Пакетированное событие 8264.44.06.1 с устойчивостью к гербицидам, связанные трансгенные линии сои и их детектирование

Пакетированное событие 8264.44.06.1 с устойчивостью к гербицидам, связанные трансгенные линии сои и их детектирование

Иллюстрации

Показать все

Реферат

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ

Глифосат (N-фосфонометилглицин), гербицид широкого спектра, ингибирует 5-энолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS), фермент шикиматного пути биосинтеза, который синтезирует незаменимые ароматические аминокислоты в растительных клетках. Ингибирование EPSPS эффективно нарушает синтез белка и тем самым, убивает пораженные растительные клетки. Поскольку глифосат является неселективным, он убивает как сорняки, так и сельскохозяйственные культуры. Таким образом, его можно применять для сельскохозяйственных культур только в том случае, если сельскохозяйственным культурам можно придать устойчивость к глифосату, которая позволит желаемым растениям выжить при воздействии глифосата.

Технологию рекомбинантных ДНК применяли для изоляции мутантных EPSP синтаз, устойчивых к глифосату. Такие устойчивые к глифосату мутантные EPSP-синтазы можно трансформировать в растения и передавать устойчивость к глифосату трансформированным растениям. В качестве примера, ген устойчивости к глифосату выделяли из штамма Agrobacterium CP4, как описано в патенте США № 5633435. Эта ссылка и все цитируемые в настоящем документе ссылки включены в документ в качестве ссылки.

Другие гены устойчивости к глифосату были созданы посредством введения мутаций. Они включают ген AroA, изолированный Comai и описанный в патентах США №№ 5094945, 4769061 и 4535060. Одну мутацию вводили, как описано в патенте США № 5310667, посредством замены остатка аланина на остаток глицина между аминокислотными позициями 80 и 120. Две мутации вводили, как описано в патентах США №№ 6225114 и 5866775, в которых, в дополнение к указанной выше мутации, вводили вторую мутацию (замена остатка треонина на остаток аланина между позициями 170 и 210) в ген EPSPS дикого типа.

В других работах получали устойчивую к глифосату кукурузу, посредством введения модифицированного гена EPSPS кукурузы, несущего мутации остатка 102 (замена треонина на изолейцин) и остатка 106 (замена пролина на серин) аминокислотной последовательности, с номером доступа GeneBank X63374. См. патенты США №№ 6566587 и 6040497.

Примеры событий, обеспечивающих устойчивость к глифосату у сои, включают линию сои GTS 40-3-2 (Padgette et al. 1995), событие соя MON89788 (патент США № 7608761), патент США № 7608761, который относится к событию соя MON89788, каждое из которых было получено посредством вставки гена cp4 epsps в сою.

Повсеместное внедрение устойчивой к глифосату системы выращивания сельскохозяйственных культур и возрастающее применение глифосата способствовало распространению устойчивых к глифосату и трудных для контроля сорняков в последние годы. В регионах, где фермеры сталкиваются с устойчивыми к глифосату сорняками или со сдвигом в сторону более трудных для контроля видов сорняков, фермеры могут компенсировать недостатки глифосата баковыми смесями или чередованием с другими гербицидами, которые помогают бороться с пропущенными сорняками.

Широко используемым и эффективным компонентом баковой смеси для борьбы с широколиственными сорняками во многих случаях является 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D). 2,4-D, которую используют в качестве гербицида в течение более 60 лет, представляет собой послевсходовый гербицид с широким спектром для борьбы с многими однолетними, двухлетними, и многолетними широколиственными сорняками, включая несколько ключевых сорняков кукурузы, сои и хлопка. Ключевые сорняки, которые контролирует 2,4-D (расход 560-1120 г кэ/га) при выращивании пропашных культур, включают Ambrosia artemisiifolia, Ambrosia trifida, Xanthium strumarium, Chenopodium album, Helianthus annuus, Ipomoea sp., Abutilon theophrasti, Conyza Canadensis и Senna obtusifolia. 2,4-D обеспечивает частичный контроль нескольких ключевых сорняков, включая Polygonium pensylvanicum, Polygonium persicaria, Cirsium arvense, Taraxacum officinale и Amaranthus sp., включая Amaranthus rudis и Amaranthus palmeri.

