Гиалуронидаза и способ ее применения

Гиалуронидаза и способ ее применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА ПРЕДШЕСТВУЮЩУЮ ЗАЯВКУ

[001] Настоящая заявка испрашивает приоритет в соответствии со сводом законов США 35 §119 согласно предварительной заявке на патент США №60/945037, поданной 19 июня 2007 г., которая полностью включена в настоящее описание посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[002] Настоящее изобретение относится к гиалуронидазе. Изобретение также относится к способам применения гиалуронидазы для изменения свойств кожи или соединительной ткани.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[003] Все публикации и справочные материалы, указанные в настоящем описании, полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

[004] Семейство фермента гиалуронидазы включает ферменты, способные к гидролизации или «разложению» гиалуроновой кислоты полисахарида. Гиалуроновая кислота является важным компонентом соединительной ткани. Таким образом, гиалуронидазы, способные быстро распространяться и диффундировать через ткани, могут изменять проницаемость и вязкость межклеточного цемента, гидролизируя гиалуроновую кислоту.

[005] Гиалуронидазы можно обнаружить в различных тканях животных, например в тестикулярной и селезеночной ткани млекопитающих, в змеином яде и некоторых видах стрептококка и стафилококка. В основном семейство фермента включает три основные группы: тестикулярный тип (гиалуроноглюкоронидаза) (Международный союз биохимиков и молекулярных биологов (IUMB) №ЕС 3.2.1.35); пиявочный тип (гиалуроноглюкоронидаза) (Международный союз биохимиков и молекулярных биологов (IUMB) E.C. 3.2.1.36); и бактериальный тип (гиалуронат лиаза) (Международный союз биохимиков и молекулярных биологов (IUMB) E.C. 4.2.2.1). Между этими группами существует химические и биологические различия, например, в отношении специфичности к субстрату, оптимального значения рН, стабильности в водных и неводных растворах и термоустойчивости. Например, многие бактериальные гиалуронидазы активны только по отношению к гиалуроновой кислоте или гиалуронату, в то время как тестикулярные гиалуронидазы гидролизируют как гиалуроновую кислоту, так и другие мукополисахариды (хондроитин, хондроитинсульфат). Однако существуют еще большее разнообразие в пределах каждой группы, частично в связи с источником фермента.

[006] Различные гиалуронидазы и способы их приготовления и применения известны в соответствующей области техники (Linker A., Hyaluronidase. In: Methods of enzymatic analysis, Eds. Bergmeyer HU, Bergmeyer J, Grasi M, Verlag Chemie Gmbh, Weinheim, 1984, pp.256-262; King TP, Spangfort MD, Int Arch Allergy Immunol. 2000 Oct; 123(2):99-106; Jedrzejas MJ, Crit Rev Biochem Mol Biol, 2000; 35(3):221-51; Hynes WL, Walton SL, FEMS Microbiol Lett. 2000 Feb 15; 183(2):201-7; Menzel EJ, Farr С; Cancer Lett 1998; 131(1):3-11). Например, патент США №4258134 относится к гиалуронидазе, полученной из Streptomyces koganeiensis, имеющей оптимальную активность при рН приблизительно 4.0; а японские патенты №№63044883 и 62104579 описывают гиалуронидазу из Streptococcus dysgalactiae, которая представляет собой фермент, имеющий молекулярный вес приблизительно 80 кД и оптимальный диапазон рН от 5.8 до 6.6, ингибируемый Fe2+ и Cu2+. Патент Российской Федерации №2005488 описывает препарат гиалуронидазы из Streptomyces actinocidus, именуемый актиногиалом, который имеет оптимальное значение рН, составляющее приблизительно 6.5, и удельную активность приблизительно 30-40 МЕ/мг. Что касается гиалуронидазы небактериального происхождения, патенты США №№4904594 и 5061627 описывают препараты гиалуронидазы из криля и других ракообразных; патент США №5593877 рассматривает гиалуронидазы и другие белки из нуклеиновых кислот яда насекомых семейства Vespidae; патенты США №№5747027 и 5827721 описывают очищенную гиалуронидазу, полученную от млекопитающих; а патент США №5854046 и международная публикация РСТ WO 99/29841 описывают гиалуронидазу человека.

