Мицелиальные грибы, имеющие фенотип измененной вязкости

Мицелиальные грибы, имеющие фенотип измененной вязкости

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРИОРИТЕТ

[01] Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки США с серийным № 61/377030, поданной 25 августа 2010, которая включена ссылкой в ее полноте.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[02] Настоящие штаммы и способы относятся к генетическим мутациям у мицелиальных грибов, которые дают начало вариантам, имеющим измененные характеристики роста. Такие варианты хорошо подходят для роста в погруженных культурах, например, для крупномасштабного производства ферментов и других белков или метаболитов для коммерческих применений.

ССЫЛКИ

[03] Следующие ссылки и дополнительная ссылка, цитируемая в данном документе, таким образом, включены ссылкой:

Caracuel, Z. et al. (2005) Molecular Plant-Microbe Interactions 18:1140-47.

Hughes, H. and Stephens, D.J. (2008) Cell Biol. 129:129-51.

Karhinen, L. et al. (2005) Traffic 6:562-74.

Mouyna, I. et al. (2005) Molecular Microbiology 56:1675-88.

Passolunghi, S. et al. (2010) Microbial Cell Factories 9:7-17.

Peng, R. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:11521-28.

Roberg, K.J. et al. (1999) J. Cell. Biol. 145:659-72.

Shimoni, Y. et al. (2000) J. Cell. Biol. 151:973-84.

Turchini, A. et al. (2000) J. Becteriol. 182:1167-71.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[04] Мицелиальные грибы способны экспрессировать до высоких уровней нативные и гетерологичные белки, что делает их хорошо подходящими для крупномасштабного производства ферментов и других белков для промышленных применений. Мицелиальные грибы обычно выращивают в погруженных культурах мицелия в биореакторах, которые адаптированы для введения и распределения кислорода и питательных веществ в культуральной среде (т.е. бульоне). Морфологические характеристики мицелия воздействуют на реологические свойства бульона, тем самым воздействуя на производительность биореактора.

[05] Как правило, чем выше вязкость бульона, тем меньше однородность распределения кислорода и питательных веществ, и тем больше энергии необходимо для перемешивания культуры. В некоторых случаях вязкость бульона становится достаточно высокой, чтобы существенно препятствовать растворению кислорода и питательных веществ, тем самым неблагоприятно воздействуя на рост грибов. Дополнительно, мощность, необходимая для перемешивания и аэрирования вязкого бульона, может существенно увеличить себестоимость производства, и привести к более высоким капиталовложениям в отношении двигателей и источников мощности.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[06] Описаны штаммы и способы, относящиеся к мицелиальным грибам, имеющим генетические изменения, которые приводят к фенотипам измененной вязкости.

[07] В одном аспекте обеспечивается вариантный штамм мицелиального гриба, полученный из родительского штамма, вариантный штамм, включающий генетическое изменение, которое побуждает клетки вариантного штамма продуцировать измененное количество функционального белка Sfb3 по сравнению с клетками родительского штамма, где клетки вариантного штамма продуцируют, в ходе аэробной ферментации в погруженной культуре, клеточный бульон, который (i) требует измененного количества перемешиваний для поддержания предварительно выбранного содержания растворенного кислорода по сравнению с клетками родительского штамма, и/или (ii) поддерживает измененное содержание растворенного кислорода при предварительно выбранном количестве перемешиваний по сравнению с клетками родительского штамма.

[08] В некоторых вариантах осуществления измененное количество функционального белка Sfb3 представляет собой уменьшенное количество, и вариантный штамм продуцирует, в ходе аэробной ферментации в погруженной культуре, клеточный бульон, который (i) требует уменьшенного перемешивания для поддержания предварительно выбранного содержания растворенного кислорода по сравнению с клетками родительского штамма, и/или (ii) поддерживает повышенное содержание растворенного кислорода при предварительно выбранном количестве перемешиваний по сравнению с клетками родительского штамма.

[09] В некоторых вариантах осуществления генетическое изменение включает разрушение гена sfb3, присутствующего в родительском штамме. В некоторых вариантах осуществления разрушение гена sfb3 является результатом делеции всего гена sfb3 или части гена sfb3. В некоторых вариантах осуществления разрушение гена sfb3 является результатом делеции части геномной ДНК, включающей ген sfb3. В некоторых вариантах осуществления разрушение гена sfb3 является результатом мутагенеза гена sfb3.