Ограничение для дальнейшего применения 2,4-D заключается в том, что ее селективность в отношении двудольных сельскохозяйственных растений, таких как соя или хлопок, очень низкая, и, таким образом 2,4-D, как правило, не применяют для (и, как правило, не применяют возле) чувствительных двудольных сельскохозяйственных растений. Кроме того, применение 2,4-D для травянистых сельскохозяйственных растений отчасти ограничено природой повреждений, которые могут возникать у растений. 2,4-D в комбинации с глифосатом применяют для обеспечения более сильной обработки выжиганием перед беспахотным посевом сои и хлопка; однако из-за чувствительности этих двудольных видов растений к 2,4-D, такую обработку выжиганием нужно проводить, по меньшей мере, за 14-30 суток до посева (Agriliance, 2005).

Организм, который интенсивно изучали, благодаря его способности разрушать 2,4-D, представляет собой Ralstonia eutropha, которая содержит ген, кодирующий tfdA (Streber et al., 1987), фермент, который катализирует первый этап метаболического пути минерализации. (См. патент США № 6153401 и GENBANK Acc. No. M16730). Показано, что tfdA разрушает 2,4-D (Smejkal et al, 2001). Продукты, образующиеся в результате разрушения, обладают очень низкой или нулевой гербицидной активностью по сравнению с 2,4-D. tfdA использовали в трансгенных растениях для передачи устойчивости к 2,4-D двудольным растениям (например, хлопку и табаку), в норме чувствительным к 2,4-D (Streber et al. (1989), Lyon et al. (1989), Lyon (1993), и патент США № 5608147).

Многие гены типа tfdA, которые кодируют белки, способные разрушать 2,4-D, были идентифицированы из их окружения, и помещены в базу данных Genbank. Многие гомологи сходны с tfdA (>85% идентичных аминокислот). Однако существует ряд полинуклеотидных последовательностей со значительно меньшей идентичностью с tfdA (25-50%), которые при этом содержат характерные остатки, ассоциированные с α-кетоглутарат-зависимым Fe (II) диоксигеназами.

Пример разрушающего 2,4-D гена с низкой идентичностью последовательности (<35%) по отношению к tfdA представляет собой ген aad-12 из Delftia acidovorans (патент США App 2011/0203017). Ген aad-12 кодирует S-энантиомер-специфичную α-кетоглутарат-зависимую диоксигеназу, которую применяют в отношении растений для обеспечения устойчивости к определенным феноксиауксиновым гербицидам, включая в качестве неограничивающих примеров: гербициды на основе феноксиуксусной кислоты, такие как 2,4-D и MCPA; и гербициды на основе феноксибутановой кислоты, такие как 2,4-DB и MCPB, и гербициды на основе пиридилоксиалкановой кислоты (например, гербициды на основе пиридилоксиуксусной кислоты, такие как триклопир и флюроксипир), и включая кислоты, соли или сложные эфиры активного ингредиента(ов). (См., например, WO 2007/053482).

Глуфосинат-аммоний ("глуфосинат") представляет собой несистемный неселективный гербицид фосфинотрицинового класса гербицидов. Применяемый преимущественно для послевсходового контроля широкого спектра широколиственных и травянистых сорняков, L-фосфинотрицин, активный ингредиент глуфосината, контролирует сорняки посредством необратимого ингибирования глутамин-синтазы, фермента, который необходим для нейтрализации аммиака в растениях. Гербициды на основе глуфосината доступны в продаже, например, под торговыми марками Ignite®, BASTA и Liberty®.

Фермент фосфинотрицин-N-ацетил-трансфераза (PAT), изолированный из почвенной бактерии Streptomyces viridochromogenes, катализирует превращение L-фосфинотрицина в его неактивную форму посредством ацетилирования. Оптимизированную для растений форму гена, экспрессирующего PAT, применяли в отношении сои для обеспечения устойчивости к гербицидам на основе глуфосината. Один такой пример устойчивой к глуфосинату сои представляет собой событие A5547-127. Недавно применение гербицидов на основе глуфосината в комбинации с признаком устойчивости к глуфосинату было предложено в качестве неселективного способа эффективной борьбы с устойчивыми к ALS и глифосату сорняками.

Экспрессия гетерологичных или чужеродных генов в растениях зависит от того, в какой участок хромосомы вставлен чужеродный ген. Это может быть связано со структурой хроматина (например, гетерохроматин) или близостью элементов регуляции транскрипции (например, энхансеров) к сайту интеграции (Weising et al, Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). Один и тот же ген в трансгенном растении одного типа (или в другом организме) может демонстрировать высокую изменчивость уровня экспрессии среди различных событий. Также могут наблюдаться различия в пространственных или временных паттернах экспрессии. Например, различия в относительной экспрессии трансгена в различных тканях растения могут не соответствовать ожидаемым паттернам для транскрипционных регуляторных элементов, присутствующих в интродуцированной генной конструкции.