[007] Способы получения и очистки гиалуронидаз из различных источников описаны, например, в патенте США 4410531, раскрывающем способ очистки фермента из сырьевого препарата гиалуронидазы; в швейцарском патенте №СН628088, предоставляющем способ очистки гиалуронат лиазы и других белков из культур стрептококков; а также в патенте США 1060513, описывающем способ приготовления гиалуронидазы из органов животных. См. также SU 1723121. Патент США №4897349 описывает способ увеличения микробного биосинтеза гиалуронидазы посредством регулирования концентрации кислорода. Различные типы гиалуронидазы могут быть коммерчески доступны, например, в следующих компаниях: Wyeth-Ayerst (Wydase®), Abbot (Hyazyme), Bristol-Myers Squibb (Enzodase) и Ortho Pharmaceuticals (Diffusin).

[008] Одним из полезных свойств гиалуронидазы является то, что она может снизить формирование рубцовой ткани различных этиологии и «смягчить» кожу. Например, способы растворения рубцовой ткани млекопитающих посредством введения гиалуронидазы и коллагеназы в пораженные ткани раскрыты в патентах США №№4524065 и 46456684; а способы улучшения проникновения через кожу различных препаратов для местного применения были описаны в международной публикации РСТ WO 00/38732; WO 01/45743; и в патенте Германии №19963538. Посредством местного или парентерального применения гиалуронидазы также можно стимулировать диффузию веществ для местного применения и инъецируемых веществ. Это подтверждено клинически в случае, когда гиалуронидазы применяли для облегчения распределения препаратов или биологических агентов, обычно в коже (Nara et al., Chem Pharm Bull (Tokyo) 1992; 40:737-40; Costello and Jeske, Phys Ther 1995; 75:554-63; Laugier, Br J Dermatol 2000 Feb; 142(2):226-33).

[009] Также было показано, что гиалуронидазы пригодны для широкого применения в медицине, включая блокирование инвазии лимфатического узла опухолевыми клетками (международная публикация РСТ WO 95/30439); лечение сосудистых заболеваний (немецкий патент №19860541 и патент США №4568543) и предстательной гипертрофии (патент США №5116615); вакцинацию против гельминтозной инфекции (патент США №5811100); и различные офтальмологические применения (патент США №№5292509; 5856120 и 5866120). Например, гиалуронидаза использовалась для снижения внутриглазного давления у пациентов, страдающих глаукомой, посредством разложения гиалуронана в пределах стекловидного тела (патент США №4820516).

[0010] Гиалуронидаза также применялась в терапии рака в качестве «лиофилизирующего агента» для усиления эффективности химиотерапии и/или доступности опухолей для химиотерапии (Schuller et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 1991; 32:173, abstract no. 1034; Czejka et al., Pharmazie 1990; 45:H.9), а также использовалась в комбинации с другими химиотерапевтическими средствами в лечении различных видов рака, включая рак мочевого пузыря (Horn et al., 1985, J. Surg. Oncol., 2:304-307), плоскоклеточный рак (Kohno et al., 94, J. Cancer Res. Oncol., 120:293-297), рак молочной железы (Beckenlehner et al., 1992, J. Cancer Res. Oncol. 118:591-596) и рак желудочно-кишечного тракта (Scheithauer et al., 1988, Anticancer Res. 8:391-396). Прием гиалуронидазы также вызывает реактивность ранее устойчивых к химиотерапии опухолей поджелудочной железы, желудка, толстой кишки, яичников и молочной железы (Baumgartner et al., Reg. Cancer Treat. 1988; 1:55-58; Zanker et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 1986; 27:390). Кроме того, сывороточная гиалуронидаза предотвращает рост опухолей, пересаженных мышам (De Maeyer et al., Int. J. Cancer 1992; 51:657-660), в то время как инъекция гиалуронидазы ингибирует образование опухоли, вызванное воздействием канцерогенных веществ (Pawlowsli et al., Int. J. Cancer 1979; 23:105-109; Haberman et al., Proceedings of the 17th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, Washington, D.C., 1981; 22:105, abstract no.415). Внутривенная или внутримышечная инъекция гиалуронидазы также эффективна при лечении рака мозга (глиомы) (опубликованная заявка согласно РСТ №W088/02261).