[10] В некоторых вариантах осуществления разрушение гена sfb3 выполняют, используя сайт-специфическую рекомбинацию. В некоторых вариантах осуществления разрушение гена sfb3 выполняют в комбинации с введением селектируемого маркера в генетический локус гена sfb3. В некоторых вариантах осуществления разрушение гена sfb3 представляет собой первичную генетическую детерминанту для придания фенотипа уменьшенной вязкости вариантному штамму.

[11] В некоторых вариантах осуществления вариантный штамм не продуцирует функциональный белок Sfb3. В некоторых вариантах осуществления вариантный штамм не продуцирует белок Sfb3.

[12] В некоторых вариантах осуществления вариантный штамм дополнительно включает ген, кодирующий белок, представляющий интерес.

[13] В некоторых вариантах осуществления вариантный штамм продуцирует, по сути, такое же количество белка на единицу количества биомассы, как родительский штамм. В некоторых вариантах осуществления вариантный штамм продуцирует, по сути, такое же количество белка, представляющего интерес, на единицу количества биомассы, как родительский штамм.

[14] В некоторых вариантах осуществления белок Sfb3 включает аминокислотную последовательность IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL (SEQ ID NO: 9, где X представляет собой любой аминокислотный остаток).

[15] В некоторых вариантах осуществления мицелиальный гриб представляет виды Pezizomycotina. В некоторых вариантах осуществления мицелиальный гриб представляет собой Trichoderma reesei.

[16] В другом аспекте обеспечивается способ получения вариантного штамма клеток мицелиального гриба, включающий: введение генетического изменения в родительский штамм клетки мицелиального гриба, такое генетическое изменение изменяет продукцию функционального белка Sfb3 по сравнению с клетками родительского штамма, тем самым давая вариантную клетку мицелиального гриба, которая продуцирует, в ходе аэробной ферментации в погруженной культуре, клеточный бульон, который (i) требует измененного количества перемешиваний для поддержания предварительно выбранного содержания растворенного кислорода по сравнению с клетками родительского штамма, и/или (ii) поддерживает измененное содержание растворенного кислорода при предварительно выбранном количестве перемешиваний по сравнению с клетками родительского штамма.

[17] В некоторых вариантах осуществления генетическое изменение снижает или предотвращает продукцию функционального белка Sfb3, тем самым давая вариантную клетку мицелиального гриба, которая продуцирует, в ходе аэробной ферментации в погруженной культуре, клеточный бульон, который (i) требует уменьшенного перемешивания для поддержания предварительно выбранного содержания растворенного кислорода по сравнению с клетками родительского штамма, и/или (ii) поддерживает повышенное содержание растворенного кислорода при предварительно выбранном количестве перемешиваний по сравнению с клетками родительского штамма.

[18] В некоторых вариантах осуществления генетическое изменение включает разрушение гена sfb3 в родительской клетке мицелиального гриба, используя генетическую манипуляцию.

[19] В некоторых вариантах осуществления генетическое изменение включает делецию гена sfb3 в родительской клетке мицелиального гриба, используя генетическую манипуляцию.

[20] В некоторых вариантах осуществления генетическое изменение выполняют, используя сайт-специфическую генетическую рекомбинацию. В некоторых вариантах осуществления разрушение гена sfb3 выполняют в комбинации с введением селектируемого маркера в генетический локус гена sfb3.

[21] В некоторых вариантах осуществления вариантный штамм продуцирует, по сути, такое же количество белка на единицу количества биомассы, как родительский штамм. В некоторых вариантах осуществления вариантный штамм продуцирует, по сути, такое же количество белка, представляющего интерес, на единицу количества биомассы, как родительский штамм.

[22] В некоторых вариантах осуществления белок Sfb3 включает аминокислотную последовательность IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL (SEQ ID NO: 9, где X представляет собой любой аминокислотный остаток).

[23] В некоторых вариантах осуществления мицелиальный гриб представляет собой виды Pezizomycotina. В некоторых вариантах осуществления мицелиальный гриб представляет собой Trichoderma reesei.