Таким образом, обычно создают и скринируют большое количество событий с целью идентификации события, в котором необходимый интродуцированный ген экспрессируется на достаточном уровне, нужном для конкретной цели. В коммерческих целях часто создают от сотен до тысяч различных событий и скринируют эти события с целью обнаружения одного события, имеющего желаемый уровень и паттерн экспрессии трансгена. Событие, имеющее желаемые уровни и/или паттерны экспрессии трансгена, пригодно для интрогрессии трансгена в другое генетическое окружение, посредством ауткроссинга с применением общепринятых способов скрещивания. Потомки таких гибридов сохраняют характеристики экспрессии трансгена исходного трансформанта. Такой способ используют для обеспечения необходимой генной экспрессии у ряда сортов, которые адаптированы к местным условиям роста.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение предоставляет, в частности, эффективные способы контроля устойчивости сорняков, которые помогают сохранить практическую ценность применения гербицидоустойчивых технологий. Данное изобретение также предоставляет фермерам значительную гибкость и удобство способов контроля сорняков.

Более конкретно, настоящее изобретение относится, в частности, к событию сои (Glycine max), обозначенному pDAB8264.44.06.1 ("Событие pDAB8264.44.06.1"), типичные семена которого хранятся в Американской коллекции типовых культур (ATCC) под номером доступа PTA-11336, и его потомкам. Данное изобретение включает растения сои, содержащие событие pDAB8264.44.06.1 (и включает растения сои, содержащие трансгенную вставку в сегменте генома, содержащем SEQ ID NO:l и SEQ ID NO:2).

Трансгенная вставка, присутствующая в данном событии и хранящихся в коллекции семенах, содержит три гена устойчивости к гербицидам: aad-12, 2mepsps и pat ген. Ген aad-12, полученный из Delftia acidovorans, кодирует белок арилоксиалканоат-диоксигеназу (AAD-12), который обеспечивает устойчивость к, например, гербицидам на основе 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и пиридилоксиацетата. Ген 2mepsps, который представляет собой модифицированную последовательность EPSPS, изолированную из кукурузы, кодирует белок, который обеспечивает устойчивость к гербицидам на основе глифосата. Ген pat, изолированный из почвенной бактерии Streptomyces viridochromogenes, обеспечивает устойчивость к гербицидам на основе глуфосината.

Другие аспекты изобретения включают растения-потомки, сою, семена и/или регенерируемые части растений, семян и потомков, содержащие событие сои pDAB8264.44.06.1, а также пищевые или кормовые продукты, полученные из них. Изобретение также включает растительные части события pDAB8264.44.06.1, которые в качестве неограничивающих примеров включают пыльцу, семязачатки, цветы, побеги, корни, листья, ядра вегетативных клеток, пыльцевые клетки и другие растительные клетки, содержащие событие pDAB8264.44.06.1. Кроме того, изобретение относится к растениям сои, характеризующимся устойчивостью к многочисленным гербицидам, включая гербициды на основе феноксиуксусной кислоты, феноксибутановой кислоты, пиридилоксиалкановой кислоты, глифосата и/или глуфосината. Такие растения сои можно пакетировать с генами, которые обеспечивают устойчивость к различным другим неселективным и селективным гербицидам, включая в качестве неограничивающих примеров дикамбу, имидазолинон и гербициды на основе HPPD. Изобретение также включает новую генетическую композицию событие pDAB8264.44.06.1 и аспекты агротехнической приспособленности растений сои, содержащих событие pDAB8264.44.06.1.

Настоящее изобретение относится, в частности, к селекции растений и устойчивых к гербицидам растений. Данное изобретение включает новое событие трансформации в растениях сои, содержащее полинуклеотид, как описано в настоящем документе, вставленный в определенный сайт генома клетки сои.

В некоторых вариантах осуществления указанное событие/полинуклеотид может быть "пакетировано" с другими признаками, включая, например, агрономические признаки и/или белки, ингибирующие развитие насекомых. Однако данное изобретение включает растения, содержащие одно событие, как описано в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления данное событие устойчивости к гербицидам можно комбинировать посредством пакетирования при скрещивании с событием устойчивости к насекомым. В некоторых из этих вариантов осуществления событие устойчивости к насекомым содержит ген crylF и ген crylAc. Некоторые такие события и пакетированные события специально приведены в качестве примеров в настоящем документе, включая событие сои 9582.812.9.1 ("Событие 812") и событие сои 9582.814.19.1 ("Событие 814"). Растения, растительные клетки и семена, например, содержащие любую комбинацию данных событий, включены в данное изобретение. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение включает только Событие сои 9582.812.9.1 ("Событие 812"), как более подробно описано ниже.