[0011] Несмотря на то что существует огромное количество действующих и потенциальных терапевтических и косметических применений гиалуронидазы, остается проблема, заключающаяся в том, что в настоящее время доступные гиалуронидазы обычно являются химически и термически неустойчивыми, они часто имеют значительную неспецифическую активность и демонстрируют пиковую активность при кислом значении рН, обладая, таким образом, субоптимальными свойствами для применений в условиях in vivo. Поэтому в данной области техники существует потребность в получении препаратов гиалуронидазы, которые являются устойчивыми в различных составах и демонстрируют большой запас устойчивости и активность при физиологических температурах и рН. Настоящее изобретение относится к этим и другим потребностям в соответствующей области техники.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0012] Было обнаружено, что гиалуронидаза, выделенная из штамма Streptomyces actinocidus, имеет важные преимущества по сравнению с гиалуронидазой, описанной ранее в данной области техники. Выделенный фермент согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит димер из двух симметричных фрагментов, при этом С-концевой последовательностью является последовательность GDPXNSLSPALFYGD (SEQ ID NO:1) или функционально-консервативный вариант этой последовательности. В одном примере осуществления гиалуронидаза также содержит последовательность аминокислот (D/G)NGEYTLYTSPAQFY (SEQ ID NO:2) или функционально-консервативный вариант этой последовательности. В изобретении также предложена гиалуронидаза, содержащая последовательность полноразмерной Streptomyces actinocidus.

[0013] Соответственно, в изобретении предложена выделенная гиалуронидаза, содержащая последовательности SEQ ID NO:1 и/или SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:4. В одном примере осуществления гиалуронидаза представляет собой полноразмерную гиалуронидазу «дикого типа», имеющую одну или более физико-химических, структурных, функциональных или иммунологических характеристик. В другом примере осуществления гиалуронидаза представляет собой вариант полноразмерного фермента «дикого типа», обладающий одной или более физико-химических, структурных, функциональных или иммунологических характеристик полноразмерного фермента «дикого типа» и включающий SEQ ID NO:1 или функционально-консервативный вариант этой последовательности и/или SEQ ID NO:2 или функционально-консервативный вариант этой последовательности и/или SEQ ID NO:4 или функционально-консервативный вариант этой последовательности.

[0014] В изобретении также предложены композиции, содержащие фермент согласно изобретению. Такие композиции включают, без ограничения, составы, пригодные для медицинских, фармацевтических и косметических применений. Композиции согласно изобретению могут также состоять из одного или более лекарственных средств, стабилизаторов или эксципиентов. Предпочтительными примерами лекарственных средств и стабилизаторов, соответственно, но без ограничений, являются гидрокортизон и маннит (маннитол). Предпочтительными составами являются составы, содержащие соответствующие топические носители для мазей, косметических кремов, вязких составов или гелей. Другие предпочтительные композиции включают трансдермальные пластыри, повязки, прокладки или тампоны, включающие фермент с лекарственным средством или без лекарственного средства.

[0015] Кроме того, в изобретении предложены способы применения фермента по изобретению для различных косметических и лечебных целей, включая, но без ограничения, сокращение и предотвращение образования складок и рубцов; усиление проникновения препаратов в ткани или через кожу; снижение дискомфорта от ревматического артрита, склеродермии, тендосиновита или тендовагинита; способствование уменьшению хронического влагалищного воспаления после хирургического и консервативного лечения; и в качестве пред- или послеоперационного лечения совместно с пластической хирургией для получения лучшего результата.

[0016] Вышеупомянутые признаки и множество других сопутствующих преимуществ изобретения становятся более понятыми благодаря следующему подробному описанию совместно с сопутствующими фигурами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[0017] Фигуры 1А и 1В. Приготовление гиалуронидазы из культуры Sireplomyces actinocidus. (А) Эта Фигура показывает три различные схемы очистки для производства микробной гиалуронидазы согласно изобретению. Преципитация в этаноле и аэрозольная сушка с последующей серией этапов хроматографии и фильтрации позволяют создать препараты, как правило, пригодные для приготовления чистого фермента для общих экспериментальных целей, в то время как окисление фильтрованной питательной среды для культур с последующими этапами адсорбции и фильтрации позволяет получить препарат гиалуронидазы, пригодный для применения в медицине, то есть фармацевтические препаратоы. (В) Эта Фигура показывает альтернативный способ очистки, который может привести к созданию химически чистой гиалуронидазы с активностью приблизительно 162 ME на мг белка.