[24] В некоторых вариантах осуществления родительский штамм дополнительно включает ген, кодирующий белок, представляющий интерес. В некоторых вариантах осуществления ген, кодирующий белок, представляющий интерес, присутствует в родительском штамме перед введением генетического изменения, которое снижает или предотвращает продукцию функционального белка Sfb3.

[25] В другом аспекте обеспечивается белок, представляющий интерес, полученный с помощью описанного выше вариантного штамма.

[26] В другом аспекте обеспечивается вариантный штамм мицелиального гриба, полученный с помощью описанного выше способа.

[27] В другом аспекте обеспечивается вариантный штамм мицелиального гриба, полученный из родительского штамма, вариантный штамм, включающий: (a) генетическое изменение, которое приводит к (i) необходимости в уменьшенном перемешивании в погруженной культуре для поддержания предварительно выбранного содержания растворенного кислорода по сравнению с клетками родительского штамма, и/или (ii) поддержанию повышенного содержания растворенного кислорода в погруженной культуре при предварительно выбранном количестве перемешиваний по сравнению с клетками родительского штамма, и (b) ген, кодирующий белок, представляющий интерес, где ген, кодирующий белок, представляющий интерес, присутствует в вариантном штамме перед генетическим изменением в (a).

[28] В некоторых вариантах осуществления генетическое изменение включает разрушение гена sfb3, присутствующего в родительском штамме. В некоторых вариантах осуществления разрушение гена sfb3 выполняют в комбинации с введением селектируемого маркера в генетический локус sfb3 гена.

[29] В другом аспекте обеспечивается способ для скрининга вариантных клеток мицелиального гриба в отношении фенотипа измененной вязкости, включающий: (a) мутагенез клеток родительского штамма мицелиальных грибов для получения вариантных клеток; (b) скрининг вариантных клеток в отношении измененной чувствительности к флуорохромному красителю; и (c) выбор вариантных клеток, которые имеют измененную чувствительность к флуорохромному красителю; где измененная чувствительность к флуорохромному красителю коррелирует со способностью вариантных клеток мицелиальных грибов продуцировать, в ходе аэробной ферментации в погруженной культуре, клеточный бульон, который (i) требует измененного количества перемешиваний для поддержания предварительно выбранного содержания растворенного кислорода по сравнению с клетками родительского штамма, и/или (ii) поддерживает измененное содержание растворенного кислорода при предварительно выбранном количестве перемешиваний по сравнению с клетками родительского штамма.

[30] В некоторых вариантах осуществления измененная чувствительность является увеличенной чувствительностью, и вариантная клетка мицелиального гриба продуцирует, в ходе аэробной ферментации в погруженной культуре, клеточный бульон, который (i) требует уменьшенного перемешивания для поддержания предварительно выбранного содержания растворенного кислорода по сравнению с клетками родительского штамма, и/или (ii) поддерживает повышенное содержание растворенного кислорода при предварительно выбранном количестве перемешиваний, по сравнению с клетками родительского штамма. В некоторых вариантах осуществления флуорохромный краситель представляет собой калькофлуор белый.

[31] В некоторых вариантах осуществления мутагенез клеток выполняют с помощью генетической рекомбинации. В некоторых вариантах осуществления мутагенез клеток выполняют в комбинации с введением селектируемого маркера в генетический локус гена sfb3.

[32] В другом аспекте обеспечивается способ определения полипептида Sfb3 в видах мицелиального гриба Pezizomycotina, включающий следующее: (a) получение аминокислотной последовательности из видов мицелиального гриба Pezizomycotina; и (b) скрининг аминокислотной последовательности в отношении присутствия смежной аминокислотной последовательности IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL (SEQ ID NO: 9, где X представляет собой любой аминокислотный остаток); (c) где присутствие SEQ ID NO: 9 в аминокислотной последовательности из видов мицелиального гриба Pezizomycotina показывает, что аминокислотная последовательность из видов мицелиального гриба Pezizomycotina представляет собой полипептид sfb3.

[33] В другом аспекте обеспечивается выделенный полипептид sfb3, определенный с помощью описанного выше способа.