Дополнительные признаки можно пакетировать в геном растения или в тот же локус, что и событие pDAB8264.44.06.1, например, с применением селекции растений, повторной трансформации трансгенного растения, содержащего Событие DAS-8264.44.06.1, или добавления новых признаков, посредством направленной интеграции с применением гомологичной рекомбинации.

Другие варианты осуществления включают вырезание участка или всей трансгенной вставки и/или фланкирующих последовательностей События DAS-8264.44.06.1. После вырезания в сайт События DAS-8264.44.06.1 можно вставлять другие и/или дополнительные вставки. Таким образом, приведенную вставку данного события сои можно заменять или пакетировать с ней другую вставку(и).

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к сайту-мишени хромосомы сои, находящемуся на хромосоме 6. В некоторых вариантах осуществления сайт-мишень содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления сайт-мишень хромосомы сои находится между или внутри геномных фланкирующих последовательностей, приведенных в SEQ ID NO:l и SEQ ID NO:2.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу получения трансгенного растения сои, содержащего гетерологичную нуклеиновую кислоту на хромосоме 6. В другом варианте осуществления гетерологичная нуклеиновая кислота вставлена в хромосому 6 возле или между различных приведенных в пример полинуклеотидных сегментов, как описано в настоящем документе.

Дополнительно, данное изобретение предоставляет способы детектирования наличия данного события в образце (образце сои, например). Способы могут быть основаны на ДНК-последовательности рекомбинантной конструкции, вставленной в геном сои, и на геномной последовательности, фланкирующей участок вставки. Также предоставлены наборы и условия, применяемые при осуществлении этих способов.

Таким образом, данное изобретение относится, в частности, к клонированию и анализу ДНК-последовательностей всей приведенной в пример вставки и граничащих с ней участков (в трансгенных линиях сои). Эти последовательности являются уникальными. На основе этих последовательностей вставок и пограничных (и соединяющих) последовательностей получали специфичные к событию праймеры. Анализ с применением ПЦР показал, что события можно идентифицировать посредством анализа ПЦР-ампликонов, полученных с применением этих специфичных к событию праймеров. Таким образом, эти и другие связанные способы можно использовать для уникальной идентификации линий сои, содержащей событие по данному изобретению.

Данное изобретение также относится, в частности, к анализу ПЦР в реальном времени или анализу ПЦР "по конечной точке" с TaqMan для детектирования события 8264.44.06.1. Некоторые варианты осуществления относятся к тестам, позволяющим проводить высокопроизводительный анализ зиготности. Данное изобретение, кроме того, относится, в частности, к применению референсного гена GMFL01-25-J19 (GenBank: AK286292.1) для применения в определении зиготности. Эти и другие связанные способы можно использовать для уникальной идентификации зиготности события pDAB8264.44.06.1 и сортов сои, содержащих это событие.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Фиг.1 представляет собой плазмидную карту pDAB8264.

Фиг.2 представляет собой схематическую диаграмму, иллюстрирующую расположение праймеров для События сои pDAB8264.44.06.1.

Фиг.3 представляет собой схематическую диаграмму, иллюстрирующую расположение праймеров и делеций геномной ДНК в Событии сои pDAB8264.44.06.1.

Фиг.4 представляет собой схематическую диаграмму, иллюстрирующую расположение праймеров для детекции События сои pDAB8264.44.06.1 с применением TaqMan.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO:l представляет собой 5'-фланкирующую пограничную последовательность рассматриваемого События сои pDAB8264.44.06.1.

SEQ ID NO:2 представляет собой 3'-фланкирующую пограничную последовательность рассматриваемого События сои pDAB8264.44.06.1.

SEQ ID NO:3 представляет собой праймер 4406_WF1.

SEQ ID NO:4 представляет собой праймер 4406_WF2.

SEQ ID NO:5 представляет собой праймер 4406_WF3.

SEQ ID NO:6 представляет собой праймер 4406_WF4.

SEQ ID NO:7 представляет собой праймер 4406_WR5.

SEQ ID NO:8 представляет собой праймер 4406_WR6.

SEQ ID NO:9 представляет собой праймер 4406_WR7.

SEQ ID NO:10 представляет собой праймер 4406_WR8.

SEQ ID NO:11 представляет собой праймер ED_vl_Cl.