[0018] Фигура 2. Определение молекулярного веса гиалуронидазы посредством гель-фильтрации. Колонка 1×50, биогель Р-100, PBS 0.05, рН 6.5, 5 мг/мл, 10 мл/ч.

[0019] Фигура 3. Изоэлектрическое фокусирование микробной гиалуронидазы (10 мг) при градиенте рН 4-6. Пунктирная линия представляет абсорбцию 280 им. Треугольники представляют активность гиалуронидазы.

[0020] Фигуры 4А и 4В. Электрофореграмма гомогенной гиалуронидазы, полученной из Streptomyces. (A) 150 мкг белка без добавления додецилсульфат натрия и меркаптоэтанола; (В) 80 мкг белка с добавлением додецилсульфат натрия и меркаптоэтанола.

[0021] Фигура 5. Воздействие рН на активность гиалуронидазы.

[0022] Фигура 6. Исследование кажущихся констант диссоциаций гиалуронидазы.

[0023] Фигура 7. Стабильность гиалуронидазы (5×10-4 г/мл) при температуре 20°С и различном значении рН. (1) рН 6.0; (2) рН 7.0; (3) рН 8.0; (4) рН 9.0; (5) рН 10.0; (6) рН 11.0; (7) рН 5.0; (8) рН 12.0; (9) рН 4.0; (10) рН 3.0.

[0024] Фигура 8. Оптимальные температурные условия для активности гиалуронидазы (0.01 М PBS, рН 6.5).

[0025] Фигура 9. Термоустойчивость гиалуронидазы (раствор; 6.5). 1 - 20°С; 2 - 30°С; 3 -40°С; 4 - 50°С; 5 - 60°С; 6 - 70°С.

[0026] Фигура 10. Скорость гидролиза гиалуроновой кислоты (1) и хондроитинсульфатов А, В, С (2) под действием гиалуронидазы.

[0027] Фигура 11. Зависимость гидролиза гиалуроновой кислоты от концентрации субстрата (фермент: 0,5 мг/мл; 0.1 М PBS, рН 6.5).

[0028] Фигура 12. Гель-фильтрация продуктов гидролиза после ферментного гидролиза гиалуроновой кислоты.

[0029] Фигура 13. Изменения уровня гидрокортизона в плазме после применения мази.

[0030] Фигура 14. Влияние па развитие отека от мазей без гиалуронидазы и с различными количествами гиалуронидазы в различные моменты времени после применения.

[0031] Фигура 15. Информация об объединенной последовательности, полученная с использованием дегенеративных праймеров для ПЦР и ДНК Streplomyces actinocidus. Белковая трансляция показана на основе последовательности ДНК. Последовательности праймеров показаны в малом случае; прямой праймер - основы 1-38; обратный 2 - основы 421-449; обратный 3 - основы 256-276; и обратный 4 - основы 277-306.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0032] В настоящем изобретении предложена гиалуронидаза или гиалуронат лиаза, которая может продуцироваться штаммом Streptomyces actinocidus 77, депонированным в Центральном музее производственных микроорганизмов 6 ноября 1980 г. под номером СМРМ S-560. Другой штамм Streptomyces actinocidus, обозначенный как 150, был также идентифицирован и депонирован под номером СМРМ S-561.

[0033] Как показано в примерах, фермент по изобретению обладает многими преимуществами по сравнению с другими гиалуронидазами, известными в данной области техники. Эти преимущества включают (1) высокую удельную активность; (2) высокую селективность по отношению к гиалуронату; (3) оптимальную активность близкую к физиологическому значению рН; (4) высокую растворимость в физиологическом растворе; (5) высокую устойчивость при комнатной температуре; и (6) низкую токсичность. Кроме того, фермент по изобретению продуцируется в невирулентном, непатогенном бактериальном штамме и может быть приготовлен в форме с очень высокой степенью очистки при умеренных затратах. Действие гиалуронидазы может существенно изменить проницаемость ткани, размягчить рубцы, улучшить подвижность суставов и снизить или предотвратить контрактуры. Как показано в примерах, этот бактериальный фермент также является менее токсичным, чем препарат тестикулярной гиалуронидазы, обычно используемой во врачебной практике.

