гена и стабильную экспрессию гена, могут быть применены методы широкого ряда. Такие методы хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, в патенте США No. 5135867, который вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Обработка клеток. Bacillus thuringiensis или рекомбинантные клетки, экспрессирующие токсины Bt, могут быть обработаны в целях пролонгирования активности токсина и стабилизации клеток. Образующаяся пестицидная микрокапсула содержит токсин или токсины Bt в клеточной структуре, которая стабилизирует и защищает токсин в случае, когда эту микрокапсулу вносят в среду обитания вредителя-мишени. Подходящими клетками-хозяевами могут быть прокариоты или эукариоты, и такими клетками обычно являются, но не ограничиваются ими, клетки, которые не продуцируют вещества, являющиеся токсичными для высших организмов, таких как млекопитающие. Однако могут быть также использованы микроорганизмы, которые продуцируют вещества, токсичные для высших организмов, но, при этом, эти токсические вещества являются нестабильными, или уровень их введения является достаточно низким, что исключает возможность какого-либо токсического воздействия на млекопитающего-хозяина. В качестве хозяев, особый интерес представляют прокариоты и низшие эукариоты, такие как грибы.

Обрабатываемые клетки обычно являются интактными и, по существу, находятся в пролиферативной форме, а не в форме спор, хотя, в некоторых случаях могут использоваться и споры.

Обработка микробных клеток, например, микробов, содержащих ген или гены токсина B.t., может быть осуществлена химическими и/или физическими методами, или комбинацией химических и физических методов, при условии, что такой метод не будет оказывать негативного влияния на свойства токсина и не будет приводить к снижению способности клеток защищать токсин. Примерами химических реагентов являются галогенирующие агенты, а в частности, галогены с атомными номерами 17-80. Более конкретно, может быть использован йод в мягких реакционных условиях в течение определенного периода времени, достаточного для достижения желаемых результатов. Другими подходящими м