Анализ и количественное определение гликированных гемоглобинов посредством капиллярного электрофореза, буферные композиции и наборы для капиллярного электрофореза

Анализ и количественное определение гликированных гемоглобинов посредством капиллярного электрофореза, буферные композиции и наборы для капиллярного электрофореза

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к области анализа и количественного определения гликированных гемоглобинов, в частности A_1c гемоглобина, методом капиллярного электрофореза.

Изобретение относится к способу анализа посредством капиллярного электрофореза биологического образца, содержащего один или несколько гемоглобинов и, в частности, один или несколько гликированных гемоглобинов, а также к буферным композициям, которые можно применять для осуществления указанного анализа, и наборам для анализа и количественного определения гликированных гемоглобинов посредством капиллярного электрофореза.

Гемоглобин (Нb) представляет собой глобулярную молекулу, обычно состоящую из четырех субъединиц, каждая из которых представлена полипептидной цепью, конъюгированной с гемом. Полипептидные цепи в совокупности называют «глобиновой частью» молекулы гемоглобина.

Все гемоглобины человека состоят из четырех полипептидных цепей: две группы по две идентичных цепи. В организме взрослого человека обычно присутствуют три типа гемоглобина: гемоглобин А (НbА), составляющий подавляющее большинство (обычно примерно 97% всего гемоглобина взрослого человека) и состоящий из двух альфа-цепей и двух бета-цепей (гемоглобин α2β2); гемоглобин А2 (НbА2) обычно составляет примерно 1-3% гемоглобина взрослого человека), состоящий из двух альфа-цепей и двух дельта-цепей (гемоглобин α2δ2); и фетальный гемоглобин (HbF), состоящий из двух альфа-цепей и двух гамма-цепей (гемоглобин α2γ2), который обнаруживается лишь в следовых количествах (обычно менее 1% гемоглобина взрослого человека) и ограничен определенной популяцией клеток ("F-клетки").

Гемоглобин включает разновидности, известные как минорные; это гликированные гемоглобины.

Термин «гликированный гемоглобин» (также известный как гликозилированный гемоглобин или гликогемоглобин) соответствует совокупности молекул гемоглобина, модифицированных путем связывания с сахарами, в основном с глюкозой, аминогруппы (NH₂) глобина; NH₂-группа гемоглобина конденсируется с альдегидной группой восстанавливающего сахара. Эта реакция, которая является неферментативной, затем стабилизируется в результате перегруппировки Амадори. Потенциальными сайтами гликирования являются N-концевые аминокислоты четырех глобиновых цепей гемоглобина (α-цепи или β-, δ-, γ-цепей - в зависимости от типа гемоглобина) и свободные амино-эпсилон-группы (в частности, из остатков лизина) глобиновых цепей гемоглобина.

Существует множество форм гликированного гемоглобина; форма зависит от количества присоединенных сахаров, природы глобиновых цепей и сахаров, связанных с указанными цепями, и расположения указанных сахаров на глобиновых цепях.

Под термином «общий гликированный гемоглобин» подразумевают молекулы гемоглобина, гликированные по любым остаткам NH₂.

Термин «гемоглобин А1 (НВА1)» используется для обозначения таких молекул гемоглобина, в которых с N-концевой аминокислотой одной или двух бета-цепей белка связана одна молекула сахара. А1 - неоднородная фракция, содержит, в частности, незначительные включения A_1a, A_1b и, особенно, A_1c. Гемоглобин A_1a (НbА_1а) включает в себя гемоглобин A_1a1 (HbA_1a1), в котором сахаром, связанным с N-концевой аминокислотой, является фруктозо-1,6-дифосфат, и гемоглобин A_1a2 (HbA_1a2), в котором сахаром, связанным с N-концевой аминокислотой, является глюкозо-6-фосфат. В случае гемоглобина А_1b (НbА_1b) сахаром, связанным с N-концевой аминокислотой, является пируват. И, наконец, сахаром, связанным с N-концевой аминокислотой бета-цепи гемоглобина A_1c (НbА_1с), является глюкоза; HbA_1c образуется путем конденсации одной молекулы глюкозы с NH₂-гpyппoй N-концевого валина бета-цепи с формированием стабильного аминокетона в результате перегруппировки (перегруппировки Амадори) из образованного ранее неустойчивого альдимина (обозначаемого как «лабильный HbA_1c», или npe-A_1c).

