Комбинированное применение vip3ab и cry1ab для регулирования устойчивых насекомых

Комбинированное применение vip3ab и cry1ab для регулирования устойчивых насекомых

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предшествующий уровень техники

Кукурузу выращивают для применения в пищу и получения энергии. Выращивают также многие другие сельскохозяйственные культуры, включая сою и хлопок. Насекомые поедают и повреждают растения и, таким образом, подрывают эти усилия человека. Миллиарды долларов расходуются каждый год для борьбы с насекомыми-вредителями и еще миллиарды теряются с ущербом, который они наносят. Основными средствами, применяемыми для борьбы с насекомыми-вредителями, являются синтетические органические химические инсектициды, но в некоторых регионах важную роль играют биологические инсектициды, такие как инсектицидные белки, получаемые из Bacillus thuringiensis (Bt). Способность получать устойчивые к насекомым растения путем транформации генами из Bt, экспрессирующими инсектицидные белки, в корне изменила современное сельское хозяйство и повысила важность и значение инсектицидных белков и экспрессирующих их генов.

Несколько белков из Bt применяли для создания устойчивых к насекомым трансгенных растений, которые на настоящий момент успешно зарегистрированы и коммерциализированы. Эти белки включают Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F и Cry3Bb в кукурузе, Cry1Ac и Cry2Ab в хлопке и Cry3A в картофеле.

Коммерческие продукты, вырабатывающие эти белки, вырабатывают единственный белок кроме случаев, когда желателен объединенный инсектицидный спектр из 2 белков (например, Cry1Ab и Cry3Bb объединены в кукурузе для придания устойчивости к чешуекрылым вредителям и повреждающим корни личинкам соответственно) или когда независимое действие белков делает их полезными в качестве средства для задержки развития устойчивости у восприимчивых популяций насекомых (например, Cry1Ac и Cry2Ab в хлопке, объединенные для обеспечения регулирования развития устойчивости у табачного почкоеда). См. также патент США 2009 0313717, который относится к белку Cry2 плюс Vip3Aa, Cry1F или Cry1A для борьбы с Helicoverpa zea или armigera. WO 2009 132850 относится к Cry1F или Cry1A и Vip3Aa для борьбы с Spodoptera frugiperda. Патент США 2008 0311096 относится частично к Cry1Ab для борьбы с Cry1F-устойчивым ECB.

Таким образом, некоторые качества трансгенных растений, обладающих устойчивостью к насекомым, которые привели к быстрому и широко распространенному внедрению этой технологии, также создали проблему того, что популяции вредителей развивают устойчивость к инсектицидным белкам, вырабатываемым этими растениями. Было предложено несколько стратегий для сохранения полезности признаков устойчивости к насекомым, основанных на Bt, которые включают применение белков в большой дозе в комбинации с резерватами и изменение при помощи или совместное применение различных токсинов (McGaughey et al. (1998), «B.t. Resistance Management» Nature Biotechnol. 16:144-146).

Необходимо, чтобы белки, выбираемые для применения в IRM стеке, проявляли свои инсектицидные действия независимо так, чтобы устойчивость, выработанная к одному белку, не придавала устойчивость ко второму белку (т.е. отсутствие перекрестной устойчивости к белкам). Если, например, популяция вредителя, выбранная по устойчивости к «белку А», была бы чувствительной к «белку Б», можно было бы заключить, что перекрестной устойчивости нет и что комбинация белка A и белка Б будет эффективной для задержки развития устойчивости к белку А отдельно.

В отсутствие устойчивых популяций насекомых можно делать оценки на основе других характеристик, которые, как предполагается, связаны с механизмом действия и потенциалом перекрестной устойчивости. Предложена возможность идентификации инсектицидных белков, скорее всего не проявляющих перекрестной устойчивости, путем рецептор-опосредованного связывания (van Mellaert et al., 1999). Ключевым показателем недостатка перекрестной устойчивости, присущим этому подходу, является то, что инсектицидные белки не конкурируют за рецепторы у чувствительных видов насекомых.

В случае, когда два Bt токсина конкурируют за один и тот же рецептор, то если этот рецептор мутирует у этого насекомого так, что один из токсинов больше не связывается с этим рецептором и, таким образом, больше не является инсектицидным в отношении насекомого, может случиться так, что насекомое также будет устойчивым ко второму токсину (который избирательно связывается с тем же самым рецептором). Таким образом, говорят, что насекомое обладает перекрестной устойчивостью к обоим Bt токсинам. Однако, если два токсина связываются с двумя различными рецепторами, это может указывать на то, что насекомое не является устойчивым одновременно к этим двум токсинам.