SEQ ID NO:12 представляет собой праймер PAT_12.

SEQ ID NO:13 представляет собой последовательность плазмиды pDAB8264.

SEQ ID NO:14 представляет собой частичную 5'-фланкирующую последовательность генома сои и частичную последовательность 5'-вставки.

SEQ ID NO:15 представляет собой частичную 3'-фланкирующую последовательность генома сои и частичную последовательность 3'-вставки.

SEQ ID NO:16 представляет собой последовательность длиной в 98 пар оснований, охватывающую участок соединения 5'-вставки.

SEQ ID NO:17 представляет собой последовательность длиной в 131 пару оснований, охватывающую участок соединения 3'-вставки.

SEQ ID NO:18 представляет собой праймер 4406_5'F.

SEQ ID NO:19 представляет собой праймер 4406_5'R.

SEQ ID NO:20 представляет собой зонд 4406_5'P.

SEQ ID NO:21 представляет собой праймер 4406_3'F.

SEQ ID NO:22 представляет собой праймер 4406_3'R.

SEQ ID NO:23 представляет собой зонд 4406_3'P.

SEQ ID NO:24 представляет собой праймер GMS116F.

SEQ ID NO:25 представляет собой праймер GMS116R.

SEQ ID NO:26 представляет собой зонд GMS116Pзонд.

SEQ ID NO:27 представляет собой последовательность События сои pDAB8264.44.06.1, содержащую 5'-фланкирующую геномную последовательность, вставку и 3'-фланкирующую геномную последовательность.

SEQ ID NO:28 представляет собой ожидаемую последовательность События сои 9582.812.9.1, содержащую 5'-фланкирующую геномную последовательность, вставку T-ДНК pDAB9582 и 3'-фланкирующую геномную последовательность.

SEQ ID NO:29 представляет собой ожидаемую последовательность События сои 9582.814.19.1, содержащую 5'-фланкирующую геномную последовательность, вставку T-ДНК pDAB9582 и 3'-фланкирующую геномную последовательность.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение, описываемое в настоящем документе, включает новые события трансформации растений сои (сои), содержащие кассету для экспрессии многочисленных генов устойчивости к гербицидам, вставленные в специфичные локусы генома клетки сои.

Приведенная в пример трансгенная вставка, содержащая событие pDAB8264.44.06.1, включает генетические элементы для экспрессии трех различных генов устойчивости к гербицидам: (1) синтетический ген aad-12; (2) последовательность EPSPS из кукурузы, кодирующая белок, содержащий мутации по сравнению с полипептидом EPSPS дикого типа: на месте аминокислотных остатков 102 (замена треонина на изолейцин) и 106 (замена пролина на серин) и придающий устойчивость или резистентность к гербицидам на основе глифосата; и (3) ген pat, который обеспечивает устойчивость или резистентность к гербицидам на основе глуфосинатов. Ген aad-12 получен из Delftia acidovorans и кодирует белок-фермент арилоксиалканоат-диоксигеназу (AAD-12), способный деактивировать гербициды, содержащие составную группу α-кетоглутарата, включая гербициды на основе феноксиалканоата (например, гербициды на основе феноксиуксусной кислоты, такие как 2,4-D и MCPA; гербициды на основе феноксипропионовой кислоты, такие как дихлорпроп, мекопроп и их энантиомеры; и гербициды на основе феноксибутановой кислоты, такие как 2,4-DB и MCPB) и гербициды на основе пиридилоксиалкановой кислоты (например, гербициды на основе пиридилоксиуксусной кислоты, такие как триклопир и флуроксипир), включая кислоты, соли или сложные эфиры активного ингредиента(ов).

Более конкретно, данное изобретение относится, в частности, к трансгенному Событию сои pDAB8264.44.06.1, линиям растений, содержащим эти события, и клонированию и анализу ДНК-последовательностей этой вставки и/или ее пограничных участков. Линии растений по данному изобретению можно детектировать с применением последовательностей, раскрытых и предложенных в настоящем документе.

Настоящее изобретение относится, в частности, к селекции растений и устойчивых к гербицидам растений. В некоторых вариантах осуществления указанную полинуклеотидную последовательность можно "пакетировать" с другими признаками (такими как устойчивость к другому гербициду(ам) и/или геном(ами), которые кодируют белки устойчивости к насекомым или ингибиторные РНК-последовательности). Однако данное изобретение также включает растения, содержащие одно событие, как описано в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления данное событие устойчивости к гербицидам можно комбинировать в пакетированном событии с событием устойчивости к насекомым. В некоторых вариантах осуществления устойчивость к насекомым выбрана из группы, состоящей из События 812 и События 814 (как более подробно описано выше), каждое из которых содержит ген crylF и ген crylAc. Растения, растительные клетки и семена, например, содержащие любую комбинацию рассматриваемых событий, включены в данное изобретение. Данное изобретение также включает новое, взятое отдельно Событие 812, в определенных вариантах осуществления включающее, например, растения, растительные клетки и семена.