Наконец, термин «гемоглобин А0 (НВА0)» обычно включает не-гликированные гемоглобины и гликированные гемоглобины, не имеющие в составе сахаров, связанных с N-концевыми аминокислотами β-цепей.

Гликирование белков (включая гликированные гемоглобины и, в частности, гемоглобин A_1c, наряду с многими другими) вызывается слишком высокой концентрацией сахаров в крови (как, например, в случае диабета). Гликирование белков изменяет их функционирование, вызывает повреждение клеток и тканей, старение сосудов, а также вносит вклад в прогрессирование некоторых заболеваний, таких как атеросклероз, почечная недостаточность, диабетическая ретинопатия и катаракта. После гликирования способность гемоглобина к переносу кислорода снижается.

Среди гемоглобинов всех групп и подгрупп гемоглобин НbА_1с представляет особый интерес, поскольку служит долгосрочным маркером диабетического состояния пациентов. Образование HbA_1c зависит от гликемии (концентрации глюкозы в крови). Тем не менее, оно происходит в течение всего срока жизни эритроцитов, составляющего, как правило, 120 дней. Концентрация HbA_1c в крови, таким образом, является показателем средних уровней гликемии за 2-3 предшествующих количественному определению месяца. Повышение концентрации НbА_1с в крови свидетельствует о длительной гипергликемии в этот период. Концентрация HbA_1c в крови не зависит от краткосрочных колебаний уровней глюкозы в крови. Таким образом, измерение уровней НbА_1с в начале и конце определенного периода времени позволяет отслеживать развитие диабета.

В случае пациентов, страдающих диабетом, целью является достижение концентраций HbA_1c, как можно более близких к характерным для хорошего гликемического баланса. Эталонные значения концентраций НbА_1c в крови не страдающего диабетом человека с нормальной гликемией составляют от 4% до 6% от общей концентрации гемоглобинов А (гликированных и не гликированных гемоглобинов) (т.е. от 20 до 42 ммоль/моль; Panteghini et al, 2007).

Таким образом, распознавание гликированных гемоглобинов, в частности выявление увеличения уровня НbА_1c, представляет интерес для диагностики диабета (типа 1 или типа 2) или мониторинга пациентов с диабетом, в частности для оценки эффективности лечения диабета (типа 1 или типа 2).

Однако интерпретация результатов может в некоторых случаях представлять собой трудную задачу, поскольку множество факторов - в частности, присутствие абнормальных гемоглобинов - может приводить к искажению результатов.

Действительно, у некоторых пациентов встречаются гемоглобины, объединяемые термином «абнормальные» или абберантные, в частности обозначаемые буквами S, С, D, Е, Н и J. Одна или несколько форм абнормальных гемоглобинов частично или полностью замещают гемоглобин А. Абнормальные гемоглобины образуются, в частности, в результате снижения уровней синтеза определенных глобиновых цепей и/или изменения структуры α, β, γ или δ цепей в результате замены одной аминокислоты на другую. Таким образом, модификация бета-цепи может, например, приводить к формированию S- или С-гемоглобинов (α2β2-гемоглобинов, в которых глутаминовая кислота в положении 6 в β-цепи замещена, соответственно, валином или лизином).

Эти абнормальные гемоглобины также восприимчивы к гликированию. Таким образом, существуют гемоглобины S_1c (HbS_1c) и C_1c (HbC_1c), в которых, как и в HbA_1c, одна молекула глюкозы связана с N-концевым валином β-цепи (Abraham et al., 1984).

Методы анализа и количественного определения гликированного гемоглобина и, в частности, гемоглобина HbA_1c могут быть разделены на две большие категории.

Первая и основная категория включает такие методы, как иммунологический анализ и аффинная хроматография. Они основаны на структурных характеристиках молекул сахара, связанных с гемоглобином. Например, в публикации (Wilson et al, 1993) и в патенте США 6162645 описан метод количественного определения гликированного гемоглобина в образце крови человека при помощи аффинной хроматографии. Указанный метод основан на использовании твердой положительно заряженной фазы, связанной через полианионное соединение (например, полиакриловую кислоту) с бороновой кислотой, фенилбороновой кислотой, борной кислотой или аналогичными боронатными соединениями. При инкубации исследуемого образца крови с твердой фазой присутствующие в образце остатки глюкозы в молекулах гликированного гемоглобина образуют комплексы с боронатными соединениями. Молекулы гликированного гемоглобина, таким образом, оказываются прикреплены к твердой фазе. После этого может быть подсчитано отношение количества иммобилизованного на твердой фазе гликированного гемоглобина к количеству не иммобилизованного гемоглобина. Это осуществляется либо путем измерения уменьшения интенсивности флуоресценции (Wilson et al., 1993), либо с помощью меченых антител к гемоглобину человека (US 6,162,645).