[0034] Гиалуронидаза согласно изобретению имеет широкий диапазон применения. Достоинства изобретения, включая высокую удельную активность, улучшенную рН-стабильность и/или высокую термоустойчивость, позволяют применять его для обеспечения улучшенной доставки лекарственного средства из различных активных веществ для снижения дозы лекарственного средства с поддержанием эффективности или для разработки нетрадиционных способов доставки лекарственного средства. Неограничивающие примеры применения описанной в настоящей заявке гиалуронидазы включают следующее: (1) применение в различных трансдермальных пластырях в качестве компонента лекарственной композиции для повышения эффективности проникновения лекарственного средства и обеспечения непрерывной постоянной доставки лекарства (например, доставка стероидов через кожу вместо перорального или парентерального введения); (2) для трансдермальной (через кожу) или трансмукозальной (через слизистую оболочку) доставки лекарства, например, инсулина; (3) для облегчения проникновения, повышения эффективности или снижения необходимого количества активного вещества в противогрибковых медицинских средствах (мази, порошки и т.д.); (4) для облегчения проникновения антибиотиков в зону поражения посредством местной доставки или обеспечения постоянной устойчивой концентрации в крови антибиотиков, вводимых трансдермально или трансмукозально; (5) в лекарственных средствах активных веществ для стимулирования или подавления роста волос для местного применения; (6) для лечения хронических кожных воспалительных процессов, когда доставка медицинского средства через кровь вызывает затруднения, например, вследствие образования капсулы; (7) для повышения эффективности местных анестезирующих средств; (8) для повышения эффективности противопсориазных препаратов; (9) для повышения эффективности противозудных препаратов; (10) для повышения эффективности препаратов, применяемых для лечения предопухолевых состояний или рака шеи посредством местного применения; (11) в вагинальных свечах для лечения, например, глубокой молочницы влагалища; (12) при лечении репродуктивных проблем (например, импрегнация яйцеклетки, имплантация яйцеклетки, сальпингит и т.д.); (13) для лечения патологий, сопровождаемых образованием капсулы, для облегчения доставки лекарства через капсулу; или (14) в онкологии для повышения эффективности противораковой терапии, например, при меланоме.

Определения

[0035] Термин «действующий агент» или «активное вещество» включает фармакологические, косметические или биологически активные компоненты и относится к любому химическому или биологическому материалу, который производит желаемый эффект. Действующий агент согласно изобретению также включает гиалуронидазу, которая может производить желаемые эффекты, такие как, например, изменение проницаемости кожи или снижение степени формирования рубцов.

[0036] Термин «лекарственное средство», означает любой и все действующие агенты, не включая гиалуронидазу. Неограниченные примеры лекарственных средств включают противовоспалительные агенты, противогрибковые агенты, химиотерапевтические агенты, антибиотики, антимикробные агенты, противовирусные агенты, гормоны, такие как инсулин, усилители роста кожи, включая усилители роста волос и ногтей, средства ухода за волосами, противопсориазные агенты, ретиноиды, противоугревые лекарства, противоопухолевые агенты, местные анестетики, фототерапевтические агенты, солнцезащитные средства, агенты для защиты кожи, альфа-оксикислоты (включая молочную кислоту и гликолевую кислоту), репелленты и т.п.

[0037] Термин «эффективное количество» активного агента относится к нетоксичному, но достаточному количеству активного агента для обеспечения желаемого эффекта и действия при обоснованном соотношении пользы/риска, применяя любое консервативное лечение. Эффективное количество соединения может быть первоначально оценено либо в ходе проведения анализов культуры клеток, либо на животных моделях, обычно на мышах, кроликах, собаках или свиньях. Животная модель также используется для достижения желаемого диапазона концентраций и способа введения. Затем такая информация может использоваться для определения пригодных доз и способов введения для людей. Эффективность и токсичность соединения могут быть определены в соответствии со стандартными фармацевтическими процедурами в культурах клеток или подопытных животных, например, ED50 (доза, приводящая к желаемому эффекту у 50% популяции) и LD50 (смертельная доза для 50% популяции). Фармацевтически пригодная доза предпочтительно находится в пределах диапазона, который включает ED50 с небольшой или отсутствующей токсичностью. Доза варьируется в зависимости от заболевания или состояния, подлежащего лечению или предотвращению, используемой формы дозы, чувствительности пациента и способа введения. Точная доза выбирается отдельным врачом в зависимости от пациента, проходящего лечение.

