Связанные со стрептавидином магнитные частицы и способ их изготовления

Связанные со стрептавидином магнитные частицы и способ их изготовления

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к связанным со стрептавидином магнитным частицам и к способу их изготовления, к связанным с белком магнитным частицам, изготовленным с использованием связанных со стрептавидином магнитных частиц, и к способу их изготовления; к способу измерения измеряемого компонента и к реагенту для измерения измеряемого компонента.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В диагностических материалах магнитные частицы часто используют как твердофазные носители для обнаружения измеряемых веществ, таких как гормоны, онкомаркеры и маркеры инфекций. В таких измерительных системах антитела, антигены и т.п. (первичные зонды) присоединены к магнитным частицам, и они связаны с измеряемыми веществами в образце, и, кроме того, измеряемые вещества дополнительно связаны с вторичными зондами, маркированными флуоресцентными веществами, хемилюминесцентными субстратами, ферментами и т.п., и измеряемые вещества определяются качественно или количественно.

В последнее время существует необходимость повышения чувствительности анализов для раннего обнаружения заболеваний, увеличения точности анализов, применения высокочувствительных маркеров в следовых количествах и т.п. Существует также необходимость повышения скорости анализов вследствие высокой производительности обслуживающих учреждений аналитических центров, скорого получения результатов анализов, предназначенных для оказания услуг пациентам, и т.п.

В качестве средства обеспечения повышенной чувствительности и скорости измерительных систем с использованием таких магнитных частиц часто используют способ реакции первичного зонда и вторичного зонда в жидкой фазе и последующего присоединения их к магнитным частицам. Представительным примером является способ, в котором маркированный биотином первичный зонд, изготовленный присоединением биотина к первичному зонду, реагирует с измеряемым компонентом в образце и вторичным зондом, образуя комплекс, включающий маркированный биотином первичный зонд, измеряемый компонент и вторичный зонд, и после этого связанные с авидином магнитные частицы могут воздействовать на комплекс, присоединяя комплекс к магнитной частице посредством взаимодействия авидина и биотина.

Что касается таких связанных с авидином магнитных частиц, более полезными являются связанные со стрептавидином магнитные частицы с использованием стрептавидина, который имеет такие же свойства, как авидин. Как и авидин, стрептавидин очень прочно соединяется с биотином и обладает свойством более высокой устойчивости к денатурации, чем авидин. Кроме того, авидин имеет изоэлектрическую точку в основной области, в то время как изоэлектрическая точка стрептавидина находится в слабокислой или нейтральной области; таким образом, известно, что стрептавидин обладает преимуществом проявления очень слабого неспецифического связывания с другими белками. Связанные со стрептавидином магнитные частицы с использованием этого стрептавидина применяются для многих целей.

Однако существует ограничение количества стрептавидина, которое можно присоединять к магнитным частицам, и, таким образом, необходимо использовать большое число связанных со стрептавидином магнитных частиц, чтобы обеспечивать способность связывания биотина, требуемую для реагента в каждом анализе, что приводит к проблемам, таким как высокая стоимость изготовления. Кроме того, существуют следующие проблемы при измерениях, в которых используют связанные со стрептавидином магнитные частицы:

(1) поскольку магнитные частицы осаждаются в статических условиях, их необходимо диспергировать в процессе использования, и для их диспергирования требуются затраты времени и сил в случае высокого содержания частиц;

(2) когда присутствует высокое содержание частиц, эти частицы занимают большой объем, когда их переносят на одну сторону контейнера, используя магнит, и это приводит к снижению эффективности вымывания реакционного раствора, задержанного внутри них в процессе разделения связанных и свободных частиц и промывания; и

(3) мутность, вызванная цветом самих магнитных частиц, увеличивается, когда существует большое количество магнитных частиц в процессе обнаружения измеряемого компонента, и, например, при обнаружении посредством хемилюминесценции и флуоресценции чувствительность уменьшается вследствие оптического экранирования.