Cry1Fa полезен в борьбе со многими видами чешуекрылых вредителей, включая мотылька кукурузного (ECB; Ostrinia nubilalis (Hubner)) и совку травяную (FAW; Spodoptera frugiperda), и активен против точильщика стеблей сахарного тростника (SCB; Diatraea saccharalis). Белок Cry1Fa, образующийся в растениях кукурузы, содержащий фрагмент TC1507, отвечает за ведущий для промышленности признак устойчивости к насекомым для борьбы с FAW. Cry1Fa дополнительно применяется в продуктах Herculex®, SmartStax™ и WideStrike™.

Дополнительные Cry токсины перечислены на веб-сайте официального комитета по спецификации B.t. (Crickmore et al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). В настоящее время существует почти 60 главных групп токсинов «Cry» (Cry1-Cry59) с дополнительными Cyt-токсинами и VIP-токсинами и т.п. Многие из каждой числовой группы содержат подгруппы с заглавной буквой, и подгруппы с заглавной буквой содержат подподгруппы со строчными буквами (Cry1 содержит A-L, и Cry1A содержит a-i, например).

Сущность изобретения

Изобретение частично относится к открытию того, что Vip3Ab и Cry1Ab не конкурируют друг с другом за связывание с рецепторами кишечника у Heticoverpa zea (совка хлопковая; CEW). Изобретение также относится частично к удивительному открытию того, что Vip3Ab является активным против капустных молей (DBM), которые устойчивы к Cry1Ab.

Как будет понятно специалисту в области техники, благоприятный эффект этого раскрытия заключается в том, что растения, экспрессирующие Vip3Ab и Cry1Ab, или их инсектицидные части будут полезными для задержки или предотвращения развития устойчивости к каждому из этих инсектицидных белков в отдельности.

Таким образом, изобретение имеет отношение частично к применению белка Vip3Ab в комбинации с белком Cry1Ab. Растения (и площадь земли в акрах, засаженная такими растениями), которые вырабатывают Vip3Ab плюс Cry1Ab, включены в объем изобретения.

Изобретение также имеет отношение частично к тройным стекам или «пирамидам» из трех (или более) токсинов с Vip3Ab и Cry1Ab в качестве основной пары. Такие тройные стеки могут обеспечивать три белка, оказывая неконкурентное действие против CEW. Это может помочь дополнительно снизить или избавить от необходимости создания площади насаждений резерватных растений.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Реакция на смертельную дозу полноразмерного Vip3Ab1 у личинок Plutella xylostella (Linnaeus) (DBM) и устойчивого к Cry1A Plutella xylostella (rDBM), Heliothis zea (CEW), Spodoptera frugiperda (J.E. Smith), (FAW) и Ostrinia nubilalis (Hubner), (ECB), когда очищенный токсин применяли местно к искусственной пище насекомого. Летальность в процентах основана на наблюдении за 8 насекомыми для каждой дозы через 5 дней после экспонирования токсину.

Фиг.2. Реакция на дозы ингибирования роста полноразмерного Vip3Ab1 у личинок Plutella xylostella (Linnaeus) (DBM) и устойчивого к Cry1A Plutella xylostella (rDBM), Heliothis zea (CEW), Spodoptera frugiperda (J.E. Smith), (FAW) и Ostrinia nubilalis (Hubner), (ECB), когда очищенный токсин применяли местно к искусственной пище насекомого. Ингибирование роста в процентах основано на сравнении среднего веса 8 личинок, обработанных только буфером, к весу личинок, экспонированных к действию токсина в течение 5 дней.

Фиг.3. Кривые конкурентного замещения при связывании ¹²⁵I Cry1Ab с белком из BBMV, полученным из H. zea. Концентрация белка из BBMV составляла 0,10 мг белка/мл и концентрация ¹²⁵I Cry1Ab составляла 0,25 нМ. 100% специфическое связывание ¹²⁵I Cry1Ab измеряли как общее связывание в отсутствие немаркированного Cry1Ab минус неспецифическое связывание, измеренное в присутствии 500 нМ Cry1Ab. Vip3Ab1 тестировали в таких высоких концентрациях как 1000 нМ (в 4000 раз выше, чем меченный радиоактивным изотопом замещающий лиганд), и он не вытеснял связанный ¹²⁵I Cry1Ab. Немеченый радиоактивным изотопом лиганд замещал ¹²⁵I Cry1Ab на 50% при концентрации приблизительно 2 нМ.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID NO:1 представляет собой N-концевой фрагмент инсектицидного белка Cry1Ab.