Вторая категория методов анализа и количественного определения гликированного гемоглобина включает ионообменную хроматографию или электрофорез. Эти методы основаны на физико-химических характеристиках молекул; используется разница зарядов, существующая между гликированными и не гликированными белками.

В числе разнообразных описанных в литературе аналитических методов, позволяющих осуществить количественное определение гликированного гемоглобина, электрофоретические методы подразделяют на несколько категорий: гельэлектрофорез, включающий изоэлектрофокусирование в полиакриламидном геле (Beccaria, 1978; Simon, 1982; Stickland, 1982; Bosisio, 1994) и электрофорез в агарозном геле (US 5,246,558; US 4,222,836; Menard, 1980). Методы капиллярного электрофореза включают изоэлектрофокусирование (Molteni, 1994; Hempe, 1994), анализ в свободном растворе с использованием анти-A_1c антител (патент США 5431793), анализ в свободном растворе с использованием капилляра без покрытия (US 5,599,433) и анализ в свободном растворе с динамическим нанесением фазы (ЕР 0 733 900 А2; US 5,611,903).

С помощью электрофоретического анализа биологического образца можно разделить различные белки, присутствующие в образце, в частности различные гемоглобины, а также определить количество и/или относительное содержание одного или нескольких представляющих интерес белков в биологическом образце. В процессе капиллярного электрофореза в заполненной электролитом капиллярной колонке характер движения белков биологического образца от анода к катоду под действием электрического поля зависит от их массы и заряда. Таким образом, формируется профиль электрофоретической миграции, включающий ряд пиков (также называемых фракциями), каждый из которых соответствует одному или нескольким белкам. Абнормальные гемоглобины, такие как HbS, НbС и НbЕ, имеют отличную от характерной для НbА электрофоретическую подвижность. Кроме того, из-за остатка сахара, связанного с N-концевой аминокислотой в бета-цепи, HBA₁ свойственно меньшее значение изоэлектрической точки и, как результат, электрический заряд, немного отличающийся от характерного для других гемоглобинов НВА₀-типа. Таким образом, в электрофоретическом поле или в ионообменной смоле скорость миграции HBA₁ отличается от скорости НВА₀, что позволяет отделить HBA₁ от НВА₀, имеющего другой заряд.

Преимущество капиллярного электрофореза также заключается в том, что для анализа требуются очень небольшие количества биологического образца. Кроме того, разделение с помощью этой методики может быть очень быстрым, поскольку может быть использовано высокое напряжение без опасности перегрева образца во время разделения.

Анализ методом изоэлектрической фокусировки (Molteni, 1994; Hempe, 1994) осуществляют в закрытых капиллярах. Для изоляции используют метилцеллюлозу. В качестве католита используют гидроксид натрия (NaOH), в качестве анолита - фосфорную кислоту (Н₃РО₄). Использование амфолитов при этом методе анализа дает возможность выделения различных вариантов гемоглобина, в том числе HbA_1c, пик которого очень близок к пику НbА (Δрl<0,10). Несмотря на то что данный метод хорошо работает, он не является простым для рутинного проведения и требует большой точности, в частности в отношении диапазонов рН амфолитов (изоэлектрическая точка (pl) НbА_1c очень близка к таковой НВА₀).