В условиях, где количество связанных со стрептавидином магнитных частиц ограничено созданием минимально требуемой способности связывания биотина, существует возможность, что конкуренция с биотином (витамином H), который присутствует в образце, ингибирует реакцию для измерения, и можно не получить точные значения анализов. Биотин можно принимать в качестве добавки или вводить в качестве лекарственного средства, и такие проблемы часто отмечаются.

До настоящего времени было предложено несколько способов в качестве средства решения данной проблемы. Один из них представляет собой способ уменьшения размера магнитных частиц для увеличения удельной поверхности этих частиц. Однако уменьшение размера частиц также имеет свои проблемы. Например, время, расходуемое на сбор частиц с помощью магнита, может значительно увеличиваться, и большее число частиц может уноситься в процессе осуществления подачи и удаления промывочного раствора на стадии промывания. Патентный документ 1 описывает, в качестве способа отделения вещества, подлежащего обнаружению в образце, способ сбора магнитных частиц из водного раствора путем использования магнитных частиц, модифицированных на поверхности чувствительными к температуре полимерами, причем даже магнитные частицы, у которых средний размер составляет от 50 нм до 1000 нм, можно собирать посредством агрегации частиц на чувствительных к температуре полимерах. Хотя такие частицы обладают преимуществами в реакции вследствие уменьшения размера магнитных частиц, они проявляют неспецифическую адсорбцию вследствие покрытия поверхности частиц чувствительными к температуре полимерами, и для них требуется предпринимать меры по изменению условий на особые условия для агрегации.

Кроме того, предложены также способы изготовления пористых нерастворимых носителей для увеличения их удельной поверхности. Например, патентный документ 2 описывает способ химического образования пористого слоя на внешнем слое магнитных частиц. Согласно данному способу, хотя связующая способность в расчете на единичную площадь поверхности увеличивается в иммунологических реакциях между антигенами и антителами, а также в гибридизации между ДНК или между ДНК и РНК, эффективность реакций в порах является неудовлетворительной, и таким образом оказывается затруднительным достижение предполагаемой производительности.

ДОКУМЕНТЫ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Патентные документы

Патентный документ 1 - публикация японской патентной заявки Kokai № (JP-A) 2009-28711 (нерассмотренная опубликованная японская патентная заявка)

Патентный документ 2 - публикация японской патентной заявки Kokai № (JP-A) 2006-307126

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Проблемы, решаемые изобретением

Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить связанные со стрептавидином магнитные частицы, имеющие высокую способность связывания биотина, и способ их изготовления. Кроме того, еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить связанные с белком магнитные частицы, изготовленные с использованием связанных со стрептавидином магнитных частиц, которые имеют высокую способность связывания биотина, и способ их изготовления, а также способ измерения измеряемого компонента и реагент для измерения измеряемого компонента.

Средства решения проблем

Авторы настоящего изобретения осуществили назначенные исследования, чтобы решить данные проблемы, и обнаружили, что связанные со стрептавидином магнитные частицы, имеющие высокую способность связывания биотина, можно получать в реакции магнитных частиц со стрептавидином и глутаральдегидом посредством введения глутаральдегида в присутствии стрептавидина в суспензию, содержащую магнитные частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы; и авторы настоящего изобретения выполнили настоящее изобретение. Более конкретно, настоящее изобретение относится к представленным ниже пп. [1]-[12]:

[1] связанные со стрептавидином магнитные частицы, имеющие структуру, в которой молекулы стрептавидина сшиты друг с другом на магнитной частице;

[2] связанные со стрептавидином магнитные частицы по п. [1], которые изготавливают способом, включающим следующие стадии:

(1) изготовление суспензии, содержащей магнитные частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы; и

(2) реакция магнитных частиц со стрептавидином и глутаральдегидом путем введения глутаральдегида в присутствии стрептавидина в суспензию, изготовленную на стадии (1);

[3] связанные со стрептавидином магнитные частицы по п. [2], которые изготавливают способом, дополнительно включающим следующую стадию (3):

(3) реакция связанных со стрептавидином магнитных частиц, изготовленных на стадии (2), с восстановителем;

[4] связанные с белком магнитные частицы, которые изготавливают, используя связанные со стрептавидином магнитные частицы по любому из пп. [1]-[3] и биотинилированный белок;