[34] В еще дополнительном аспекте обеспечивается способ получения белка, представляющего интерес, в клетках мицелиального гриба, включающий введение в родительские клетки мицелиального гриба гена, кодирующего белок, представляющий интерес, и генетического изменения, которое снижает количество или активность белка Sfb3 в клетках, тем самым давая вариантную клетку мицелиального гриба, которая продуцирует, в ходе аэробной ферментации в погруженной культуре, клеточный бульон, включающий белок, представляющий интерес, который (i) требует измененного количества перемешиваний для поддержания предварительно выбранного содержания растворенного кислорода по сравнению с клетками родительского штамма, и/или (ii) поддерживает измененное содержание растворенного кислорода при предварительно выбранном количестве перемешиваний по сравнению с клетками родительского штамма, и где белок, представляющий интерес получают, по сути, на таком же уровне в вариантных клетках по сравнению с родительскими клетками.

[35] В некоторых вариантах осуществления белок, представляющий интерес, представляет собой более одного белка (или один, или несколько белков), представляющего интерес, и каждый из более одного белка, представляющего интерес, получают, по сути, на таких же относительных уровнях в вариантных клетках по сравнению с родительскими клетками. В конкретном варианте осуществления каждый из более одного белка, представляющего интерес, выбирают из целлюлаз и гемицеллюлаз.

[36] В родственном аспекте обеспечивается белок, представляющий интерес, полученный таким способом. В еще одном родственном аспекте обеспечивается композиция, включающая более одного белка, представляющего интерес, полученного таким способом. В некоторых вариантах осуществления композиция представляет собой композицию общей целлюлазы.

[37] Эти и другие аспекты и варианты осуществления настоящих штаммов и способов будут очевидными из описания, включающего приложенные фигуры.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[38] Фигура 1 представляет собой карту плазмиды pCR-BluntII-hph-loxP#4.

[39] Фигура 2 представляет собой карту плазмиды pCR-Blunt II-TOPO 889092.

[40] Фигура 3, секции A-D представляют собой изображения культуральных планшетов, показывающие морфологию колонии штаммов T. reesei MorphΔsfb3 и 29-9Δsfb3 на среде, содержащей конго красный. (A) Субпопуляция кандидатов MorphΔsfb3 и (B) соответствующие контроли. (C) Субпопуляция кандидатов 29-9Δsfb3 и (D) соответствующие контроли.

[41] Фигура 4 представляет собой карту плазмиды pTrex-Tel-pyrG13/pDONR221/0927853cre, используемой, чтобы транзиторно экспрессировать ген cre в штамме Morph Δsfb3.

[42] Фигура 5 представляет собой изображение, показывающее потерю устойчивости к гигромицину Б и способность расти на ацетамиде у кандидатов после транзиторной экспрессии плазмиды pTrex-Tel-pyrG13/pDONR221/0927853cre. Верхний ряд (A-C): контрольные штаммы Morph и Morph Δsfb3 на указанных средах. Нижний ряд (D-F): кандидаты после транзиторной экспрессии плазмиды на указанных средах.

[43] Фигура 6 представляет собой карту плазмиды pNSP23.

[44] Фигура 7 представляет собой карту одной из четырех плазмид, используемых для комплементации в 70H2, при этом эта плазмида содержит ген sfb3 дикого типа с нативным промотором и терминатором.

[45] Фигура 8 представляет собой изображение, показывающее рост трансформантов 70H2 и 29-9 на PDA с гигромицином Б через четыре дня роста при 28°C (первый перенос из трансформационных планшетов). (A-C) 70H2+sfb3 дикого типа из 29-9. (D-F) 70H2+sfb3 дикого типа с нативным промотором и терминатором из 29-9. (G) 29-9+только вектор. (H-J) 70H2+sfb3 из 70H2. (K-M) 70H2+sfb3 с нативным промотором и терминатором из 70H2. (N) 70H2+только вектор.

[46] Фигура 9 представляет собой карту плазмиды pCR-BluntII-TOPO 949096.