Анализ в свободном растворе с использованием анти-HbA_1c антител (US 5,431,793) проводят в боратном буфере при основных значениях рН (рН от 8 до 10), с использованием образцов, обработанных моноклональными антителами анти-НbА_1c. Точнее говоря, первую электрофореграмму получают с использованием рабочего образца без предварительной реакции с антителами анти-HbA_1c. Получают единственный пик площадью х, содержащий все гемоглобины (включая НbА_1c). Вторую электрофореграмму получают путем анализа рабочего образца, обработанного антителами к HbA_1c. Определяют таким образом несвязанные анти-НbА_1c антитела, комплексы анти-HbA_1c/HbA_1c, что обеспечивает разделение не связанных с антителами гемоглобинов. Количество HbA_1c в этом случае определяют по разности площади под пиком первой электрофореграммы и площади под пиком второй электрофореграммы, соответствующим гемоглобинам, не связанным с анти-НbА_1c антителами (площадь у), т.е. подсчитывают разность площадей х-у. Этот метод, таким образом, является времязатратным и сложным для реализации.

При анализе в свободном растворе с использованием капилляров без покрытия (US 5,599,433) используют образующий комплекс с сахаром агент, связанный с гемоглобином (борат) и цвиттерионный буфер (CAPS) при основных значениях рН (рН от 9 до 12). На полученном в описанных условиях профиле (показанном на рисунке 1 настоящей заявки) видно довольно незначительное разделение пиков HbA₁ (описанного как пик HbA_1c в патенте US 5,599,433) и НbА₀ (см. пример 1). Кроме того, анализ очищенных минорных фракций показывает, что фракции НbА_1а,b мигрируют совместно с HbA_1c, влияя на конечный результат количественного определения (см. пример 2 и рисунок 2 настоящей заявки). Фактически, данная методика позволяет отделить фракции НbА₀ и HbA₁, но не сами фракции HbA₁.

Методика капиллярного анализа с двойным динамическим покрытием (ЕР 0 733 900 А2; US 5,611,903) используется в единственном тесте на основе капиллярного электрофореза, который является коммерчески доступным (Analis CEofix ™ НbА_1с). Он состоит из первой промывки капилляра «инициатором», содержащим поликатион (в растворе, рН 4,6), что обеспечивает покрытие стенок капилляра указанным поликатионом. Затем осуществляют вторую промывку аналитическим буфером, содержащим полианион (рН 4,6), обеспечивающий образование второго слоя покрытия за счет взаимодействия с поликатионом. Отрицательный электрический заряд, формирующийся таким образом на внутренних стенках капилляра, даже выше, чем в капилляре без покрытия, что обеспечивает значительно более интенсивный электроосмотический ток. Разрешение метода при анализе различных форм гемоглобина (в том числе гликированных гемоглобинов А1) является удовлетворительным, анализ занимает короткое время. На пректике описанное двойное покрытие нужно обновлять перед каждым новым анализом, используя точный протокол, предусмотренный производителем набора, однако он описан только для монокапиллярных аппаратов (Р/АСЕ, Beckman), не приспособленных для рутинного анализа.

Таким образом, существует потребность в реагентах и простом способе, позволяющих эффективно отделять гликированные гемоглобины, в частности НbА_1с, от других гемоглобинов, абнормальных форм, смешанных форм (лабильных, ацетилированных, карбамилированных форм) и других минорных фракций (в особенности от НbА_1а и НbА_1b), присутствующих в биологических образцах, содержащих другие гемоглобины. В идеале такой способ будет обеспечивать проведение полуколичественного или количественного определения гликированного гемоглобина, в частности НbА_1с, непосредственно на основании получаемого электрофоретического профиля.

В настоящем изобретении предложен альтернативный способ капиллярного электрофореза, позволяющий осуществить полуколичественный или количественный анализ одного или нескольких гликированных гемоглобинов, включающих по меньшей мере одну цепь глобина, включающую остаток глюкозы, связанный с аминокислотой в N-концевом положении, содержащихся в биологическом образце, в частности включающем другие гемоглобины (гликированные и/или не гликированные). В указанном методе, предложенном в настоящем изобретении, использованы как структурные характеристики молекул глюкозы, связанных с указанными гликированными гемоглобинами, так различия в зарядах, существующие между различными гемоглобинами из образца.

Авторы изобретения показали, что использование определенной буферной композиции обеспечивает значительно лучшее разделение гликированных гемоглобинов, содержащих остаток глюкозы, связанный с аминокислотой в N-концевом положении, хотя бы на одной цепи глобина, в частности, на бета-цепях, и, в частности значительно улучшить отделение HbА_1с.