[5] способ измерения измеряемого компонента в образце, в котором используют связанные с белком магнитные частицы по п. [4];

[6] способ измерения измеряемого компонента в образце, в котором используют связанные со стрептавидином магнитные частицы по любому из пп. [1]-[3] и биотинилированный белок;

[7] реагент для измерения измеряемого компонента в образце, который включает связанные с белком магнитные частицы по п. [4];

[8] реагент для измерения измеряемого компонента в образце, который включает связанные со стрептавидином магнитные частицы по любому из пп. [1]-[3] и биотинилированный белок;

[9] способ изготовления связанные со стрептавидином магнитные частицы, который включает следующие стадии:

(1) изготовление суспензии, содержащей магнитные частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы; и

(2) реакция магнитных частиц со стрептавидином и глутаральдегидом путем введения глутаральдегида в присутствии стрептавидина в суспензию, изготовленную на стадии (1);

[10] способ изготовления по п. [9], дополнительно включающий следующую стадию (3):

(3) реакция связанных со стрептавидином магнитных частиц, изготовленных на стадии (2), с восстановителем;

[11] способ изготовления связанных с белком магнитных частиц, который включает следующие стадии:

(1) изготовление суспензии, содержащей магнитные частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы;

(2) изготовление связанных со стрептавидином магнитных частиц путем введения глутаральдегида в присутствии стрептавидина в суспензию, изготовленную на стадии (1); и

(3) реакция связанных со стрептавидином частиц, изготовленных на стадии (2), с биотинилированным белком; и

[12] способ изготовления связанных с белком магнитных частиц, который включает следующие стадии:

(1) изготовление суспензии, содержащей магнитные частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы;

(2) изготовление связанных со стрептавидином магнитных частиц путем введения глутаральдегида в присутствии стрептавидина в суспензию, изготовленную на стадии (1);

(3) реакция связанных со стрептавидином магнитных частиц, изготовленных на стадии (2), с восстановителем (1); и

(4) реакция связанных со стрептавидином магнитных частиц, изготовленных на стадии (3), с биотинилированным белком.

ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предлагает связанные со стрептавидином магнитные частицы, имеющие высокую способность связывания биотина, и способ их изготовления, связанные с белком магнитные частицы, изготовленные с использованием связанных со стрептавидином магнитных частиц, и способ их изготовления, способ измерения измеряемого компонента и реагент для измерения измеряемого компонента. Связанные со стрептавидином магнитные частицы и связанные с белком магнитные частицы, изготовленные способом изготовления согласно настоящему изобретению, а также способ измерения измеряемого компонента и реагент для измерения измеряемого компонента согласно настоящему изобретению можно использовать в клинической диагностике.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет электрофоретический профиль SDS-PAGE, показывающий структуры молекул стрептавидина на магнитных частицах связанных со стрептавидином магнитных частиц согласно настоящему изобретению и имеющихся в продаже связанных со стрептавидином магнитных частиц. Дорожки представляют собой следующие: дорожка 1 - молекулярные маркеры; дорожка 2 - стрептавидин; дорожка 3 - связанные со стрептавидином магнитные частицы, имеющие способность связывания биотина на уровне 2,61 пмоль/мм²; дорожка 4 - связанные со стрептавидином магнитные частицы, имеющие способность связывания биотина на уровне 4,95 пмоль/мм²; дорожка 5 - связанные со стрептавидином магнитные частицы, имеющие способность связывания биотина на уровне 6,76 пмоль/мм²; дорожка 6 - имеющиеся в продаже связанные со стрептавидином магнитные частицы Dynabeads T1 (производитель Dynal); и дорожка 7 - имеющиеся в продаже связанные со стрептавидином магнитные частицы BE-M08/10 (производитель Merck). Полоска A представляет мономеры, полоска B представляет димеры, полоска C представляет тримеры, полоска D представляет тетрамеры, и полоска E представляет сшитые структуры более высокого порядка.