SEQ ID NO:2 представляет собой полноразмерный белок Vip3Ab, который, как использовалось в исследованиях связывания, обрабатывали трипсином до корового фрагмента (остатки 200-788).

SEQ ID NO:3 представляет собой полноразмерный белок Cry1Ab, который, как использовалось в исследованиях связывания, обрабатывали трипсином до корового фрагмента (остатки 29-612).

Подробное описание изобретения

Изобретение частично поддерживается открытием того, что Vip3Ab и Cry1Ab не конкурируют друг с другом за связывание с рецепторами в кишечнике у Helicoverpa zea (совка хлопковая; CEW).

Изобретение включает применение Vip3Ab и Cry1Ab для защиты кукурузы и других экономически важных видов растений от повреждения и потери урожая, вызываемых поеданием CEW, и предотвращения развития у популяций CEW устойчивости к любому из этих белков.

Изобретение описывает композиции для борьбы с чешуекрылыми вредителями, включающие клетки, вырабатывающие коровый токсинсодержащий белок Cry1Ab и коровый токсинсодержащий белок Vip3Ab.

Изобретение дополнительно включает хозяина, трансформированного для выработки как инсектицидного белка Cry1Ab, так и инсектицидного белка Vip3Ab, где указанный хозяин является микроорганизмом или растительной клеткой. В некоторых вариантах осуществления изобретения растительные клетки являются неразмножающимися/нетотипотентными клетками. Рассматриваемый полинуклеотид(ы) в генетической конструкции предпочтительно находится под контролем (функционально связанный с/включающий) промотора не из Bacillus thuringiensis. Рассматриваемые полинуклеотиды могут включать кодон растений для усиленной экспрессии в растении.

Дополнительно предполагается, что изобретение обеспечивает способ борьбы с чешуекрылыми вредителями, включающий приведение в контакт указанных вредителей или среды указанных вредителей с эффективным количеством композиции, содержащей коровый токсинсодержащий белок Cry1Ab и дополнительно содержащей коровый токсинсодержащий белок Vip3Ab.

Вариант осуществления изобретения включает растение кукурузы, содержащее экспрессирующий в растении ген, кодирующий коровый токсинсодержащий белок Vip3Ab, и экспрессирующий в растении ген, кодирующий коровый токсинсодержащий белок Cry1Ab, и семя такого растения.

Дополнительный вариант осуществления изобретения включает растение кукурузы, где в указанное растение кукурузы и семя такого растения введен экспрессирующий в растении ген, кодирующий коровый токсинсодержащий белок Vip3Ab, и экспрессирующий в растении ген, кодирующий коровый токсинсодержащий белок Cry1Ab.

Как описано в примерах, исследования конкурентного связывания с рецептором с применением меченного радиоактивным изотопом белка Cry1Ab показывают, что коровый токсинсодержащий белок Cry1Ab не конкурирует за связывание в тканях насекомого CEW с рецептором, с которыми связывается Vip3Ab. Эти результаты также указывают на то, что комбинация белков Cry1Ab и Vip3Ab представляет собой эффективное средство для снижения развития устойчивости к Cry1Ab у популяций CEW (и аналогично, развития устойчивости к Vip3Ab) и, вероятно, увеличивает уровень устойчивости к этому вредителю у растений кукурузы, вырабатывающих оба белка. Таким образом, частично на основании данных, приведенных в настоящем описании, считается, что совместная выработка (стекирование) белков Vip3Ab и Cry1Ab может быть применена для получения большой дозы стека IRM для CEW.

К этой паре могут быть добавлены другие белки для расширения спектра борьбы с насекомыми. Другим вариантом применения может быть применение белков Cry1Ab и Vip3Ab в комбинации с другим, третьим токсином/геном, и применение этого тройного стека для снижения развития устойчивости к любому из этих токсинов у CEW. Таким образом, другой вариант применения изобретения состоит в том, чтобы применять два, три или более белков в регионах, где выращивают сельскохозяйственные культуры, где у CEW могут развиваться устойчивые популяции.