[0038] Термин «носитель», используемый в настоящем описании, относится к среде, пригодной для введения активных агентов, и включает любой жидкий или нежидкий растворитель, разбавитель или подобный материал, известный в косметических и лекарственных областях техники, для приготовления любого жидкого или полутвердого геля, крема, мази, эмульсии, аэрозоля, пены, лосьона или подобного средства, которая при этом не оказывает неблагоприятного воздействия на живую животную ткань или не взаимодействует с другими компонентами композиции неблагоприятным образом. Топические носители используются для обеспечения композиций по изобретению в их предпочтительной жидкой или нетвердой форме. Неограничивающие примеры соответствующих топических носителей для применения в этом случае включают воду, жидкие спирты, жидкие гликоли, жидкие белковые гидролизаты, жидкий ланолин и производные ланолина, а также подобные материалы и их смеси.

[0039] Термин «около» или «приблизительно» означает нахождение в рамках приемлемых границ погрешности для конкретного значения, определяемых среднему специалисту в данной области техники, которые будут частично зависеть от того, как выполняется измерение или определение значения, то есть от ограничивающих условий измерительной системы. Например, «около» может означать диапазон до 20%, предпочтительно до 10%, более предпочтительно до 5% и еще более предпочтительно до 1% данного значения. В качестве альтернативы, особенно в отношении биологических систем или процессов, этот термин может означать нахождение в рамках порядка величины, предпочтительно в пределах 5-кратного и более предпочтительно в пределах 2-кратного значения.

Молекулярная биология

[0040] В соответствии с настоящим изобретением можно применять традиционную молекулярную биологию, микробиологию и рекомбинантные методики ДНК в рамках уровня знаний в данной области техники. Такие методики полностью описаны в литературе. См., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (herein "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N.Glover ed. 1985); Oligonucleolide Synthesis (M.J.Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. (1985)); Transcription And Translation (B.D.Hames & S.J.Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R.I.Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (1RL Press, (1986)); В.Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M.Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994). Представленное здесь значение некоторых важных терминов объясняется ниже.

[0041] Термин «субстрат» означает любое вещество или соединение, которое преобразуется или должно быть преобразовано в другое соединение под действием фермента. Этот термин также включает комбинации соединений, такие как растворы, смеси и другие материалы, которые содержат, по меньшей мере, один субстрат. Предпочтительными субстратами для гиалуронидазы является гиалуроновая кислота и гиалуронат.

[0042] «Нативный» белок фермент, полинуклеотид, ген или клетка или белок фермент, полинуклеотид, ген или клетка «дикого типа», означают белок, фермент, полинуклеотид, ген или клетку, которые встречаются в природе.

[0043] «Полноразмерный» фермент означает фермент, который включает все аминокислотные остатки, закодированные кодирующей областью соответствующего гена.

[0044] «Вариант» полноразмерной гиалуронидазы, гиалуронидазы «дикого» типа может иметь последовательность аминокислоты, которая отличается одной или более заменами, делениями или вставками аминокислот. Варианты также включают фрагменты, предпочтительно фрагменты, которые включают, по меньшей мере, 5, более предпочтительно по меньшей мере 50 и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 100 последовательных аминокислот фермента «дикого» типа. Замена (также известная как «мутация») может являться «функционально-консервативной». Руководство по определению, какие и сколько аминокислотных остатков может быть заменено, вставлено или удалено без отмены биологической или иммунологической активности, может быть найдено при помощи компьютерной программы, хорошо известной в данной области техники, например, посредством программного обеспечения DNAStar.

[0045] «Функционально-консервативный вариант» является белком или ферментом, в котором данный аминокислотный остаток был изменен без изменения всей структуры и функции белка или фермента, включая, но не ограничиваясь указанными, замещение аминокислоты аминокислотой, имеющей подобные свойства, включая полярную или неполярную характеристику, размер, форму и заряд. Некоторые выбранные свойства встречающихся в природе аминокислот приведены ниже.