Фиг.2 представляет фотографии, показывающие диспергируемость связанных со стрептавидином магнитных частиц согласно настоящему изобретению. Верхняя фотография представляет статическое состояние связанных со стрептавидином магнитных частиц, и нижняя фотография представляет диспергированное состояние связанных со стрептавидином магнитных частиц после перемешивания посредством 25-кратного переворачивания.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Связанные со стрептавидином магнитные частицы

Связанные со стрептавидином магнитные частицы согласно настоящему изобретению имеют структуру, в которой молекулы стрептавидина сшиты друг с другом на магнитных частицах. Молекулы стрептавидина образуют тетрамерную структуру, в которой мономеры соединены друг с другом посредством нековалентных связей. В связанных со стрептавидином магнитных частицах согласно настоящему изобретению эти молекулы стрептавидина, имеющие тетрамерную структуру, ковалентно соединены друг с другом посредством глутаральдегида, образуя сшитую структуру на магнитных частицах. Молекулы стрептавидина присоединены к аминогруппам магнитных частиц посредством глутаральдегида. Более конкретно, часть молекул стрептавидина, имеющих тетрамерную структуру, присоединена к аминогруппам магнитных частиц посредством глутаральдегида. Сшитую структуру стрептавидина можно подтвердить способом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), гельпроникающей жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC), например, помещая связанные со стрептавидином магнитные частицы в раствор 1% SDS и подвергая их нагреванию при 60°C в течение одного часа для разрушения связей между фрагментами молекул стрептавидина, которые присоединены к магнитным частицам. Способ SDS-PAGE представляет собой способ разделения белков в зависимости от их размера посредством электрофореза и является способом разделения и идентификации белков на основании полученного электрофоретического профиля путем денатурации образца с использованием SDS и последующего воздействия электрофореза в полиакриламидном геле на денатурированный белок. Способ SDS-PAGE не ограничивается определенным образом при том условии, что он представляет собой способ, которым можно подтверждать сшитые структуры стрептавидина, и его примером является способ, описанный в работе «Baio Jikken Irasutoreiteddo (Bio-experiment Illustrated, Иллюстрированные биологические эксперименты) 5» (Cell Engineering Supplement, Приложение клеточной инженерии, Shujunsha).

В процессе SDS-PAGE молекулы стрептавидина, имеющие тетрамерную структуру, теряют свою тетрамерную структуру посредством денатурирующей обработки в присутствии SDS. Если молекулы стрептавидина на магнитных частицах не присутствуют в форме сшитых структур, продукт разложения, который можно получать посредством денатурирующей обработки в присутствии SDS, будет представлять собой исключительно образующиеся из стрептавидина мономеры. С другой стороны, если молекулы стрептавидина на магнитных частицах присутствуют в форме сшитых структур, денатурирующая обработка в присутствии SDS должна производить, помимо образующихся из стрептавидина мономеров, также димеры, тримеры и олигомеры более высокого порядка, которые присутствуют в сшитых структурах молекул стрептавидина. Таким образом, в том случае, если в процессе SDS-PAGE наблюдаются полоски, которые создают образующиеся из стрептавидина мономеры, димеры, тримеры и олигомеры более высокого порядка, это означает, что сшитые структуры молекул стрептавидина образуются на магнитных частицах.

Связанные со стрептавидином магнитные частицы согласно настоящему изобретению имеют высокую способность связывания биотина, потому что они имеют структуру, в которой молекулы стрептавидина сшиты друг с другом на магнитных частицах. Способность связывания биотина в расчете на одну частицу из связанных со стрептавидином магнитных частиц согласно настоящему изобретению составляет, как правило, от 0,5 до 10 пмоль/мм², предпочтительно от 2 до 9 пмоль/мм² и особенно предпочтительно от 4 до 8 пмоль/мм². Связанные со стрептавидином магнитные частицы согласно настоящему изобретению также имеют хорошую диспергируемость, которая представляет собой превосходное свойство. Диспергируемость связанных со стрептавидином магнитных частиц можно определять, например, помещая частицы в кювету, перемешивая осажденные связанные со стрептавидином магнитные частицы путем переворачивания и подтверждая состояние внутри кюветы посредством визуального наблюдения.