Предварительная заявка США с серийным номером 61/471845, зарегистрированная 5 апреля 2011 года, относится, в частности, к линиям сои, содержащим Событие сои 9582.812.9.1 (Событие 812). Семена, содержащие это событие, хранятся с публичным доступом без ограничений (однако защищены патентными правами) в Американской коллекции типовых культур (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. Этот депозит, обозначенный депозитным номером ATCC No. PTA-11602, был получен 20 января 2011 года. Этот депозит был получен, и хранится согласно правилам Будапештского договора в отношении депозитов семян для использования в процедурах выдачи патентов.

Предварительные заявки США с серийными номерами 61/511664 (зарегистрированная 26 июля 2011 года) и 61/521798 (зарегистрированная 10 августа 2011 года) относятся, в частности, к линиям сои, содержащим событие сои 9582.814.19.1 (Событие 814). Семена, содержащие это событие, хранятся в Американской коллекции типовых культур (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. Депозит с патентным депозитным номером ATCC PTA-12006, был получен ATCC 21 июля 2011 года. Этот депозит был получен, и хранится согласно правилам Будапештского договора в отношении депозитов семян для использования в процедурах выдачи патентов.

Данное изобретение также включает растения, семена и растительные клетки, например, содержащие SEQ ID NO:27 (Событие pDAB8264.44.06.1; Событие 4406), SEQ ID NO:28 (Событие 812) и/или SEQ ID NO:29 (Событие 814) и варианты этих последовательностей, имеющие, например, по меньшей мере, 95,%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность с этими последовательностями. Часто некоторые вариации (такие как делеция некоторых сегментов) появляются после интеграции последовательности-вставки в растительный геном. Это более подробно обсуждается, например, в примере 7.

Данное изобретение также предоставляет анализы для детектирования наличия рассматриваемого события в образце. Аспекты данного изобретения включают способы создания и/или получения любых диагностических молекул нуклеиновой кислоты, приведенных в качестве примера или предложенных в настоящем документе, в частности, основанных полностью или целиком на рассматриваемых фланкирующих последовательностях.

В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный сегмент, приведенный в качестве примера или описываемый в настоящем документе (такой как SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2 и/или вставка между ними, как показано, например, на фиг. 2), можно удалять и затем повторно вставлять дополнительную полинуклеотидную последовательность(и).

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к устойчивым к гербицидам линиям сои и их идентификации. Данное изобретение относится, в частности, к детектированию наличия рассматриваемого события, с целью определения наличия рассматриваемого события в потомстве от полового скрещивания. Кроме того, включен способ детектирования события, который можно применять, например, для выполнения требований предпродажного одобрения и маркировки продуктов, полученных из рекомбинантных сельскохозяйственных культур. Детектирование наличия рассматриваемого события можно проводить посредством любого хорошо известного способа детектирования нуклеиновой кислоты, такого как полимеразная цепная реакция (ПЦР) или гибридизация ДНК с нуклеиновокислотными зондами. Специфичные к событию анализы ПЦР обсуждаются в настоящем документе. (См. например, Windels et al. (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b:459462, 1999) в качестве другого примера.) Некоторые эти примеры относятся к применению набора праймеров, охватывающих участок соединения вставки и фланкирующих ДНК. Более конкретно, один праймер содержит последовательность вставки, а второй праймер содержит последовательность, фланкирующую ДНК.

В настоящем документе приведено в пример Событие сои pDAB8264.44.06.1 и его селекция и диагностика стабильности и экспрессии в растениях сои от поколения к поколению. Обе фланкирующие последовательности события pDAB8264.44.06.1 были секвенированы и в настоящем документе описаны как SEQ ID NO:l и SEQ ID NO:2. Были разработаны специфичные к событию анализы. Событие также было нанесено на карту генома сои (хромосома сои 6). Событие pDAB8264.44.06.1 можно интрогрессировать в элитные культурные сорта, в которых оно обеспечивает устойчивость к фенокси-гербицидам, гербицидам на основе глифосата и гербицидам на основе глуфосинатов в инбредных и гибридных линиях сои.