Аминокислота	SLC	Свойство боковой цепи
Изолейцин	I	Гидрофобность
Лейцин	L	Гидрофобность
Валин	V	Гидрофобность
Фенилаланин	F	Ароматическая боковая цепь
Метионин	М	Серная группа
Цистеин	С	Серная группа
Аланин	А	Гидрофобность
Глицин	G	Гидрофобность
Пролин	Р	Вторичный амин
Треонин	Т	Алифатический гидроксил
Серин	S	Алифатический гидроксил
Тирозин	Т	Ароматическая боковая цепь
Триптофан	W	Ароматическая боковая цепь
Глутамин	Q	Амидная группа
Аспарагин	N	Амидная группа
Гистидин	H	Основная боковая цепь
Глутаминовая кислота	Е	Кислая боковая цепь
Аспарагиновая кислота	D	Кислая боковая цепь
Лизин	К	Основная боковая цепь
Аргинин	R	Основная боковая цепь

[0046] «Идентичность последовательности» в данном описании означает степень, до которой два нуклеотида или аминокислотные последовательности являются инвариантными. Идентичность аминокислотной последовательности в процентах по отношению к предпочтительному полипептиду изобретения определяли здесь как процент аминокислотных остатков в предполагаемой последовательности, которые являются идентичными с остатками в последовательности гиалуронидазы после выравнивания обеих последовательностей и внедрения разрывов в случае необходимости для достижения максимальной идентичности последовательности в процентах и без учета любых консервативных замен в виде части идентичности последовательности. Согласно изобретению вариантная гиалуронидаза может иметь идентичность аминокислотной последовательности в процентах, по меньшей мере, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% или 99% по отношению к SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, как определено согласно схеме выравнивания.

[0047] «Выравнивание последовательности» означает процесс выравнивания двух или больше последовательностей для достижения максимальных уровней идентичности (и, в случае аминокислотных последовательностей, сохранение) для оценки степени подобия. Многочисленные способы выравнивания последовательностей и оценки подобия/идентичности известны в данной области техники, например, кластерный метод, где подобие основано на алгоритме MEGALIGN, а также BLASTN, BLASTP и FASTA. При использовании всех этих программ предпочтительными настройками являются настройки «по умолчанию» или, в качестве альтернативы, те настройки, которые дают самое высокое подобие последовательности.

[0048] «Ферментная активность» или «активность» фермента является критерием его способности катализировать реакцию, то есть «функционировать», и могут быть выражены в виде скорости образования продукта реакции. Например, ферментная активность может быть представлена в виде количества продукта, произведенного за единицу времени или на единицу фермента (например, концентрация или вес) на основе подобия или констант диссоциаций. Предпочтительные единицы активности для выражения активности включают каталитическую константу (k_cat=v_max/E; v_max - максимальная интенсивность круговорота; Е - концентрация фермента); константа Михаэлиса-Ментена (K_m); и _kcat/K_m. Такие единицы могут быть определены с использованием известных методов в области техники энзимологии.

[0049] «Удельная активность» для фермента, такого как гиалуронидаза или препарат гиалуронидазы, может быть измерена в Международных единицах (ME) на грамм или моль фермента или ферментного препарата. Одну единицу гиалуронидазы определяли как количество, которое в течение 1 мин в 0,3% растворе субстрата в отношении веса к объему (гиалуронат калия или гиалуроновая кислота) при температуре 37°С и значении рН 6.5 будет продуцировать олигосахариды в количестве, эквивалентном 1 ммоль N-ацетил-D-глюкозамина (NAGA). Термин «лучшая», «повышенная», «улучшенная» или «превосходная» активность или тому подобное означает активность по сравнению с гиалуронидазой используемой ранее в данной области техники, такой как ронидаза (и определенной при тех же самых условиях), степень которой является выше, по меньшей мере, приблизительно на 10%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 25%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 75%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 100%.

[0050] Термин «иммунологическая активность» определяет способность рекомбинантной или синтетической гиалуронидазы «дикого» типа или любого ее варианта вызывать иммунную реакцию, специфическую для гиалуронидазы у соответствующих животных или в клетках, и связываться с антителами, которые связываются с ферментом.