[47] Фигура 10 представляет собой изображение, показывающее (A) рост трансформантов из 70H2, трансформированных pCR-BluntII-TOPO 949096, содержащей ген sfb3 дикого типа, полученный из штамма 29-9. Штаммы инкубировали на VMH (минимальной среде Фогеля, содержащей гигромицин Б) при 28°C. Два кандидата имеют фенотип дикого типа (W), два имеют фенотип 70H2 (H) и два имеют промежуточный фенотип (I). (B) Сравнение 70H2sfb3#24, 70H2 и 29-9 на VM (минимальной среде Фогеля) через 4 дня роста при 28°C с последующими 3 днями роста при комнатной температуре.

[48] Фигура 11 показывает морфологии колоний H3A и H3A Δsfb3 #1009 на указанных средах через 4 дня роста при 28°C.

[49] Фигура 12 показывает изображения гиф H3A и H3A Δsfb3 #1009 в жидкой культуре через указанные периоды времени при 28°C.

[50] Фигура 13 показывает выравнивание аминокислотных последовательностей белков Sfb3 из S. cerevisiae (SEQ ID NO: 1) и T. reesei (SEQ ID NO: 2).

[51] Фигура 14 показывает выравнивание аминокислотных последовательностей белков Sfb3 из S. cerevisiae (SEQ ID NO: 1), T. reesei (SEQ ID NO: 2) и A. oryzae (SEQ ID NO: 3).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

I. Обзор

[52] Настоящие штаммы и способы относятся к вариантным клеткам мицелиального гриба, имеющим генетические модификации, которые воздействуют на их морфологию и характеристики роста. Когда вариантные клетки выращивают в погруженной культуре, они продуцируют клеточный бульон, который имеет несхожие реологические свойства по сравнению с клеточным бульоном, включающим клетки родительского штамма. Некоторые из этих вариантных штаммов хорошо подходят для крупномасштабного производства ферментов и других коммерчески важных белков.

II. Определения

[53] Перед описанием настоящих штаммов и способов подробно, следующие выражения определяют для ясности. Выражения, которые не были определены, должны соответствовать их общепринятым значениям, как используется в соответствующей области техники.

[54] Как используется в данном документе, «Trichoderma reesei» относится к мицелиальному грибу типа Ascomycota, подтипа Pezizomycotina. Этот организм был ранее классифицирован как Trichoderma longibrachiatum, а также как Hypocrea jecorina.

[55] Как используется в данном документе, фраза «вариантный штамм клеток мицелиального гриба» или сходные фразы, относятся к штаммам клеток мицелиального гриба, которые получены (т.е. получены из или могут быть получены из) из родительского (или эталонного) штамма, принадлежащего Pezizomycotina, например, с помощью генетической манипуляции.

[56] Как используется в данном документе, выражение «белок, представляющий интерес» относится к полипептиду, который необходимо экспрессировать в мицелиальном грибе, необязательно на высоких уровнях и для цели промышленного внедрения. Такой белок может быть ферментом, субстрат-связывающим белком, поверхностно-активным белком, структурным белком или подобным.

[57] Как используется в данном документе, фраза «по сути, свободный от активности» или подобные фразы, означает, что определенная активность является, либо не обнаруживаемой в смеси, либо присутствующей в количестве, которое не будет препятствовать предназначенной цели смеси.

[58] Как используется в данном документе, выражения «полипептид» и «белок» используют взаимозаменяемо для обозначения полимеров любой длины, включающих аминокислотные остатки, связанные пептидными связями. В данном документе используют общепринятые однобуквенные или трехбуквенные коды для аминокислотных остатков. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может включать модифицированные аминокислоты, и он может быть прерван не аминокислотами. Выражения также включают аминокислотный полимер, который был модифицирован естественным образом или путем вмешательства; например, формированием дисульфидной связи, гликозилированием, липидизацией, ацетилированием, фосфорилированием или любой другой манипуляцией или модификацией, такой как конъюгация с метящим компонентом. Также в определение включены, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислоты (включая, например, ненатуральные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные из уровня техники.

[59] Как используется в данном документе, функционально и/или структурно подобные белки рассматриваются как «родственные белки». Такие белки могут быть получены из организмов различных родов и/или видов, или даже различных классов организмов (например, бактерии и гриба). Родственные белки также включают гомологи, определенные с помощью анализа первичной последовательности, определенные с помощью анализа вторичной или третичной структуры или определенные с помощью иммунологической перекрестной реактивности.