Рассматриваемый ген EPSPS кодирует мутантную 5-энолпирувил-3-фосфошикимовой кислоты синтазу (EPSPS). Ген EPSPS дикого типа был исходно изолирован из Zea mays, и последовательность была помещена в GenBank под номером доступа X63374. Также см. патент США № 6566587 (в частности, SEQ ID No.3 в нем).

Для обеспечения высокого уровня экспрессии гетерологичных генов в растениях предпочтительно повторно сконструировать указанные гены с тем, чтобы они более эффективно экспрессировались в растительных клетках. Модификация нуклеотидной последовательности EPSPS растения дикого типа может обеспечивать устойчивость при экспрессии в растительной клетке. Как описано в патенте '587, при сравнении полипептида EPSPS с полипептидом дикого типа модификация по замене изолейцина на треонин на месте остатка 102 и замене серина на пролин в позиции 106 белка приводит к получению полипептида EPSPS с двумя мутациями (2mEPSPS), который применяют в рассматриваемой вставке. При экспрессии в растительной клетке он обеспечивает устойчивость к глифосату. Рассматриваемый ген EPSPS, также обозначаемый как "ген 2mepsps" или DMMG, можно альтернативно оптимизировать с повышением экспрессии, как в двудольных, так и в однодольных растениях, в частности, в сое. Частоту использования кодона можно выбирать в зависимости от предпочтительной полудольной частоты использования кодона, т.е. повторно конструировать с тем, чтобы белок кодировался кодонами, предпочтительно используемыми как однодольными, так и двудольными растениями. Вредные последовательности и избыточные участки рестрикции можно удалять с повышением эффективности транскрипции/трансляции кодирующей последовательности 2mepsps и облегчения проведения этапов манипуляции ДНК. Оптимизированная полудольная версия рассматриваемого гена однодольного растения подробно рассмотрена в U.S.S.N. 13/303502 (зарегистрированной 23 ноября 2011 года, испрашивающей приоритет до 3 декабря 2010 года), озаглавленной "OPTIMIZED EXPRESSION OF GLYPHOSATE RESISTANCE ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES IN PLANT CELLS."

Как ранее указано в настоящем документе, вставка и интеграция трансгена в растительный геном включает несколько случайных событий (отсюда название "событие" для данной экспрессирующейся вставки). А именно, во многих способах трансформации, таких как трансформация с применением Agrobacterium, "генная пушка" и WHISKERS, нельзя предсказать, в какое место генома будет вставлен трансген. Таким образом, идентификация фланкирующей геномной ДНК по обе стороны вставки может быть важна для идентификации растения, содержащего данное событие вставки. Например, можно конструировать праймеры для ПЦР, которые позволяют получать ПЦР-ампликон для участка соединения вставки и генома хозяина. Этот ПЦР-ампликон можно использовать для идентификации уникального или особенного события вставки.

Во время процесса введения вставки в геном растительных клеток часто возникают некоторые делеции или другие изменения фланкирующих вставочных и/или геномных последовательностей. Таким образом, подходящий сегмент последовательности плазмиды, предоставленной в настоящем документе, может содержать некоторые незначительные вариации. То же верно и для фланкирующих последовательностей, предоставленных в настоящем документе. Таким образом, растение, содержащее полинуклеотид, имеющий некоторую степень идентичности с рассматриваемыми фланкирующими и/или вставочными последовательностями, находится в рамках объема данного изобретения. Идентичность полинуклеотидной последовательности с последовательностью по настоящему изобретению может составлять, по меньшей мере, 65% идентичности последовательности, более предпочтительно, по меньшей мере, 70% идентичности последовательности, более предпочтительно, по меньшей мере, 75% идентичности последовательности, более предпочтительно, по меньшей мере, 80% идентичности и более предпочтительно, по меньшей мере, 85% 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичности последовательности с последовательностью, приведенной в качестве примера или описываемой в настоящем документе. Гибридизацию и условия гибридизации, описанные в настоящем документе, также можно использовать для определения таких растений и полинуклеотидных последовательностей по данному изобретению. Последовательность, которая содержит фланкирующие последовательности, а также полную вставочную последовательность, можно подтверждать со ссылкой на хранящиеся в банке семена.

