Экспрессионные системы

Экспрессионные системы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение касается экспрессионных систем, включающих полинуклеотиды, кодирующие белки, причем экспрессионная система содержит первый полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один белок, пептид или их вариант, который индуцирует Т-клеточный ответ, и второй полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один белок, пептид или их вариант, который индуцирует В-клеточный ответ против патогена. Изобретение также касается смесей белков, кодируемых экспрессионной системой, и клеток, содержащих экспрессионную систему или смесь белков, и фармацевтических композиций, содержащих экспрессионную систему или смесь белков. Экспрессионная система, полинуклеотиды, белки, клетки и фармацевтические композиции применимы при профилактике или лечении инфекций. Изобретение также касается нуклеотидных конструкций и экспрессионных систем, кодирующих модифицированный гемагглютинин (НА) вируса гриппа.

Уровень техники

Инфекционные заболевания все еще представляют большую угрозу для человечества. Одним из способов предотвращения или лечения инфекционных заболеваний является искусственное индуцирование иммунного ответа путем вакцинации, которая представляет собой введение антигенного материала индивиду с тем, чтобы возникал адаптивный иммунный ответ против соответствующего антигена. Антигенным материалом могут быть такие патогены (например, микроорганизмы или вирусы), которые интактны по структуре, но инактивированы (т.е. не инфекционны) или ослаблены (т.е. с пониженной инфекционностью), либо очищенные компоненты патогена, которые оказались сильно иммуногенными. Другой подход к индуцированию иммунного ответа против патогена состоит в обеспечении экспрессионных систем, содержащих один или несколько векторов, кодирующих иммуногенные белки или пептиды патогена. Такой вектор может иметь вид голой плазмидной ДНК, или же иммуногенные белки или пептиды вводятся с помощью вирусных векторов, к примеру, на основе модифицированных вирусов осповакцины (например, модифицированного вируса осповакцины Ankara; MVA) или аденовирусных векторов. Такие системы экспрессии обладают тем преимуществом, что они содержат хорошо изученные компоненты, обладающие слабой чувствительностью к условиям окружающей среды.

Конкретная задача при разработке экспрессионных систем на основе векторов состоит в том, чтобы применение таких экспрессионных систем на пациентах вызывало такой иммунный ответ, который будет защищать от инфекции соответствующим патогеном. Однако, несмотря на то что они индуцируют иммунногенный ответ против патогена, некоторые экспрессионные системы неспособны вызвать достаточно сильный иммунный ответ, который бы полностью защищал от инфекций, вызванных патогеном. Соответственно, все еще существует потребность в таких экспрессионных системах, которые способны индуцировать защитный иммунный ответ против патогенов, например, таких возбудителей инфекций, как вирусы.

Вирусы

Вирусы составляют группу таких патогенов/возбудителей инфекций, которые не обладают собственным метаболизмом и могут считаться облигатными эндопаразитами соответствующих клеток хозяев, использующими по меньшей мере часть аппарата клеток хозяев для осуществления экспрессии вирусных белков и репликации вируса. Вирусы можно классифицировать на основании типа (ДНК/РНК), количества нитей (одноцепочечная или двухцепочная), полярности (отрицательная или положительная) нуклеиновой кислоты, составляющей их геном, и их репликации (классификация Baltimore). Соответственно, вирусы обычно относятся к ДНК- или РНК-вирусам. Вирусы также могут относиться к одноцепочечным (оц) или двухцепочным (дц) ДНК- или РНК-вирусам, геном которых представлен одноцепочечной или двухцепочной нуклеиновой кислотой. У некоторых вирусов геном является частично двухцепочным и частично одноцепочечным (например, гепаднавирусы). Ориентация или направление генома и/или при изготовлении медикаментов для применения при профилактике или лечении от патогена и/или для применения в способах профилактики или лечения от патогена, причем патогенность играет важную роль в жизненном цикле вирусов, в частности, в жизненном цикле оцРНК-вирусов или оцДНК-вирусов. Геном из оцРНК плюс нити имеет такую же ориентацию, как и клеточная РНК, и может прямо транслироваться в вирусные белки. В жизненном цикле вирусов с геномом из одноцепочечной РНК минус нити((-)оцРНК) необходимо, чтобы геномные последовательности транскрибировались в мРНК плюс нити, которая может транслироваться в вирусные белки в клетках хозяевах. Одноцепочечной геном, содержащий и плюс, и минус нити, называется "амбисмысловым" (например, (+/-)оцРНК, (+/-)оцДНК)).