Одним из преимуществ способа согласно настоящему изобретению является то, что использование указанной буферной композиции обеспечивает смещение электрофоретического пика, соответствующего одному или нескольким видам представляющих интерес гликированных гемоглобинов (одного или нескольких типов гемоглобинов, содержащих остаток глюкозы, связанный с аминокислотой в N-концевом положении, хотя бы на одной цепи глобина, например НbА_1с), если таковой присутствует в биологическом образце, по отношению к положению пика, который может быть получен без использования буферной композиции. Это смещение не влияет на разделение других белков, в частности других гемоглобинов (гликированных и/или не гликированных) из образца. Это, в частности, позволяет отделить HbAic от других минорных НbА₁ (в частности, НbА_1с и НbА_1b). Соответственно, предложенный способ позволяет получить достоверные результаты и провести точное количественное определение одного или нескольких представляющих интерес гликированных гемоглобинов, имеющих в составе один или несколько остатков глюкозы, где один остаток глюкозы связан с аминокислотой в N-концевом положении по меньшей мере в одной цепи глобина (например, гемоглобина A_1c).

Таким образом, способ согласно настоящему изобретению представляет собой способ выбора для постановки диагноза или для мониторинга состояния пациентов с диабетом, в частности, для оценки эффективности антидиабетического лечения.

Таким образом, в данной заявке предложен способ анализа посредством капиллярного электрофореза гликированных гемоглобинов (одного или нескольких гликированных гемоглобинов), включающих один или несколько остатков глюкозы, содержащихся в биологическом образце, содержащем один или несколько гемоглобинов; причем указанный способ включает использование буферной композиции, содержащей по меньшей мере одно соединение, способное специфично связываться с остатками глюкозы (одним или несколькими остатками) в составе гликированных гемоглобинов (одного или нескольких гликированных гемоглобинов) биологического образца, а также обеспечивающего формирование отрицательного электрического заряда(ов) на указанных гликированных гемоглобинов в щелочной среде (например, при значениях рН более 7).

Термин «несколько» в настоящей заявке означает «по меньшей мере два», т.е. два или более двух, например два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять и более десяти.

Термин «по меньшей мере один» в настоящей заявке означает «один или несколько».

Термин «гемоглобин» в настоящей заявке означает любую форму или фракцию гемоглобина (в том числе второстепенные фракции), включая нормальные или абнормальные гемоглобины, а также разнообразные варианты указанных гемоглобинов (было описано по меньшей мере 1000 вариантов гемоглобина).

Термин «гликированный гемоглобин» в настоящей заявке означает любой гемоглобин, модифицированный путем связывания одной или нескольких молекул сахара (сахаров), в частности одной или нескольких молекул глюкозы, глюкозо-6-фосфата, фруктозо-1-6-дифосфата или пирувата, с одной или несколькими глобиновыми цепями (любой (любыми) из глобиновых цепей). Сахар или сахара могут быть связаны с аминокислотой в N-концевом положении цепи глобина и/или аминокислотой со свободной аминокислотной группой (например, лизином).

Термин «глобиновая цепь» в настоящей заявке означает любую цепь глобина из известных специалистам, в частности цепь, выбранную из цепей альфа (α), бета (β), дельта (δ) и гамма (γ) как нормальных, так и абнормальных, или вариант одной из указанных цепей. В одном варианте осуществления указанная «глобиновая цепь» является бета-цепью, например бета-цепью гемоглобина A₁, в частности A_1c, S или С.

В случае, когда в описании вариантов осуществления изобретения упоминается «гликированный гемоглобин», следует понимать, что указанные варианты осуществления применяют в отношении каждого конкретного типа гликированного гемоглобина, упомянутого в настоящей заявке.

Если не указано иное, каждый вариант осуществления из перечисленных в этой заявке применяют самостоятельно и/или в комбинации с любым одним или несколькими другими описанными вариантами.

Способ анализа посредством капиллярного электрофореза согласно настоящему изобретению можно применять для биологических образцов, содержащих по меньшей мере один гликированный гемоглобин, содержащий один или несколько остатков глюкозы и обязательно содержащий в составе одной или нескольких глобиновых цепей, в частности бета-цепи, остаток глюкозы, связанный с аминокислотой в N-концевом положении. Такие гемоглобины в настоящей заявке обозначаются как «гемоглобины, гликированные по N-концевому участку».