Поскольку "события" исходно представляют собой случайные события, в качестве части данного изобретения, по меньшей мере, 2500 семян линии сои, содержащей событие pDAB8264.44.06.1, помещали в банк для хранения с публичным доступом без ограничений (однако защищали патентными правами) в Американской коллекции типовых культур (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. Депозит обозначали депозитным номером ATCC PTA-11336. 100 пакетов (25 семян на пакет) семян Glycine max ("семена сои Glycine max L.: pDAB8264.44.06.1") были помещены в банк от имени Dow AgroSciences LLC и MS Technologies, LLC - 14 сентября 2010 года. Депозит тестировали 04 октября 2010 года, и в тот момент семена были жизнеспособными. Этот депозит был получен, и хранится, согласно правилам Будапештского договора в отношении депозитов семян для использования в процедурах выдачи патентов. Депозит будет храниться без ограничений в хранилище ATCC, которое представляет собой публичное хранилище, в течение 30 лет, или в течение пяти лет после последнего запроса, или в течение срока действия патента, в зависимости от того, какой срок дольше, и будет заменен в том случае, если станет нежизнеспособным в течение этого периода.

В качестве части данного изобретения, по меньшей мере, 2500 семян линии сои, содержащей Событие pDAB9582.812.9.1 и событие pDAB8264.44.06.1 (рассматриваемое событие устойчивости к гербицидам и событие 812 устойчивости к насекомым) помещали в банк для хранения с публичным доступом без ограничений (однако, защищали патентными правами) в Американской коллекции типовых культур (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. Депозит обозначали в ATCC как "Номер: pDAB9582.812.9.1:: Событие pDAB8264.44.06.1. 100 пакетов (25 семян на пакет) семян Glycine max ("семена сои семян Glycine max L. pDAB8264.44.06.1") были помещены в банк 18 ноября 2011 года. Этот депозит был получен, и хранится согласно правилам Будапештского договора в отношении депозитов семян для использования в процедурах выдачи патентов. Депозит будет храниться без ограничений в хранилище ATCC, которое представляет собой публичное хранилище, в течение 30 лет, или в течение пяти лет после последнего запроса, или в течение срока действия патента, в зависимости от того, какой срок дольше, и будет заменен в том случае, если станет не жизнеспособным в течение этого периода.

Хранящиеся в банке семена являются частью данного изобретения. Ясно, что из этих семян можно выращивать растения сои, и такие растения являются частью данного изобретения. Данное изобретение также относится к ДНК-последовательностям, содержащимся в этих растениях сои, которые пригодны для детектирования этих растений и их потомков. Способы детектирования и наборы по данному изобретению могут быть направлены на идентификацию любого одного, двух или даже всех трех этих событий, в зависимости от конечной цели теста.

Определения и примеры приведены в настоящем документе для облегчения описания настоящего изобретения и для помощи специалистам в данной области в осуществлении изобретения. Если не указано иначе, термины нужно понимать согласно общепринятому применению среди специалистов в соответствующей области. Использована номенклатура оснований ДНК, приведенная в 37 CFR § 1.822.

В рамках изобретения термин "потомки" обозначает потомство любого поколения родительского растения, которое содержит Событие сои pDAB8264.44.06.1.

Трансгенное "событие" получают посредством трансформации растительных клеток гетерологичной ДНК, т.е. конструкцией нуклеиновой кислоты, содержащей рассматриваемый трансген, восстановлением популяции растений, полученных в результате вставки трансгена в геном растения и отбора определенного растения, несущего вставку в определенный участок генома. Термин "событие" относится к исходному трансформанту и потомкам трансформанта, которые содержат гетерологичную ДНК. Термин "событие" также относится к потомкам, полученным посредством скрещивания трансформанта и другой разновидности, которая содержит геномную/трансгенную ДНК. Даже после повторного возвратного скрещивания с рекуррентным родителем, вставленная трансгенная ДНК и фланкирующая геномная ДНК (геномная/трансгенная ДНК) из трансформированного родительского растения, остается у потомков от скрещивания в том же участке хромосомы. Термин "событие" также относится к ДНК из исходного трансформанта и его потомкам, содержащим вставленную ДНК и фланкирующую геномную последовательность, непосредственно прилежащую к вставленной ДНК, которая, как ожидают, передается потомкам, получающим вставленную ДНК, включая рассматриваемый трансген, в результате скрещивания родительской линии, которая содержит вставленную ДНК (например, исходный трансформант и потомство от самоопыления), и родительской линии, которая не содержит вставленной ДНК.

"Соединяющая последовательность" охватывает точку, в которой ДНК, вставленная в геном, соединяется с ДНК из исходного генома сои, фланкирующей место вставки, где идентификация или детектирование той или иной соединяющей последовательности в генетическом материале растения является достаточным для диагностики события. Включены последовательности ДНК, которые охватывают вставки в описанных в настоящем документе событиях