Способность связывания биотина в расчете на одну частицу из связанных со стрептавидином магнитных частиц согласно настоящему изобретению можно измерять любым способом при том условии, что он представляет собой способ, которым можно измерять способность связывания биотина. Например, способность связывания можно вычислять, вводя в реакцию данное количество флуоресцентного маркированного биотина и данное количество связанных со стрептавидином магнитных частиц, собирая связанные со стрептавидином магнитные частицы с помощью магнита, затем собирая данное количество надосадочной жидкости, измеряя интенсивность флуоресценции собранной надосадочной жидкости и сопоставляя полученные при измерениях значения с построенной заблаговременно калибровочной кривой, которая показывает соотношение между интенсивностью флуоресценции и концентрацией биотина.

В связанных со стрептавидином магнитных частицах согласно настоящему изобретению стрептавидин может представлять собой естественно произведенный или генетически модифицированный стрептавидин, причем генетически модифицированный стрептавидин является предпочтительным.

В связанных со стрептавидином магнитных частицах согласно настоящему изобретению магнитные частицы, с которыми связан стрептавидин, представляют собой частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы. Магнитные частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы согласно настоящему изобретению, не ограничиваются определенным образом, при том условии, что из них можно производить связанные со стрептавидином магнитные частицы согласно настоящему изобретению. Примеры структуры частицы из магнитных частиц, на поверхности которых находятся аминогруппы согласно настоящему изобретению, включают магнитные частицы с содержащей ядро и оболочку структурой, в которой внутренняя область частиц содержит магнитное вещество, и внешний слой состоит из органического полимера; магнитные частицы, имеющие структуру, которая не включает внешний слой и содержит магнитные вещества, неоднородно диспергированные в органическом полимере; и магнитные частицы в кластерном состоянии, состоящие исключительно из магнитных веществ.

Конкретные примеры магнитных частиц, на поверхности которых находятся аминогруппы (имеющиеся в продаже продукты), включают содержащие аминогруппы магнитные частицы Estapor (производитель Merck).

Магнитные вещества, содержащиеся в магнитных частицах, предпочтительно представляют собой суперпарамагнитные микрочастицы с небольшой остаточной намагниченностью, в качестве которых используют, например, разнообразные ферриты, такие как оксид железа(II, III) (Fe₃O₄) и γ-оксид железа(III) (γ-Fe₂O₃), металлы, такие как железо, марганец, кобальт и хром, сплавы этих металлов и т.п.

Содержание магнитных веществ в магнитных частицах, состоящих из органических полимеров и магнитных веществ, составляет предпочтительно 10 мас.% или более и предпочтительнее 30-60 мас.% по отношению к суммарной массе магнитных частиц.

Примеры формы магнитных частиц включают сферические и игольчатые формы, причем предпочтительными являются сферические формы. Размер магнитных частиц составляет, например, от 0,1 до 5 мкм и предпочтительно от 0,5 до 3 мкм.

2. Способы изготовления связанных со стрептавидином магнитных частиц

Способ изготовления связанные со стрептавидином магнитные частицы согласно настоящему изобретению представляет собой способ изготовления, включающий следующие стадии:

(1) изготовление суспензии, содержащей магнитные частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы; и

(2) реакция магнитных частиц со стрептавидином и глутаральдегидом путем введения глутаральдегида в присутствии стрептавидина в суспензию, изготовленную на стадии (1).

Связанные со стрептавидином магнитные частицы согласно настоящему изобретению можно изготавливать путем использования способов изготовления согласно настоящему изобретению.

(1) Стадия изготовления суспензии, содержащей магнитные частицы

Суспензию, содержащую магнитные частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы, можно изготавливать введением магнитных частиц, на поверхности которых находятся аминогруппы, в водную среду или добавлением водной среды к магнитным частицам, на поверхности которых находятся аминогруппы. Примеры магнитных частиц, на поверхности которых находятся аминогруппы, включают вышеупомянутые магнитные частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы. Водная среда не ограничивается определенным образом при том условии, что она представляет собой водную среду, которая способна суспендировать магнитные частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы, и соответствующие примеры включают дистиллированную воду, очищенную воду и буферный раствор. Значение pH водной среды составляет обычно от 4,5 до 7 и предпочтительно от 5 до 6. Когда используют буферный раствор в качестве водной среды, оказывается желательным использование буферного раствора, соответствующего устанавливаемому значению pH. Примеры буферных растворов, используемых в соответствующем качестве, включают ацетатный буферный раствор, цитратный буферный раствор, сукцинатный буферный раствор, фосфатный буферный раствор и буферные растворы Гуда (Good).