Указанный способ обеспечивает отделение одного или более гемоглобинов, гликированных по N-концевому участку, от других гликированных гемоглобинов (например, гликированных гемоглобинов, глобиновые цепи которых не содержат остатков глюкозы, связанных с аминокислотой в N-концевом положении) или от не-гликированных гемоглобинов, которые могут присутствовать в анализируемом биологическом образце.

В определенном варианте осуществления аминокислота в N-концевом положении на бета-цепи (цепях) является валином.

В предпочтительном варианте осуществления способ анализа согласно настоящему изобретению предназначен для анализа биологических образцов, содержащих гемоглобин А_1с. В частности, он подходит для отделения гемоглобина А_1с от других гемоглобинов, или от определенных гемоглобинов (гликированных иным образом или не гликированных), которые могут присутствовать в анализируемом биологическом образце, и, в частности, от гемоглобинов других минорных фракций, например от НbА_1a и от НbА_1b.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления, метод анализа согласно настоящему изобретению позволяет отделить гемоглобин S_1c и/или гемоглобин С_1с от других гемоглобинов (гликированных иным образом или не гликированных), которые могут присутствовать в анализируемом биологическом образце.

Термин "буферная композиция" означает состав, в частности раствор, который сохраняет приблизительно одинаковый уровень рН при добавлении небольших количеств кислоты или щелочи или при разбавлении.

Термином «связываться с образованием комплекса» или «образовывать комплекс» в настоящей заявке обозначается связывание (химическое или просто физическое) между двумя объектами, в частности между двумя молекулами (например, небольшой молекулой и макромолекулой), посредством функциональных групп.

В предпочтительном варианте осуществления одна из этих двух молекул (соединение, способное к образованию комплексов с остатками глюкозы) связывается (например, вступает в реакцию) с цис-диольной группой, в частности с двумя соседними гидроксильными группами остатков глюкозы, другой молекулы (гликированного гемоглобина).

Как можно увидеть из раздела «Примеры», «специфичное связывание с остатком (остатками) глюкозы одного или нескольких гликированных гемоглобинов с образованием комплексов и формирование отрицательного заряда на указанных гликированных гемоглобинах при основных значениях рН» в рамках настоящей заявки означает, что соединение, используемое в контексте настоящего изобретения, позволяет сместить пик электрофоретической миграции, соответствующий гемоглобинам, гликированным глюкозой по N-концевому участку, за пределы зоны электрофоретической миграции, соответствующей гемоглобинам, гликированным по N-концевому положению другими сахарами (например, глюкозо-6-фосфатом, фруктозо-1-6-дифосфатом или пируватом), и, желательно, за пределы зон пиков электрофоретической миграции, соответствующих другим гемоглобинам в образце.

Таким образом, минорные фракции, которые не содержат остатков глюкозы, связанных с N-концевой аминокислотой в бета-цепи, в частности фракции A_1a и A_1b, не мешают анализу НbА_1с, выполняемому способом согласно настоящему изобретению.

Например, способность соединения специфично образовывать комплекс с остатками глюкозы одного или нескольких гликированных гемоглобинов и обеспечивать формирование отрицательных зарядов при основных значениях рН в контексте настоящего изобретения может быть продемонстрирована при помощи следующего теста: эталонный образец (например, "смесь HbA_1a и HbA_1b, "A_1c" и "А₀" от Exocell, США), содержащий различные очищенные фракции гликированного гемоглобина и, в частности, фракции А₀ и A_1c или фракции А₀, A_1b и A_1a, вводят в капилляр для капиллярного электрофореза, содержащий следующую буферную композицию: 200 мМ CHES, 20 мМ путресцина, от 10 до 120 мМ (например, 30 мМ или 50 мМ) тестируемого соединения, при необходимости - 2,5 г/л хлорида натрия, воду, и, при необходимости, основание для доведения рН до значений более 9, например до 9,4. Проводят капиллярный электрофорез в свободном растворе в капиллярах без покрытия, например, с использованием аппарата Capillaries® (Sebia) на длине волны 415 нм. Затем исследуют полученный электрофоретический профиль; если наблюдается разделение пика, относящегося к НbА_1с, и пика, относящегося к НbА₀ (или, в зависимости от типа используемого образца, пика, относящегося к НbА_1с, и пиков, относящихся к HbA₀, НbА_1b и НbА_1а), следовательно, тестируемое соединение признается способным к специфичному комплексообразованию с остатками глюкозы и к обеспечению формирования отрицательных зарядов при основных значениях рН в контексте настоящего изобретения. Напротив, если пик, соответствующий НbА_1с, и пик, соответствующий HbA_1b (или, в зависимости от типа используемого образца, пик, соответствующий НbА₁с, и пики, соответствующие HbA₀, НbА_1b или НbА_1а), накладываются или перекрываются, то тестируемое соединение не считается подходящим для осуществления способа согласно настоящему изобретению.