[60] Как используется в данном документе, выражение «производный полипептид/белок» относится к белку, который получен из или может быть получен из белка путем добавления одной или нескольких аминокислот к любому из двух или к обоим N- и C-терминальному(ым) концу(ам), замещения одной или нескольких аминокислот на одном или нескольких различных сайтах в аминокислотной последовательности, делеции одной или нескольких аминокислот на любом из двух или обоих концах белка или на одном или нескольких сайтах в аминокислотной последовательности, и/или вставки одной или нескольких аминокислот на одном или нескольких сайтах в аминокислотной последовательности. Получение белковой производной может быть достигнуто путем модификации последовательности ДНК, которая кодирует нативный белок, трансформации этой последовательности ДНК в подходящем хозяине и экспрессии модифицированной последовательности ДНК для образования производного белка.

[61] Родственные (и производные) белки включают «вариантные белки». Вариантные белки отличаются от эталонного/родительского белка (например, белка дикого типа) замещением, делецией и/или вставкой на небольшое число аминокислотных остатков. Число отличающихся аминокислотных остатков между вариантным и родительским белком может быть одним или больше, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 или более аминокислотных остатков. Вариантные белки могут разделять по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, или даже по меньшей мере приблизительно 99%, или более идентичности аминокислотной последовательности с эталонным белком. Вариантный белок может также отличаться от эталонного белка в выбранных мотивах, доменах, эпитопах, консервативных участках и подобном.

[62] Как используется в данном документе, выражение «аналогичная последовательность» относится к последовательности в белке, который обеспечивает такую же функцию, третичную структуру и/или консервативные остатки, как и белок, представляющий интерес (т.е. типично исходный белок, представляющий интерес). Например, в эпитопных участках, которые содержат α-спираль или β-листовую структуру, замещающие аминокислоты в аналогичной последовательности предпочтительно поддерживают такую же специфическую структуру. Выражение также относится к нуклеотидным последовательностям, а также аминокислотным последовательностям. В некоторых вариантах осуществления аналогичные последовательности разрабатывают так, чтобы замещающие аминокислоты приводили в результате к вариантному ферменту, показывающему подобную или улучшенную функцию. В некоторых вариантах осуществления третичная структура и/или консервативные остатки аминокислот в белке, представляющем интерес, расположены на или вблизи сегмента или фрагмента, представляющего интерес. Таким образом, при условии, что сегмент или фрагмент, представляющий интерес содержит, например, α-спираль или β-листовую структуру, то замещающие аминокислоты предпочтительно поддерживают эту специфическую структуру.

[63] Как используется в данном документе, выражение «гомологичный белок» относится к белку, который имеет активность и/или структуру, подобную эталонному белку. Предполагается, что гомологи не обязательно являются эволюционно родственными. Таким образом, предполагается, что выражение включает одинаковый(е), подобный(е) или соответствующий(е) фермент(ы) (т.е. в отношении структуры и функции), полученный(е) из различных организмов. В некоторых вариантах осуществления необходимо определить гомолог, который имеет четвертичную, третичную и/или первичную структуру, подобную эталонному белку. В некоторых вариантах осуществления гомологичные белки вызывают иммунологический(е) ответ(ы), подобный(е) эталонному белку. В некоторых вариантах осуществления гомологичные белки конструируют, чтобы получать ферменты с необходимой(ыми) активностью(ями).

[64] Степень гомологии между последовательностями может быть определена с использованием любого приемлемого способа, известного из уровня техники (см., например, Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444; программы, такие как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Мэдисон, Висконсин); и Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:387-95).