К числу примеров буферных растворов Гуда относятся 2-морфолиноэтансульфоновая кислота (MES), бис(2-гидроксиэтил)иминотрис(гидроксиметил)метан (Bis-Tris), пиперазин-N,N’-бис(2-этансульфоновая кислота) (PIPES), N-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновая кислота (ACES), 3-морфолино-2-гидроксипропансульфоновая кислота (MOPSO), N,N-бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновая кислота (BES), 3-морфолинопропансульфоновая кислота (MOPS), N-[трис(гидроксиметил)метил]-2-аминоэтансульфоновая кислота (TES), 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоновая кислота (HEPES), 3-[N,N-бис(2-гидроксиэтил)амино]-2-гидроксипропансульфоновая кислота (DIPSO) и N-[трис(гидроксиметил)метил]-2-гидрокси-3-аминопропансульфоновая кислота (TAPSO).

Магнитные частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы и которые подлежат суспендированию в водной среде, можно предварительно промывать. Магнитные частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы, можно промывать, например, вводя магнитные частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы, в диспергирующую жидкость в контейнере, диспргируя магнитные частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы, затем собирая магнитные частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы, с помощью магнита, и удаляя диспергирующую жидкость, оставшуюся в контейнере, путем всасывания. Примеры диспергирующих жидкостей включают водные растворы, содержащие поверхностно-активные вещества.

Значение pH диспергирующей жидкости составляет, как правило, от 4,5 до 7 и предпочтительно от 5 до 6. Примеры водной среды, используемой в качестве водного раствора, включают вышеупомянутые водные среды. Поверхностно-активное вещество не ограничивается определенным образом при том условии, что оно обеспечивает диспергирование магнитных частиц, и соответствующие примеры включают анионные поверхностно-активные вещества, катионные поверхностно-активные вещества, амфотерные поверхностно-активные вещества и неионные поверхностно-активные вещества. Концентрация поверхностно-активного вещества в диспергирующем растворе не ограничивается определенным образом при том условии, что она представляет собой концентрацию, при которой возможно диспергирование магнитных частиц, и она составляет, например, от 0,01% до 5,0%.

(2) Стадия реакции магнитных частиц с глутаральдегидом и стрептавидином

Стадия (2) представляет собой стадию образования структуры, в которой молекулы стрептавидина сшиты на магнитных частицах посредством реакции магнитных частиц со стрептавидином и глутаральдегидом путем введения глутаральдегида, в присутствии стрептавидина, в суспензию, содержащую магнитные частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы, которые были изготовлены на стадии (1). Структура сшитых молекул стрептавидина образуется за счет ковалентных связей между молекулами стрептавидина посредством глутаральдегида. В настоящем документе введение глутаральдегида в присутствии стрептавидина означает, что стрептавидин уже присутствует, когда вводят глутаральдегид, и включает случаи, в которых стрептавидин вводят в суспензию магнитных частиц, и затем к нему последовательно добавляют глутаральдегид, а также случаи, в которых глутаральдегид и стрептавидин вводят одновременно в суспензию магнитных частиц.

Количество вводимого глутаральдегида не ограничивается определенным образом при том условии, что оно представляет собой количество, которое способно производить связанные со стрептавидином магнитные частицы согласно настоящему изобретению, и оно составляет, как правило, от 0,1 мг до 1,0 мг и предпочтительно от 0,35 мг до 0,6 мг по отношению к 100 мг магнитных частиц.

Количество вводимого стрептавидина не ограничивается определенным образом при том условии, что оно представляет собой количество, которое способно производить связанные со стрептавидином магнитные частицы согласно настоящему изобретению, и оно составляет, как правило, от 0,2 мг до 25 мг и предпочтительно от 10 мг до 15 мг по отношению к 100 мг магнитных частиц.