[0051] «Стабильность» или «устойчивость» фермента означают его способность функционировать в течение долгого времени в специфической среде или при определенных условиях. Один способ оценить стабильность или устойчивость состоит в том, чтобы оценить ее способность противостоять потери активности в течение долгого времени при заданных условиях. Ферментная стабильность может также быть оценена другими способами, например, посредством определения относительной степени, до которой фермент находится в сложенном или развернутом состоянии. Таким образом, один фермент повысил стабильность или устойчивость по отношению к другому ферменту, когда он является более устойчивым, чем другой фермент к потере активности при тех же самых условиях, более устойчивым к разворачиванию или является более долговечным согласно любым соответствующим критериям. Например, более «термоустойчивый» фермент - это тот фермент, который является более устойчивым к потере структуры (разворачивание) или функции (ферментная активность) при воздействии возрастающих температур; и более «устойчивый по отношению к рН» фермент - это тот фермент, который является более устойчивым к потере структуры или активности, когда значение рН раствора увеличивается или уменьшается от оптимального значения рН.

[0052] «Промоторная последовательность» является регулирующей областью ДНК способной связывать РНК-полимеразу в клетке и инициировать транскрипцию нисходящей (3’ направление) кодирующей последовательности. Для определения этого изобретения промоторная последовательность связывается в своих 3’ конечных точках посредством участка инициирования транскрипции и удлиняется вверх (5’ направление) для того, чтобы включить минимальное число основ или элементов, необходимых для инициирования транскрипции на уровнях, поддающихся обнаружению выше фона.

[0053] Полинуклеотиды являются «поддающиеся гибридизации» друг с другом, когда по меньшей мере одна нить одного полинуклеотида может соединить комплементарные нити ДНК с другим полинуклеотидом при определенных строгих условиях. Строгость гибридизации определяется, например, (а) температурой, при которой выполняется гибридизация и/или промывка, и (b) ионной силой и полярностью (например, формамид) гибридизации и промывочных растворов, а также другими параметрами. Гибридизация требует, чтобы эти два полинуклеотида содержали в основном комплементарные последовательности; в зависимости от строгости гибридизации, однако, могут допускаться рассогласования. Как правило, гибридизация двух последовательностей при высокой строгости (например, в водном растворе 0.5×SSC при температуре 65°С) требует, чтобы последовательности проявляли некоторую высокую степень комплементарности по всей последовательности. Условия промежуточной строгости (например, водный раствор 2×SSC при температуре 65°С) и низкая строгость (например, водный раствор 2xSSC при температуре 55°С) требуют соответственно менее полной комплементарности между гибридизирующими последовательностями. 1×SSC - 0.15 М NaCl, 0.015 М Na цитрат.

[0054] Термин «экспрессирующая система» означает клетку-хозяина и совместимый вектор при соответствующих условиях, например для экспрессии белка, кодируемого инородной ДНК, переносимой вектором и внедренной в клетку-хозяина. Общие экспрессирующие системы включают бактерии (например, Е. Coli, В. subtilis и Streptomyces) или дрожжевые клетки-хозяева (например, S. cerevisiae) и плазмидные векторы, а также клетки-хозяева насекомых и бакуловирусные векторы. Кишечная палочка (Е. Coli) и стрептомицеты (Streptomyces) являются предпочтительными клетками-хозяевами по изобретению.

[0055] Термины «вектор», «векторная конструкция» и «вектор экспрессии» означают среду, посредством которой последовательность ДНК или РНК (например, инородный ген) может быть введена в клетку-хозяина для трансформации хозяина и содействия экспрессии (например, транскрипция и трансляция) внедренной последовательности. Векторы обычно включают ДНК трансмиссивного агента, в который инородная ДНК, кодирующая белок, вставляется посредством технологии рестрикционного фермента. Общим типом вектора является «плазмида», которая, как правило, представляет собой автономную молекулу двухспиральной ДНК, которая может быстро принять дополнительную (инородную) ДНК и которая может быть быстро внедрена в соответствующую клетку-хозяина. Большое количество векторов, включая плазмиду и грибковые векторы, было описано для репликации и/или экспрессии у разнообразных эукариотических и прокариотических хозяев. Неограниченные примеры включают плазмиды pKK (Clontech, Mountain View, СА), плазмиды pUC, плазмиды рЕТ (Novagen, Inc., Madison, WI), плазмиды pRSET или pREP (Invitrogen, San Diego, СА) или плазмиды pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) и множество соответствующих клеток-хозяев с использованием способов, раскрытых или упомянутых здесь или каким-л