Несмотря на то что геном вирусов может быть весьма большим (например, в случае ДНК-вирусов), особенно небольшие РНК-вирусы эволюционно выработали стратегии для экспрессии своих генных продуктов (например, белков и пептидов) очень эффективным образом. Одной из таких стратегий является экспрессия одного или нескольких полибелков, кодируемых вирусным геномом, которые при ко- или посттрансляционном процессинге дают отдельные белки и/или пептиды. Эта стратегия принята, к примеру, у некоторых двухцепочечных (дц) РНК-вирусов или одноцепочечных (оц) РНК-вирусов с геномом из плюс нити. "Оболочечные вирусы", как-то ортомиксовирусы, парамиксовирусы, ретровирусы, флавивирусы, рабдовирусы и альфавирусы, окружены липидным бислоем, происходящим из плазматической мембраны хозяина (1).

У всех оболочечных вирусов встречаются соединительные гликопротеины, которые обеспечивают исходное взаимодействие между оболочкой вируса и плазматической мембраной клетки хозяина посредством связывания с углеводными группировками или доменами клеточной адгезии белков или другими молекулами на плазматической мембране клетки хозяина. Тем самым соединительные гликопротеины образуют мостик между вирусом и мембраной клетки хозяина. Соединительные гликопротеины, обозначаемые как "Н", обладают активностью гемагглютинина, а гликопротеины, обозначаемые как "HN", обладают активностями гемагглютинина и нейраминидазы. Соединительные гликопротеины обозначаются как "G", если они не обладают ни активностью гемагглютинина, ни активностью нейраминидазы.

Парамиксовирусы

Парамиксовирусы составляют семейство таких вирусов животных, которые содержат одноцепочечную несегментированную минус нить РНК. Парамиксовирусы ответственны за ряд заболеваний у животных и человека. РНК-геном парамиксовирусов имеет длину в 15-19 тысяч оснований (т.о.) и кодирует 6-10 генов. Каждый ген содержит старт/стоп-сигналы транскрипции в начале и в конце, которые транскрибируются в составе гена. Последовательности генов консервативны у всех парамиксовирусов вследствие феномена, известного как транскрипционная полярность, при которой гены, ближайшие к 3'-концу генома, транскрибируются в большем количестве, чем те, что расположены ближе к 5'-концу. После транскрипции каждого гена РНК-зависимая РНК-полимераза останавливается для высвобождения новой мРНК, когда она встречает межгенную последовательность. Когда РНК-полимераза останавливается, то есть вероятность, что она диссоциирует от РНК генома. Если она диссоциирует, то должна будет повторно войти в репликативный комплекс в области лидерной последовательности, а не продолжить транскрипцию оставшейся части генома. В результате этого, чем дальше будут находиться нижележащие гены от лидерной последовательности, тем меньше они будут транскрибироваться РНК-полимеразой. Гены парамиксовирусов располагаются в относительном порядке белков, необходимых для успешной инфекции. Консервативная последовательность генов такова: нуклеокапсид - фосфопротеин - матриксные - слияния - прикрепительный - большая субъединица (полимеразы).

Геномы многих парамиксовирусов следуют так называемому "правилу шести". Согласно этому правилу, общая длина генома почти всегда кратна шести. Однако члены подсемейства Pneumovirinae, содержащего респираторный синцитиальный вирус (RSV), не подчиняются этому правилу.