Концентрация тестируемого соединения в тесте, описанном выше, дается исключительно в справочных целях; если концентрация тестируемого соединения 10-120 мМ не может обеспечить достаточного расстояния между пиком, соответствующим НbА_1c, и пиком, соответствующим другим гемоглобинам в образце, в условиях описанного выше теста, допустимо превышение границ этого диапазона концентраций для получения оптимального разделения пиков, соответствующих НbА_1с.

Любое химическое соединение (т.е. обычно органическая молекула), любое антитело, полипептид, пептид или любое другое соединение, способное специфично связываться с образованием комплекса с остатками глюкозы и обеспечивать формирование отрицательных зарядов при щелочных значениях рН в условиях согласно настоящему изобретению, могут быть использованы в настоящем изобретении. Соответствующие антитела могут быть созданы любым известным специалистам способом, и могут, например, быть поликлональными или моноклональными антителами, химерными антителами или фрагментами антител, например Fab-фрагментами.

Как можно увидеть из раздела «Примеры», борная кислота не является химическим соединением, способным к специфичному комплексообразованию с остатками глюкозы и формированию отрицательных зарядов при щелочных значениях рН согласно настоящему изобретению, и не позволяет выполнить надежный анализ и, в частности, надежное измерение гликированных гемоглобинов и, в частности, НbА_1с. Примеры подходящих химических соединений более подробно описаны ниже.

Каждый остаток глюкозы в комплексе с соединением, способным к специфичному комплексообразованию с остатками глюкозы, взаимодействует с отдельной молекулой соединения.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления, согласно которому соединение присутствует в достаточном количестве в буферной композиции согласно настоящему изобретению, указанное соединение, в частности, способно к специфичному комплексообразованию с остатками глюкозы в N-концевых положениях гликированного гемоглобина, т.е. к специфичному связыванию указанных остатков глюкозы в каждой цепи глобина (в частности, бета-цепях), содержащей остаток глюкозы, связанный с аминокислотой в N-концевом положении. Указанное соединение, таким образом, способно специфично образовывать комплекс с каждым остатком глюкозы, связанным с N-концевым положением бета-цепей гемоглобинов А_1с, S_1c или С_1с.

В соответствии с конкретнвм вариантом осуществления, когда соединение присутствует в буферной композиции согласно настоящему изобретению в достаточном количестве, указанное соединение способно специфично образовывать комплекс со всеми остатками глюкозы гликированных глюкозой по N-концевому положению гемоглобинов.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления, в случае когда соединение присутствует в буферной композиции согласно настоящему изобретению в достаточном количестве, указанное соединение способно специфично образовывать комплексы со всеми остатками глюкозы в составе гемоглобина, независимо от их положения на глобиновой цепи (гемоглобиновых цепях). Таким образом, когда указанное соединение присутствует в достаточном количестве в буферной композиции согласно настоящему изобретению, молекула гемоглобина, содержащая х остатков глюкозы, может связать х молекул указанного соединения.

Посредством специфичного комплексообразования с одним или несколькими остатками глюкозы гликированных гемоглобинов из биологического образца, указанное соединение обеспечивает формирование на указанном гликированном гемоглобине или гемоглобинах нескольких отрицательных электрических зарядов при щелочных значениях рН, то есть позволяет дозарядку этих гликированных гемоглобинов отрицательными электрическими зарядами при щелочных значениях рН.

Таким образом, указанные соединения обеспечивают образование нескольких электрических зарядов на каждом остатке глюкозы в составе комплекса на одном и том же гемоглобине при щелочных значениях рН. Благодаря такому формированию отрицательных электрических зарядов при щелочных значениях рН электрофоретическая подвижность гемоглобинов, содержащих по меньшей мере один остаток глюкозы, изменяется в результате образования комплекса с указанным соединением. Это проявляется на электрофоретическом профиле в виде смещения электрофоретического пика или пиков, соответствующих гликированным гемоглобинам, содержащим один или несколько остатков глюкозы, которые присутствуют в анализируемом биологическом образце.