Соответственно изобретение также частично имеет отношение к тройным стекам или «пирамидам» из трех (или более) токсинов с токсинами Cry1Ab и Vip3Ab, представляющими собой основную пару. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пирамид выбранные белки обеспечивают неконкурентное действие против CEW.

Растения (и территория, засаженная такими растениями), которые вырабатывают любую из рассматриваемых комбинаций белков, включены в объем изобретения. Также могут быть добавлены дополнительные токсины/гены, но конкретные стеки, рассмотренные выше с преимуществом и к удивлению обеспечивают много способов действия против CEW. Это может способствовать снижению или отказу от необходимости выделения площади сельскохозяйственной земли под резерватные растения. Поле, засаженное таким образом на площади более 10 акров, таким образом, включено в объем рассматриваемого изобретения.

GENBANK также может быть применен для получения последовательностей для любого из генов и белков, раскрытых или указанных в настоящем описании.

Комбинации белков, описанных в настоящем описании, могут быть применены для борьбы с чешуекрылыми вредителями. Взрослые чешуекрылые, например бабочки и мотыльки, главным образом питаются нектаром цветков и являются важным фактором опыления. Почти все личинки чешуекрылых, т.е. гусеницы, питаются растениями, и многие из них являются серьезными вредителями. Гусеницы питаются на или внутри листвы или на корнях или стебле растения, лишая растение питательных веществ и часто разрушая структуру физической опоры растения. Дополнительно гусеницы питаются плодами, тканями и запасами зерна и мукой, делая невозможным продажу этих продуктов или сильно снижая их стоимость. Как применено в настоящем описании, ссылка на чешуекрылых вредителей относится к различным стадиям жизненного цикла вредителя, включая личиночные стадии.

Некоторые химерные токсины по изобретению включают целиком N-концевую часть корового Bt токсина и, в некоторой точке после конца коровой части токсина белок имеет переход к гетерологической последовательности протоксина. N-концевая, инсектицидно активная токсиновая часть Bt токсина указана в качестве «корового» токсина. Переход от сегмента корового токсина к сегменту гетерологического протоксина может встретиться приблизительно в области соединения токсина/протоксина или, альтернативно, часть нативного протоксина (простирающийся через часть корового токсина) может быть сохранена с переходом к гетерологической части протоксина, имеющим место ниже.

В качестве примера один химерный токсин изобретения представляет собой целую часть корового токсина Cry1Ab (приблизительно первые 600 аминокислот) и гетерологический протоксин (остаток от молекулы до C-окончания). В одном предпочтительном варианте осуществления часть химерного токсина, включающую протоксин, получают из другого Cry1Ab белкового токсина.

Специалисту в области техники будет понятно, что Bt токсины даже в пределах определенного класса, такого как Cry1A, изменяются до некоторой степени в длине и точном расположении перехода от части корового токсина до части протоксина. Как правило, токсины Cry1Ab содержат от приблизительно 1150 до приблизительно 1200 аминокислот в длину. Переход от части корового токсина до части протоксина, как правило, встречается между приблизительно 50% и приблизительно 60% общей длины токсина. Химерный токсин изобретения включает всю протяженность этой N-концевой части корового токсина. Таким образом, химерный токсин включает, по меньшей мере, приблизительно 50% общей длины Cry1Ab Bt белкового токсина. Это, как правило, представляет собой, по меньшей мере, приблизительно 590 аминокислот. В отношении части протоксина общая протяженность части протоксина Cry1Ab составляет от конца части корового токсина до C-конца молекулы.

Гены и токсины. Гены и токсины, полезные согласно изобретению, включают не только полноразмерные раскрытые последовательности, но также и фрагменты этих последовательностей, варианты, мутантные и сшитые белки, сохраняющие характерное пестицидное действие токсинов, конкретно проиллюстрированных в настоящем описании. Как применено в настоящем описании, термины «варианты» или «вариации» генов относятся к нуклеотидным последовательностям, кодирующим те же самые токсины или кодирующим эквивалентные токсины, обладающие пестицидным действием. Как применено в настоящем описании, термин «эквивалентные токсины» относится к токсинам, обладающим той же самой или по существу той же самой биологической активностью против целевых вредителей как патентуемые токсины.