Респираторный синцитиальный вирус (RSV)

Оболочечный вирус, обозначаемый как респираторный синцитиальный вирус (RSV), является наиболее важной причиной вирусных заболеваний нижних дыхательных путей (LRTI) у младенцев и детей по всему миру (2). В Соединенных Штатах, по оценкам, каждый год подвергаются госпитализации 70000-126000 младенцев с пневмонией или бронхиолитом RSV, причем уровень госпитализации при бронхиолите все возрастает с 1980 г. (3). Дети заражаются к 2-летнему возрасту, а по оценкам ВОЗ вирус RSV вызывает заболевания примерно у 64 миллионов детей каждый год и 160000 смертей. В промышленно развитых странах RSV ответственен по меньшей мере за 50% случаев госпитализации при респираторных заболеваниях у детей, причем до 6% всех заражений RSV у детей заканчиваются госпитализацией (4). Заражение RSV не вызывает длительного иммунитета, так что организм человека испытывает пожизненные циклы инфицирования и повторного инфицирования. Несмотря на то, что RSV по традиции считается педиатрическим патогеном, он также вызывает тяжелое заболевание у пожилых и лиц с ослабленным иммунитетом (5). Бремя заболевания RSV у пожилых сравнимо с сезонным гриппом, а экономические последствия связанных с RSV заболеваний у взрослых по оценкам даже больше, чем у гриппа в отношении количества потерянных для работы дней (6, 7). Профилактика моноклональными антителами эффективно снижает госпитализацию при RSV на 50% у детей с повышенным риском тяжелого заболевания (8). Однако в настоящее время не существует эффективной вакцины или антивирусной терапии против RSV.

Катастрофический эффект вакцины из инактивированного формалином (FI) RSV у детей в 1960 г.г. помешал разработке вакцины. Вакцина не защищала от заражения RSV и усугубляла респираторное заболевание (9), что объясняли индуцированием высокого титра слабо нейтрализующих антител с низким сродством, отсутствием прайминга Т-клеток CD8+ и смещением иммунного ответа в сторону Th2 (10, 11 и 12). Существуют данные о том, что RSV нарушает возникновение адекватного адаптивного Т-клеточного иммунного ответа (13).

Таким образом, имеется явная потребность в эффективной вакцине не только для защиты детей, но также для повышения иммунитета у пожилых людей и уменьшения циркуляции RSV у братьев и сестер и у тех взрослых, которые являются основным источником заражения RSV для детей. Особенно желательно, чтобы вакцина против RSV была способна индуцировать нейтрализующие антитела и мощный и широкий Т-клеточный ответ для прайминга Т-клеточного ответа у тех лиц, которые еще не были инфицированы RSV (дети), или для усиления уже существующего Т-клеточного ответа у тех лиц, которым необходимо "перенастроить" реакцию памяти на более высокий уровень (пожилых).

Ортомиксовирусы

Ортомиксовирусы составляют семейство РНК-вирусов, которое включает пять родов: Influenzavirus A, Influenzavirus В, Influenzavirus С, Isavirus и Thogotovirus. Недавно был описан шестой род. Первые три рода включают вирусы, которые вызывают грипп у позвоночных, включая птиц, людей и других млекопитающих. Три рода вирусов гриппа имеют антигенные различия по нуклеопротеинам и матриксным белкам. Influenzavirus А инфицирует людей, других млекопитающих и птиц и вызывает все пандемии гриппа. Influenzavirus В инфицирует людей и тюленей. Influenzavirus С инфицирует людей и свиней.