Все гемоглобины, содержащие по меньшей мере один остаток глюкозы, которые присутствуют в биологическом образце, образуют комплекс с соединением, образующим комплексы с глюкозой и формирующим отрицательные электрические заряды при щелочных значениях рН (конечно, при условии, что указанное соединение присутствует в достаточном количестве, чтобы образовать комплекс с каждым из этих гемоглобинов). Тем не менее, различные гемоглобины и, в частности, различные гемоглобины, содержащие по меньшей мере один остаток глюкозы, имеют различные изоэлектрические точки (в зависимости от природы глобиновых цепей, количества и расположения остатков глюкозы на этих глобиновых цепях; количества, природы и расположения других сахаров, которые могут быть связаны с указанными гемоглобинами). Благодаря формированию отрицательных электрических зарядов при щелочных значениях рН в результате образования комплекса с участием указанного соединения и каждого остатка глюкозы, разница в зарядах между этими различными гемоглобинами даже более выражена, когда они существуют в форме комплекса с указанным соединением.

Таким образом, гликированные гемоглобины, включающие остаток глюкозы, связанный с аминокислотой в N-концевом положении в составе по меньшей мере одной из глобиновых цепей (в частности, в составе бета-цепей), содержат по меньшей мере на одну молекулу глюкозы больше, чем другие гемоглобины (гликированные иным образом или негликированные). В частности, гемоглобин А_1с имеет в составе бета-цепи по меньшей мере на одну молекулу глюкозы больше, чем другие минорные фракции гемоглобина A₁. Как следствие, в процессе комплексообразования, описанного в настоящем изобретении, эти гемоглобины, гликированные по N-концевым участкам, приобретают больший отрицательный электрический заряд при щелочных значениях рН за счет указанного соединения, по сравнению с другими гемоглобинами (гликированными гемоглобинами, не содержащими остатков глюкозы, связанных с N-концевыми аминокислотами глобиновых цепей, или не гликированными гемоглобинами).

Таким образом, за счет увеличения разницы в электрофоретической подвижности, существующей между различными гемоглобинами, содержащими глюкозу, и/или между одним или несколькими гемоглобинами, содержащими глюкозу, и другими гемоглобинами, присутствующими в анализируемом биологическом образце, достигается лучшее отделение одного или более гемоглобинов, гликированных по N-концевому положению и других гемоглобинов, которые могут присутствовать в указанном образце, в частности гемоглобина А_1с, от других минорных фракций гемоглобина A₁, которые могут присутствовать в указанном образце.

Таким образом, способ согласно настоящему изобретению позволяет эффективно отделить гемоглобины, гликированные по N-концевому положению, в частности НbА_1с, от других гемоглобинов, некоторых вариантных гемоглобинов и других минорных фракций, присутствующих в биологическом образце, содержащем другие гемоглобины. Кроме того, молекулы, обычно мешающие проведению анализа, такие как лабильные, ацетилированные или карбамилированные формы, не мешают количественному определению НbА_1с при использовании способа согласно настоящему изобретению. В частности, способ согласно настоящему изобретению позволяет избежать помех, которые могут возникать в отсутствие отрицательных электрических зарядов при щелочных значениях рН, формирующихся при образовании комплекса, в результате совместной миграции гемоглобина А_1с и других минорных фракций гемоглобина A₁ (в том числе НbА_1a и НbА_1b), присутствующих в биологическом образце, в ходе электрофоретического разделения.

Отделенные гемоглобины, гликированные по N-концевым положениям, могут быть затем количественно проанализированы в присутствии других неизвестных или определенных гемоглобинов, которые могут присутствовать в анализируемом биологическом образце. Таким образом, например, может быть проведено количественное определение НbА_1с в присутствии других минорных фракций гемоглобина A₁ и, в частности, в присутствии НbА_1a и/или НbА_1b, без помех со стороны данных минорных фракций, присутствующих в анализируемом биологическом образце.

Под термином "количественно анализировать" или "количественное определять" в настоящей заявке понимается определение количества представляющего интерес гемоглобина(ов), возможно, в