Как применено в настоящем описании, граничные значения составляют приблизительно 95% (Cry1Ab и Vip3Ab’s), 78% (Cry1F и Vip3A’s) и 45% (Cry1’s и Vip3’s) идентичности последовательности по «Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins» N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum и D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998), том 62: 807-813. Эти фрагменты также могут быть применены только к коровым токсинам (для Cry1Ab, например). Белки для применения согласно изобретению могут быть, например, по меньшей мере, на 75%, 85%, 90%, 95% или 99% (и любое целочисленное приращение в пределах этого диапазона) идентичны (идентичность по аминокислотам) белку, приведенному в качестве примера или специфически предложенному в настоящем описании. Они включают белки, кодируемые полинуклеотидами/ДНК, применяемыми согласно изобретению.

Специалисту в области техники будет понятно, что гены, кодирующие активные токсины, могут быть идентифицированы и получены несколькими путями. Конкретные гены или части генов, приведенные в настоящем описании в качестве примера, могут быть получены из изолятов, депонированных в депозитарии культур. Эти гены или их части или варианты также могут быть получены синтетическим путем, например, при помощи генного синтезатора. Вариации генов могут быть легко получены с применением стандартных способов точковой мутации. Кроме того, фрагменты этих генов могут быть получены с применением коммерчески доступных экзонуклеаз или эндонуклеаз стандартными способами. Например, для систематического отрезания нуклеотидов на концах этих генов могут быть применены ферменты, такие как Bal31, или сайт-направленный мутагенез. Гены, кодирующие активные фрагменты, также могут быть получены с применением множества рестрикционных ферментов. Для прямого получения активных фрагментов этих белковых токсинов могут быть применены протеазы.

Фрагменты и эквиваленты, которые сохраняют пестицидное действие токсинов, приведенных в качестве примера, входят в объем изобретения. Кроме того, благодаря избыточности генетического кода многие различных последовательностей ДНК могут кодировать последовательности аминокислот, раскрытых в настоящем описании. Специалист в области техники с легкостью может получить эти альтернативные последовательности ДНК, кодирующие такие же или по существу такие же токсины. Эти различные последовательности ДНК входят в объем изобретения. Как применено в настоящем описании, ссылка на «по существу такую же» последовательность относится к последовательностям, содержащим замены, удаления, добавления или вставки аминокислот, которые фактически не влияют на пестицидное действие. Фрагменты генов, кодирующие белки, которые сохраняют пестицидное действие, также включены в это определение.

Дополнительным способом идентификации генов, кодирующих токсины, и части генов, полезные согласно изобретению, является применение олигонуклеотидных зондов. Эти зонды представляют собой обнаруживаемые нуклеотидные последовательности. Эти последовательности могут быть обнаружены по соответствующей метке или могут быть созданы флуоресцентными по своей природе, как описано в международной заявке № WO93/16094. Как известно в области техники, если тест-молекула и контрольная нуклеиновая кислота гибридизируют путем образования прочной связи между этими двумя молекулами, можно обоснованно предполагать, что тест-молекула и контрольная нуклеиновая кислота существенно гомологичны. Предпочтительно гибридизация проводится в жестких условиях способами, известными в области техники, как описано, например, в Keller, G.H., М.М. Manak (1987) LNA Probes, Stockton Press, Нью Йорк, N.Y., с. 169-170. Некоторые примеры комбинаций концентрации соли и температуры приведены далее (в порядке увеличения жесткости условий): 2X SSPE или SSC при комнатной температуре; 1X SSPE или SSC при 42°С; 0,1Х SSPE или SSC при 42°C; 0,1X SSPE или SSC при 65°С. Обнаружение тест-молекулы обеспечивает средство для определения того, произошла ли гибридизация. Такой зондовый анализ обеспечивает быстрый способ идентификации генов, кодирующих токсины по изобретению. Нуклеотидные сегменты, применяемые в качестве тест-молекул согласно изобретению, могут быть синтезированы при помощи ДНК синтезатора и стандартных способов. Эти нуклеотидные последовательности также могут быть применены в качестве праймеров ПЦР для амплификации генов по изобретению.