Вирусы семейства Orthomyxovirus содержат от 6 до 8 сегментов линейной одноцепочечной РНК минус нити. Общая длина генома составляет 12000-15000 нуклеотидов (нт): наибольший сегмент - 2300-2500 нт; второй по величине - 2300-2500 нт; третий - 2200-2300 нт; четвертый - 1700-1800 нт; пятый - 1500-1600 нт; шестой -1400-1500 нт; седьмой - 1000-1100 нт; восьмой - 800-900 нт. Последовательность генома содержит концевые повторы, которые повторяются на обоих концах. Концевые повторы на 5'-конце имеют длину в 12-13 нуклеотидов. Нуклеотидные последовательности с 3'-конца идентичны таковым у родов того же семейства; у большинства (сегментов) РНК либо у всех разновидностей РНК. Концевые повторы на 3'-конце имеют длину в 9-11 нуклеотидов.

Вирус гриппа является одним из наиболее важных дыхательных патогенов. Только в США заражение гриппом ответственно за 20000-40000 смертей и более 100000 случаев госпитализации в год (1). Младенцы, пожилые люди и лица с ослабленной сердечной, легочной или иммунной системой подвергаются большому риску серьезных осложнений после заражения гриппом.

Иммунизация оказалась наиболее эффективной мерой при профилактике заболевания. Одной из общих черт у всех современных вакцин против гриппа является индукция главным образом нейтрализующих антител, направленных против главного белка вирусной оболочки - гемагглютинина (НА).

Сущность изобретения

В первом аспекте изобретением предусмотрена экспрессионная система, содержащая первый полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один белок, пептид или их вариант, который индуцирует Т-клеточный ответ, и второй полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один белок, пептид или их вариант, который индуцирует В-клеточный ответ против патогена.

Во втором аспекте изобретением предусмотрена выделенная смесь белков, кодируемых экспрессионной системой из первого аспекта.

В третьем аспекте изобретением предусмотрены выделенные клетки хозяева, содержащие экспрессионную систему из первого аспекта и/или смесь белков из второго аспекта.

В четвертом аспекте настоящим изобретением предусмотрена композиция, содержащая экспрессионную систему из первого аспекта и/или смесь белков из второго аспекта и фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.

В пятом аспекте настоящим изобретением предусмотрена экспрессионная система из первого аспекта, смесь белков из второго аспекта, клетки из третьего аспекта и композицию из четвертого аспекта для применения в медицине, в частности, при лечении или профилактике инфекционных заболеваний, предпочтительно вирусных заболеваний.

В шестом аспекте настоящим изобретением предусмотрен способ лечения или профилактики вирусных заболеваний, включающий введение эффективного количества экспрессионной системы из первого аспекта, смеси белков из второго аспекта, клеток из третьего аспекта и композиции из четвертого аспекта.

В седьмом аспекте настоящим изобретением предусмотрен способ усиления иммунного ответа, включающий введение эффективного количество экспрессионной системы из первого аспекта, смеси белков из второго аспекта, клеток из третьего аспекта и композиции из четвертого аспекта.

В восьмом аспекте настоящим изобретением предусмотрены нуклеотидные конструкции, кодирующие гемагтлютинин (НА) вируса гриппа, экспрессионная система, содержащая эти нуклеотидные конструкции, и белки или полипротеины, кодируемые нуклеотидными конструкциями или экспрессионной системой, при этом сайт расщепления НАО имеет многоосновную последовательность.

В девятом аспекте настоящим изобретением предусмотрено применение многоосновного сайта расщепления НАО для конструирования систем экспрессии, способных экспрессировать гемагглютинин (НА) вируса гриппа in vitro и/или in vivo.

В десятом аспекте изобретением предусмотрена выделенная смесь белков, кодируемых экспрессионной системой из восьмого аспекта.

В одиннадцатом аспекте изобретением предусмотрены выделенные клетки хозяева, содержащие нуклеотидные конструкции, экспрессионную систему либо белки или полипротеины из восьмого аспекта и/или смесь белков из десятого аспекта.