Концентрация магнитных частиц в реакционном растворе не ограничивается определенным образом при том условии, что она представляет собой концентрацию, которая способна производить связанные со стрептавидином магнитные частицы согласно настоящему изобретению, и она составляет, как правило, от 20 мг/мл до 80 мг/мл и предпочтительно от 40 мг/мл до 60 мг/мл.

Температура реакции составляет, как правило, от 0°C до 40°C, предпочтительно от 27,5°C до 37,5°C и особенно предпочтительно 35°C. Продолжительность реакции составляет, как правило, от 4 до 24 часов, предпочтительно от 8 до 20 часов и особенно предпочтительно 18 часов.

Хотя саму по себе реакционную смесь, полученную на стадии (2), можно использовать в качестве связанных со стрептавидином магнитных частиц согласно настоящему изобретению, магнитные частицы, которые получают, собирая с помощью магнита магнитные частицы в реакционной смеси, полученной на стадии (2), удаляя раствор, но не магнитные частицы, и затем, промывая частицы с использованием промывочного раствора, можно также использовать в качестве связанных со стрептавидином магнитных частиц согласно настоящему изобретению. Промывочный раствор не ограничивается определенным образом при том условии, что он представляет собой промывочный раствор, который способен вымывать вещества, отличные от связанных со стрептавидином магнитных частиц согласно настоящему изобретению, и соответствующие примеры включают вышеупомянутые водные среды. Кроме того, водные среды, содержащие белки и/или антисептики, можно также использовать в качестве промывочного раствора. Белки включают, например, бычий сывороточный альбумин (BSA). Антисептики включают, например, азид натрия. Кроме того, промытые магнитные частицы, можно хранить после их суспендирования в растворе для хранения. Раствор для хранения не ограничивается определенным образом при том условии, что он представляет собой раствор, который обеспечивает устойчивое хранение связанных со стрептавидином магнитных частиц согласно настоящему изобретению, и соответствующие примеры включают водные нейтральные и слабокислые буферные растворы, содержащие белки, такие как бычий сывороточный альбумин (BSA).

Способы изготовления связанных со стрептавидином магнитных частиц согласно настоящему изобретению могут дополнительно включают стадия восстановления после стадии (2). Стадия восстановления представляет собой стадию реакции связанных со стрептавидином магнитных частиц, изготовленных на стадии (2), с восстановителем. В процессе стадии (2) на магнитных частицах образуются молекулы стрептавидина со сшитыми структурами, и поскольку сшитые молекулы стрептавидина содержат основания Шиффа (Schiff), то есть имины, восстановление оснований Шиффа (иминов) с использованием восстановителя позволяет сшитым структурам становиться более устойчивыми.

После стадии (2) реакционную смесь саму по себе или промытые магнитные частицы можно использовать в качестве связанных со стрептавидином магнитных частиц на стадии восстановления. Растворитель, используемый в реакции между связанными со стрептавидином магнитными частицами и восстановителем, не ограничивается определенным образом при том условии, что он представляет собой растворитель, который способен обеспечивать протекание реакции восстановления, и соответствующие примеры включают вышеупомянутые диспергирующие жидкости. Кроме того, диспергирующую жидкость, содержащую органический растворитель, можно также использовать в качестве растворителя в реакции восстановления. Органический растворитель не ограничивается определенным образом при том условии, что он представляет собой органический растворитель, который является растворимым в воде и способен обеспечивать протекание реакции восстановления, и соответствующие примеры включают метанол, этанол и тетрагидрофуран. Восстановитель не ограничивается определенным образом при том условии, что он представляет собой восстановитель, который способен восстанавливать основания Шиффа (имины) и поддерживать сшитую структуру, и соответствующие примеры включают восстановители на основе боранов. Примеры восстановителей на основе боранов включают 2-пиколинборан и борогидрид натрия. Количество вводимого восстановителя составляет, как правило, от 0,0001 до 0,1 мас.%, предпочтительно от 0,0005 до 0,05 мас.% и особенно предпочтительно от 0,001 мас.% магнитных частиц.