[65] Например, PILEUP представляет собой пригодную программу для определения уровней гомологии последовательности. PILEUP создает выравнивание множественных последовательностей из группы родственных последовательностей, используя прогрессивные, парные выравнивания. Она может также построить дерево, показывающее взаимоотношения образования кластеров, используемые для создания выравнивания. PILEUP использует упрощение способа прогрессивного выравнивания Фенга и Дулитла (Feng and Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-60). Способ подобен таковому, описанному Хиггинсом и Шарпом ((1989) CABIOS 5:151-53). Пригодные параметры PILEUP, включая вес гэпа по умолчанию 3,00, вес длины гэпа по умолчанию 0,10 и взвешенные концевые гэпы. Другой пример пригодного алгоритма представляет собой алгоритм BLAST, описанный Altschul et al. ((1990) J. Mol. Biol. 215:403-10) и Karlin et al. ((1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87). Одна особенно пригодная программа BLAST представляет собой программу WU-BLAST-2 (см., например, Altschul et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:460-80). Параметры “W,” “T,” и “X” определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа BLAST использует в качестве параметров по умолчанию слово-длина (W) 11, выравнивания (B) 50, ожидание (E) 10, M′5, N′-4 и сравнение обоих цепей матрицы замен BLOSUM62 (см., например, Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).

[66] Как используется в данном документе, фразы «по сути, подобные» и «по сути, идентичные» в контексте по меньшей мере двух нуклеиновых кислот или полипептидов, как правило означает, что полинуклеотид или полипептид включает последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 70% идентичности, по меньшей мере приблизительно 75% идентичности, по меньшей мере приблизительно 80% идентичности, по меньшей мере приблизительно 85% идентичности, по меньшей мере приблизительно 90% идентичности, по меньшей мере приблизительно 91% идентичности, по меньшей мере приблизительно 92% идентичности, по меньшей мере приблизительно 93% идентичности, по меньшей мере приблизительно 94% идентичности, по меньшей мере приблизительно 95% идентичности, по меньшей мере приблизительно 96% идентичности, по меньшей мере приблизительно 97% идентичности, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности, или даже по меньшей мере приблизительно 99% идентичности, или более, по сравнению с эталонной последовательностью (т.е. дикого типа). Идентичность последовательности может быть определена с использованием известных программ, таких как BLAST, ALIGN и CLUSTAL, используя стандартные параметры. (см., например, Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Henikoff et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915; Karin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:5873; и Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244). Программное обеспечение для проведения анализов BLAST является общедоступным через Национальный центр биотехнологической информации. Также базы данных могут быть выбраны, используя FASTA (Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-48). Одним показателем того, что два полипептида являются, по сути, идентичными, является то, что первый полипептид является иммунологически перекрестно реактивным со вторым полипептидом. Обычно, полипептиды, которые отличаются на консервативные аминокислотные замещения, являются иммунологически перекрестно реактивными. Таким образом, полипептид является, по сути, идентичным второму полипептиду, например, когда два пептида отличаются только на консервативное замещение. Другим показателем того, что две последовательности нуклеиновых кислот являются, по сути, идентичными, является то, что две молекулы гибридизуются друг с другом при строгих условиях (например, в пределах диапазона среды до высокой строгости).

[67] Как используется в данном документе, выражение «ген» является синонимом выражению «аллель» по отношению к нуклеиновой кислоте, которая кодирует и направляет экспрессию белка или РНК. Вегетативные формы мицелиальных грибов являются, как правило, гаплоидными, следовательно, одна копия определенного гена (т.е. один аллель) является достаточной для придания определенного фенотипа.

[68] Как используется в данном документе, гены, белки или штамм «дикого типа» и «нативные» гены, белки или штаммы, являются таковыми, обнаруживаемыми в природе.

[69] Как используется в данном документе, «делеция гена» относится к его удалению из генома клетки хозяина. Если ген включает контрольные элементы (например, энхансерные элементы), которые не расположены сразу же смежно с кодирующей последовательностью гена, то делеция гена относится к делеции кодирующей последовательности, и необязательно смежным последовательностям промотора и/или терминатора.

[70] Как используется в данном документе, «разрушение гена» относится в широком смысле к любой генетической или химической манипуляции, которая, по сути, не допускает продуцирование функционального генного продукта клеткой, например, белка клеткой-хозяином. Иллюстративные способы разрушения включают полную или частичную делецию любой части гена, включая кодирующую полипептид последовательность, промотор, энхансер или другой регуляторный элемент или мутагенез того же, где мутагенез включает замещения, вставки, делеции, инверсии и их комбинации и вариации любых из этих мутаций, которые, по сути, препятствуют продукции функционального генного продукта.