В двенадцатом аспекте настоящим изобретением предусмотрена композиция, содержащая нуклеотидные конструкции, экспрессионную систему либо белки или полипротеины из восьмого аспекта или смесь белков из десятого аспекта и фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.

В тринадцатом аспекте настоящим изобретением предусмотрены нуклеотидные конструкции, экспрессионная система либо белки или полипротеины из восьмого аспекта, смесь белков из десятого аспекта, клетки из одиннадцатого аспекта и композиция из двенадцатого аспекта для применения в медицине, в частности, при лечении или профилактике инфекций, вызванных вирусом гриппа.

В четырнадцатом аспекте настоящим изобретением предусмотрен способ лечения или профилактики инфекций, вызванных вирусом гриппа, включающий введение эффективного количества нуклеотидных конструкций, экспрессионной системы либо белков или полипротеинов из восьмого аспекта, смеси белков из десятого аспекта, клеток из одиннадцатого аспекта и композиции из двенадцатого аспекта.

В пятнадцатом аспекте настоящим изобретением предусмотрен способ усиления иммунного ответа, включающий введение эффективного количества нуклеотидных конструкций, экспрессионной системы либо белков или полипротеинов из восьмого аспекта, смеси белков из десятого аспекта, клеток из одиннадцатого аспекта и композиции из двенадцатого аспекта.

В вышеприведенном кратком изложении не обязательно описаны все аспекты настоящего изобретения.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Схематическое изображение вакцинного полипротеина RSV. conF0 = консенсусная последовательность белка F; 2А = трансляционный сайт расщепления вируса ящура; conN = консенсусная последовательность белка N; conM2-1 = консенсусная последовательность белка М2-1.

Фиг. 2. Вакцинный антиген F0ΔTM-N-M2-1 подвергается эффективному процессингу в клетках млекопитающих. Анализ методом Вестерн-блот лизатов клеток HeLa. нтр.: нетрансфецированные клетки Hela; трансф. RSV: клетки HeLa, трансфецированные F0ΔTM-N-M2-1; инфиц. RSV: клетки Нер2, инфицированные RSV штамма А.

Фиг. 3. Секретируемый белок F образует гомотример. Анализ методом Вестерн-блот супернатантов из трансфецированных клеток HeLa. RSV: клетки трансфецированы F0ΔTM-N-M2-1; F0: клетки трансфецированы F0ΔTM; Ctrl: клетки трансфецированы пустой плазмидой.

Фиг. 4. Белок F, экспрессируемый из вакцинного полипротеина, является лучшим иммуногеном, чем сам белок F. А. Анализ методом Вестерн-блот супернатанта из клеток HeLa, инфицированных PanAd3/F0ΔTM-N-M2-1, который зондировали различными разведениями сыворотки от мышей, иммунизированных F0ΔTM или F0ΔTM-N-M2-1. В. Денситометрическое сканирование Вестерн-блота из панели А. Данные выражены в виде относительной интенсивности зоны, соответствующей полосе белка.

Фиг. 5. Вакцина против RSV индуцирует сильный системный Т-клеточный иммунитет у мышей при однократном внутримышечном введении. Анализ методом IFNg-Elispot спленоцитов мышей Balb/C, иммунизированных PanAd3/F0ΔTM-N-M2-1, с помощью картированных иммунодоминантных пептидов из белков F и M RSV.

Фиг. 6. Схематическое изображение вакцинного полипротеина вируса гриппа. NP = консенсусная последовательность белка NP, М1 = консенсусная последовательность белка M1, 2А = трансляционный сайт расщепления вируса ящура, H1p = консенсусная последовательность белка НА из H1N12009.

Фиг. 7. Анализ методом Вестерн-блот экспрессии H1p в трансфецированных клетках HeLa. Полные лизаты клеток HeLa, трансфецированных PVJ-H1p (дорожка 1), PVJ-H1 (дорожка 2) и не трансфецированных CTR (дорожка 3). Стрелками показаны полосы, соответствующие нерасщепленной форме (70 кД) НА0 и расщепленному (28 кД) НА2. Поликлональная сыворотка против НА распознает эпитопы у фрагмента белка НА2. Видно, что белок H1p полностью подвергается процессингу.