Варианты токсинов. В частности, для примера в настоящем описании приведены определенные токсины по изобретению. Поскольку эти токсины являются типовыми для токсинов по изобретению, сразу должно быть очевидно, что изобретение включает варианты токсинов или эквивалентные токсины (и нуклеотидные последовательности, кодирующие эквивалентные токсины), обладающие таким же или схожим пестицидным действием с действием токсина, приведенного для примера. Эквивалентные токсины будут гомологичны по аминокислотам токсину, приведенному для примера. Эта аминокислотная гомологичность, как правило, составляет боле 75%, предпочтительно, более 90% и наиболее предпочтительно более 95%. Аминокислотная гомологичность является наиболее высокой в критических частях токсина, которые отвечают за биологическую активность или вовлечены в создание трехмерной конфигурации, которая, в конечном счете, отвечает за биологическую активность. В этом отношении определенные замены аминокислот приемлемы и могут быть ожидаемы, если эти замены находятся в частях, которые не являются критически важными в отношении активности или являются консервативными заменами аминокислот, не влияющими на трехмерную конфигурацию молекулы. Например, аминокислоты могут быть классифицированы следующим образом: неполярные, незаряженные полярные, основные и кислотные. Консервативные замены, при которых аминокислота одного класса заменяется другой аминокислотой того же типа, входят в объем изобретения, если при этом замена фактически не изменяет биологическую активность соединения. Ниже приведен список примеров аминокислот, принадлежащих каждому классу.

Класс аминокислоты	Примеры аминокислоты
Неполярные	Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp
Незаряженные полярные	Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
Кислотные	Asp, Glu
Основные	Lys, Arg, His

В некоторых случаях также могут быть сделаны неконсервативные замены. Критическим фактором является то, что эти замены не должны значительно нарушать биологическую активность токсина.

Рекомбинантные хозяева. Гены, кодирующие токсины по изобретению, могут быть введены большому разнообразию растений-хозяев или микроорганизмов-хозяев. Экспрессия токсинового гена приводит напрямую или косвенно к внутриклеточному образованию и сохранению пестицида. Конъюгационный перенос и рекомбинантный перенос могут быть применены для получения штамма Bt, который вырабатывает оба токсина по изобретению. Другие организмы-хозяева также могут быть модифицированы одним или обоими токсиновыми генами и затем применены для осуществления синергического действия. С подходящими микроорганизмами-хозяевами, например, Pseudomonas, микроорганизмы могут быть применены к месту нахождения вредителя, где они будут распространяться и попадать внутрь вредителя. Результатом является борьба с вредителем. Альтернативно микроорганизм-хозяин токсинового гена можно обрабатывать в условиях, продлевающих действие токсина и стабилизирующих клетку. Затем обработанная клетка, сохраняющая токсическое действие, может быть применена к среде целевого вредителя.

В случаях, когда в микроорганизм-хозяин вводят Bt токсиновый ген при помощи подходящего вектора, и указанный микроорганизм-хозяин применяют к среде в живом состоянии, необходимо применение определенных микроорганизмов-хозяинов. Выбирают такие микроорганизмы-хозяева, о которых известно, что они занимают «фитосферу» (филлоплану, филлосферу, прикорневую зону и/или ризоплану) одной или более представляющих интерес сельскохозяйственных культур. Эти микроорганизмы выбирают так, чтобы они были способны успешно конкурировать в конкретной окружающей среде (сельскохозяйственная культура и другие среды обитания насекомого) с микроорганизмами дикого типа, обеспечивать устойчивое сохранение и экспрессию гена, экспрессирующего полипептидный пестицид, и, по желанию, обеспечивать улучшенную защиту пестицида от разложения и инактивации в окружающей среде.

Известно, что большое количество микроорганизмов населяет филлоплану (поверхность листьев растения) и/или прикорневую зону (почву, окружающую корни растения) большого разнообразия важных сельскохозяйственных культур. Эти микроорганизмы включают бактерии, водоросли и грибы. Особенный интерес представляют микроорганизмы, такие как бактерии, например, рода Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc и Alcaligenes; грибы, в частности, дрожжи, например, рода Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula и Aureobasidium. Особенный интерес представляют такие виды фитосферных бактерий, как Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus и Azotobacter vinlandii; и виды фитосферных дрожжей, такие как Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae и Aureobasidium pollulans. В частности, интересны пигментированные микроорганизмы.

Существует большое разнообразие способов для введения Bt гена, кодирующего токсин в микроорганизме-хозяине при условиях, позволяющих устойчивое сохранение и экспрессию гена. Эти способы известны специалистам в области техники и описаны, например, в патенте США № 5135867, включенном в настоящее описание посредством ссылки.