Температура реакции в случае реакции восстановления составляет, как правило, от 30°C до 50°C, предпочтительно от 35°C до 45°C и особенно предпочтительно 40°C. Продолжительность реакции в случае реакции восстановления составляет, как правило, от двух до десяти суток, предпочтительно от пяти до восьми суток и особенно предпочтительно шесть суток.

После реакции восстановления магнитные частицы можно отделять с помощью магнита от компонентов раствора, отличных от магнитных частиц. Например, отделенные магнитные частицы можно промывать, используя вышеупомянутую диспергирующую жидкость или разбавленный раствор для хранения, и их можно хранить в форме суспензии в растворе для хранения. Раствор для хранения не ограничивается определенным образом при том условии, что он представляет собой раствор, который обеспечивает устойчивое хранение связанных со стрептавидином магнитных частиц согласно настоящему изобретению, и соответствующие примеры включают вышеупомянутый раствор для хранения.

3. Способы изготовления связанных с белком магнитных частиц

Связанные с белком магнитные частицы согласно настоящему изобретению изготавливают, используя связанные со стрептавидином магнитные частицы согласно настоящему изобретению и биотинилированный белок. Белки присоединяются к магнитным частицам посредством взаимодействия между стрептавидином на магнитных частицах и биотином, связанным с белком.

Например, связанные с белком магнитные частицы согласно настоящему изобретению можно изготавливать способом, который включает стадии, описанные ниже. Далее представлены конкретные варианты осуществления способа изготовления связанных с белком магнитных частиц согласно настоящему изобретению.

- Способ 1 изготовления связанных с белком магнитных частиц

(1) изготовление суспензии, содержащей магнитные частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы;

(2) изготовление связанных со стрептавидином магнитных частиц путем введения глутаральдегида в присутствии стрептавидина в суспензию, изготовленную на стадии (1); и

(3) реакция связанных со стрептавидином частиц, изготовленных на стадии (2), с биотинилированным белком.

- Способ 2 изготовления связанных с белком магнитных частиц

(1) изготовление суспензии, содержащей магнитные частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы;

(2) изготовление связанных со стрептавидином магнитных частиц путем введения глутаральдегида, в присутствии стрептавидина, в суспензию, изготовленную на стадии (1);

(3) реакция связанных со стрептавидином магнитных частиц, изготовленных на стадии (2) с восстановителем; и

(4) реакция связанных со стрептавидином магнитных частиц, изготовленных на стадии (3), с биотинилированным белком.

Реакцию между связанными со стрептавидином магнитными частицами и биотинилированными белками можно осуществлять в любых условиях при соблюдении того, что они представляют собой условия, в которых белок присоединяется к магнитным частицам. Температура реакции составляет, как правило, от 25°C до 50°C и предпочтительно от 30°C до 40°C. Продолжительность реакции составляет, как правило, от 30 минут до 24 часов, и предпочтительно от 2 до 18 часов.

Примеры белков включают антитела, которые присоединяются к измеряемому компоненту, и конкурентные вещества, которые конкурируют с измеряемым компонентом в реакции антигена и антитела. Примеры конкурентных веществ включают измеряемый компонент, а также вещество, содержащее эпитоп, распознаваемый антителом, которое присоединяется к измеряемому компоненту. Конкретные примеры белков включают иммуноглобулин IgG, антитело анти-IgG, IgM, антитело анти-IgM, IgA, антитело анти-IgA, IgE, антитело анти-IgE, апопротеин AI, антитело анти-апопротеина AI, апопротеин AII, антитело антиапопротеина AII, апопротеин B, антитело анти-апопротеина B, апопротеин E, антитело анти-апопротеина E, ревматоидный фактор, антитело анти-ревматоидного фактора, D-димер, антитело анти-D-димера, окисленный липопротеин низкой плотности (LDL), антитело антиокисленного LDL, гликозилированный LDL, антитело антигликозилированного LDL, гликоальбумин, антитело антигликоальбумина, трийодтиронин (T3), антитело анти-T3, суммарный тироксин (T4), антитело анти-T4,