[71] Как используется в данном документе, «генетическая манипуляция» относится к изменению предварительно выбранной целевой последовательности нуклеиновой кислоты, например, используя макромолекулы (т.е. ферменты и/или нуклеиновые кислоты), которые действуют на предварительно выбранную последовательность нуклеиновой кислоты. В этом смысле генетическая манипуляция отличается от химической манипуляции, в которой малые молекулы используют для случайно воздействующих изменений на последовательность нуклеиновой кислоты, которая не является предварительно выбранной.

[72] Как используется в данном документе, «генетическое изменение» представляет собой изменение в ДНК клетки, которое является результатом генетической манипуляции и отличается от изменения в ДНК клетки, которое является результатом химической манипуляции.

[73] Как используется в данном документе, «аэробная ферментация» относится к росту в присутствии кислорода.

[74] Как используется в данном документе, выражение «клеточный бульон» относится в совокупности к среде и клеткам в жидкой/погруженной культуре.

[75] Как используется в данном документе, выражение «клеточная масса» относится к клеточному компоненту (включая интактные и лизированные клетки), присутствующему в жидкой/погруженной культуре. Клеточная масса может быть выражена в сухом или влажном весе.

[76] Как используется в данном документе, выражение «реология» относится к разделу физики, который касается деформации и потоку вещества.

[77] Как используется в данном документе, «вязкость» представляет собой меру устойчивости жидкости к деформации путем механического усилия, такого как напряжение при сдвиге или напряжение при растяжении. В данном контексте вязкость относится к устойчивости клеточного бульона, включающего клетки мицелиальных грибов к механическому усилию, например, как обеспечивается ротором/рабочим колесом. Так как вязкость клеточного бульона может быть сложно измерить напрямую, могут быть использованы непрямые измерения вязкости, такие как содержание растворенного кислорода культурального бульона при предварительно выбранном количестве перемешиваний, количество перемешиваний, необходимых для поддержания предварительно выбранного содержания растворенного кислорода, количество мощности, необходимой для перемешивания клеточного бульона для поддержания предварительно выбранного содержания растворенного кислорода или даже морфология колонии на твердой среде.

[78] Как используется в данном документе, вариантный штамм клеток мицелиальных грибов «с измененной вязкостью» представляет собой вариантный штамм, который продуцирует клеточный бульон, который имеет уменьшенную или увеличенную вязкость (т.е. уменьшенную или увеличенную устойчивость к напряжению при сдвиге или при растяжении) по сравнению с эквивалентным клеточным бульоном, полученным с помощью родительского штамма. Как правило, эквивалентные клеточные бульоны имеют сопоставимые клеточные массы. Предпочтительно, разница между вариантным штаммом, с измененной вязкостью и родительским штаммом, учитывая любое прямое или непрямое измерение вязкости, составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, или даже по меньшей мере 50%, или более. Способы сравнения вязкости бульона клеток мицелиальных грибов описаны в данном документе. Как правило, сопоставимые (или эквивалентные) клеточные бульоны имеют сопоставимые клеточные массы.

[79] Как используется в данном документе, вариантный штамм клеток мицелиальных грибов «с уменьшенной вязкостью» представляет собой вариантный штамм, который продуцирует клеточный бульон, который имеет уменьшенную вязкость (т.е. уменьшенную устойчивость к напряжению при сдвиге или при растяжении) по сравнению с эквивалентным клеточным бульоном, полученным с помощью родительского штамма. Предпочтительно, различие между вариантным штаммом, с измененной вязкостью и родительским штаммом, учитывая любое прямое или непрямое измерение вязкости, составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, или даже по меньшей мере 50%, или более.

[80] Как используется в данном документе, «первичная генетическая детерминанта» относится к гену или его генетической манипуляции, который(ая) необходим(а) и достаточен(чна) для придания определенного фенотипа в отсутствии других генов или их генетических манипуляций.

[81] Как используется в данном документе, «функциональный полипептид/белок» представляет собой белок, который обладает активностью, такой как ферментативная активность, связывающая активность, поверхностно-активное свойство или подобное, и который не был подвергнут мутагенезу, процессингу или модифицирован иным образом, чтобы аннулировать или снизить эту активность. Как определено, функциональные полипептиды могут быть термостабильными или термол