Обработка клеток. Bacillus thuringiensis или рекомбинантные клетки, образующие Bt токсины, можно обрабатывать так, чтобы продлить действие токсина и стабилизировать клетку. Образуемая пестицидная микрокапсула включает Bt токсин или токсины внутри стабилизированной клеточной структуры, которая защищает токсин, когда микрокапсулу применяют к среде обитания целевого вредителя. Подходящие клетки-хозяева могут включать как прокариотов, так и эукариотов, обычно ограничиваясь теми клетками, которые не образуют токсичные вещества для высших организмов, таких как млекопитающие. Однако организмы, образующие токсичные вещества для высших организмов, могут быть применены в случае, когда токсичные вещества неустойчивы или норма внесения является достаточно низкой, такой, чтобы исключить любую возможность токсичности для млекопитающего-хозяина. В качестве хозяев особенно интересны прокариоты и низшие эукариоты, такие как грибы.

Клетка, как правило, является интактной и во время обработки находится по существу в пролиферативной фазе, а не в фазе споры, хотя в некоторых случаях споры могут быть применены.

Обработка микробной клетки, например, микроорганизма, содержащего ген или гены B.t. токсина, может быть осуществлена химическими или физическими средствами или комбинацией химических и/или физических средств в случае, если этот способ не имеет вредного воздействия на свойства токсина и не снижает способность клетки защищать токсин. Примерами химических реагентов являются галоидирующие агенты, в частности галогены с атомным номером 17-80. Более конкретно, для достижения желаемых результатов может быть применен иод в мягких условиях и в течение достаточного количества времени. Другие подходящие способы включают обработку альдегидами, такими как глютаральдегид; противоинфекционными средствами, такими как хлорид зефирана и хлорид цетилпиридиния; спиртами, такими как изопропиловый и этиловый спирты; различными гистологическими фиксаторами, такими как иодный раствор Люголя, фиксатор Буэна, различные кислоты и фиксатор Хелли (см. Humason, Gretchen L., Animal tissue techniques, W.H. Freeman and Company, 1967); или комбинацией физических (высокая температура) и химических агентов, сохраняющих и продлевающих действие токсина, образующегося в клетке, когда клетку вносят в среду обитания хозяина. Примерами физических агентов являются коротковолновая радиация, такая как гамма-излучение и рентгеновское излучение, замораживание, УФ излучение, лиофилизация и т.п. Способы обработки микробных клеток раскрыты в патентах США №№ 4695455 и 4695462, включенных в настоящее описание посредством ссылки.

В целом, клетки будут обладать повышенной структурной устойчивостью, которая увеличит устойчивость к факторам окружающей среды. Когда пестицид находится в виде проформы, способ обработки клетки необходимо выбирать так, чтобы не ингибировать перевод проформы в итоговую форму пестицида целевым патогенным организмом вредителя. Например, формальдегид сшивает белки и может ингибировать трансформацию проформы полипептидного пестицида. Способ обработки должен сохранять, по меньшей мере, существенную долю биодоступности или биоактивность токсина.

Характеристики, представляющие особенный интерес при отборе клетки-хозяина с целью получения включают легкость введения B.t. гена или генов хозяину, пригодность систем экспрессии, эффективность экспрессии, устойчивость пестицида в хозяине и наличие вспомогательных наследственных характеристик. Представляющие интерес характеристики при применении в качестве пестицидной микрокапсулы включают защитные свойства для пестицида, такие как толстостенность клеточных оболочек, пигментация и внутриклеточная упаковка или образование телец-включений; выживаемость в водных средах; низкая токсичность для млекопитающих; привлекательность для заглатывания вредителями; легкость уничтожения и фиксации без повреждения токсина; и т.п. Другие принимаемые в рассмотрение факторы включают легкость при составлении в композицию и обращении, экономичность, устойчивость при хранении и т.п.

Рост клеток. Хозяин клетки, содержащий B.t. инсектицидный ген или гены, может быть выращен в любой удобной питательной среде, в которой конструкция ДНК обеспечивает селективное преимущество, обеспечивая селективную питательную среду таким образом, чтобы существенно все или все клетки сохраняли B.t. ген. Затем эти клетки можно собирать в соответствии с традиционными способами. Альтернативно клетки можно обрабатывать до их сбора.

B.t. клетки, вырабатывающие токсины по изобретению, могут быть культивированы с применением стандартных в области техники среды и способов ферментации. По завершению цикла ферментации бактерии могут быть собраны путем первоначального отделения B.t. спор и кристаллов от ферментативного бульона средствами, известными в области техники. Выделенные B.t. споры и кристаллы могут быть составлены в композицию в виде смачиваемого порошка, жидкого концентрата, гранул или в виде других композиций путем добавления поверхностно-активных веществ, диспергирующих агентов, инертных носителей и других компонент для облегчения обращения с ними и применения в отношении конкретных целевых вредителей. Все эти композиции и способы применения известны в области техники.

Композиции. Составленные в композицию приманочные гранулы, содержащие аттрактант и споры, кристаллы и токсины изолятов B.t., или рекомбинантные микроорганизмы, включающие гены, получаемые из изолятов B.t., раскрытых в настоящем описании, могут быть применены к почве. Составленный в композицию продукт также может быть применен в качестве покрытия для семян или обработки корня или обработки всего растения на более поздних стадиях цикла развития сельскохозяйственной культуры. Обработка растения и почвы клетками B.t. может быть осуществлена в виде смачиваемых порошков, гранул или пудр путем смешивания с различными инертными материалами, такими как неорганические минералы (филлосиликаты, карбонаты, сульфаты, фосфаты и т.п.) или растительные материалы (истертые кукурузные початки, рисовая шелуха, скорлупа грецкого ореха и т.п.). Композиции могут включать вспомогательные агенты, улучшающие растекание-связывание, стабилизирующие агенты, другие пестицидные добавки или поверхностно-активные вещества. Жидкие композиции могут быть водными или неводными и могут быть применены в виде пен, гелей, суспензий, эмульгируемых концентратов и т.п. Ингредиенты могут включать реологические агенты, поверхностно-активные вещества, эмульгаторы, диспергаторы или полимеры.

Специалисту в области техники понятно, что концентрация пестицида будет значительно различаться в зависимости от природы конкретной композиции, в частности, того, является ли она концентратом или будет применена непосредственно. Пестицид может составлять, по меньшей мере, 1% по массе и 100% по массе. В сухих композициях количество пестицида составляет приблизительно 1-95% по массе, в то время как в жидких композициях твердая фаза в жидкой фазе составляет приблизительно 1-60% по массе. Композиции, в целом, содержат приблизительно от 10² до приблизительно 10⁴ клеток/мг. Эти композиции применяют в количестве от приблизительно 50 мг (жидкой или сухой) до 1 кг или более на гектар.

Композиции могут быть применены к среде обитания чешуекрылого вредителя, например листве или почве, путем разбрызгивания, распыливания, опрыскивания и т.п.

Модифицирование растений. Предпочтительным рекомбинантным хозяином для получения инсектицидных белков по изобретению является модифицированное растение. Гены, кодирующие токсиновые B.t. белки, как раскрыто в настоящем описании, могут быть введены в растительные клетки с применением множества способов, известных в области техники. Например, для подготовки к введению чужеродных генов в высшие растения доступно большое количество клонирующих векторов, включающих систему репликации в Escherichia Coli и маркерный ген, который позволяет выбирать модифицированные клетки. Векторы включают среди прочего, например, pBR322, ряд pUC, ряд M13mp, pACYC184. Соответственно фрагмент ДНК, содержащий последовательность, кодирующую Bt токсиновый белок, может быть введен в вектор на подходящем сайте рестрикции. Получаемую плазмиду применяют для введения в E. coli. Клетки E. coli клетки культивируют в подходящей питательной среде, затем собирают и подвергают лизису. Плазмиду регенерируют. В качестве методов анализа, как правило, применяют секвенирование, рестрикционный анализ, электрофорез и другие биохимические методы молекулярной биологии. После каждого этапа примененная последовательность ДНК может быть расщеплена и присоединена к следующей последовательности ДНК. Каждая последовательность плазмиды может быть клонирована в той же самой или других плазмидах. В зависимости от способа введения желаемых генов в растение могут потребоваться другие последовательности ДНК. Если, например, Ti- или Ri-плазмиду применяют для модифицирования растительной клетки, то, по меньшей мере, правый конец, но часто правый и левый концы T-ДНК Ti- или Ri-плазмиды, должны быть соединены в качестве фланкирующей области вставляемых генов. Применение T-ДНК для модифицирования растительных клеток интенсивно исследовано и достаточно описано в EP 120516, Lee и Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986) и An et al., (1985), и широко известно в области техники.

Как только введенная ДНК интегрируется в геном растения, она становится относит