Фиг. 8. Анализ методом FACS на целых клетках экспонированных на мембране белков НА. На гистограммах представлена медиана флуоресценции клеток HeLa, трансфецированных НА дикого типа (справа сверху) и H1 (справа снизу). Клетки инкубировали с гипериммунной поликлональной сывороткой мышей против H1p, а затем с конъюгированным с РЕ вторичным антителом против мыши. Слева сверху и снизу клетки инкубировали с преиммунной сывороткой мышей, чтобы установить базальный уровень флуоресценции.

Фиг. 9. H1p способен индуцировать высокий титр антител. Анализ методом ELISA на фиксированном рекомбинантном НА (H1N1California 2009). Титры антител измеряли на сыворотке животных, иммунизированных H1 и H1p. Титры рассчитывали по серийным разведениям сыворотки и они представляют разведения, дающие значения OD, в три раза превышающие уровень фона.

Фиг. 10. Заражение клеток MDCK псевдотипированным по НА (H1N1Mexico 2009) вирусом сильнее нейтрализуется сывороткой от животных, иммунизированных H1p. Результаты анализа методом ELISA на фиксированном рекомбинантном НА (H1N1California 2009) с использованием сыворотки от животных, иммунизированных H1p и NPM1H1p.

Фиг. 11. Экспрессия H1p на фоне тройного антигена способна индуцировать высокий титр антител. Анализ методом ELISA на фиксированном рекомбинантном НА (H1N1 California 2009). Титры антител измеряли на сыворотке от животных, иммунизированных H1p и NPM1H1p. Титры рассчитывали по серийным разведениям сыворотки и они представляют разведения, дающие значения OD, в три раза превышающие уровень фона.

Фиг. 12. Анализ методом Вестерн-блот экспрессии антигена NPM1H1p в трансфецированных клетках HeLa показывает, что белок полностью подвергается процессингу. Полные лизаты клеток HeLa, трансфецированных pNEB-NPM1H1p (дорожка 1), pNEB-NPM1 (дорожка 2) и ложно-трансфецированных (дорожка 3). Стрелкой показана полоса, соответствующая слитому белку NPM1 (70 кД). Для выявления внутриклеточного белка использовали моноклональное антитело против NP.

Фиг. 13. H1p, полученный при процессинге NPM1H1p, экспонирован на клеточной мембране и имеет правильную укладку. Анализ методом FACS на целых клетках ложно-трансфецированных (слева) или трансфецированных NPM1H1p (справа) клеток HeLa. Клетки инкубировали с мышиным mAb С179, которое связывается с конформационным эпитопом на стволовом участке НА, а затем с вторичным конъюгированным с РЕ антителом против мыши.

Раскрытие сущности изобретения

Перед тем, как перейти к подробному описанию настоящего изобретения, следует иметь в виду, что настоящее изобретение не ограничивается конкретной методологией, методиками и реагентами, описанными здесь, поскольку они могут меняться. Также следует иметь в виду, что используемая здесь терминология предназначена только для описания определенных воплощений и не должна ограничивать объем настоящего изобретения, который должен ограничиваться лишь прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иначе, все используемые здесь технические и научные термины имеют те же значения, которые обычно понимаются рядовыми специалистами в данной области.

Предпочтительно используемые здесь термины определяются так, как описано в "А multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger H.G.W., Nagel В. and Kölbl H., eds. (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland).

По всему тексту настоящего описания приводятся некоторые документы. Каждый из процитированных здесь документов (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции, номера доступа в GenBank поданных последовательностей и т.д.), независимо от того, приведен он выше или ниже, включен сюда путем ссылки во всей полноте. Ничто в нем не должно восприниматься как допущение того, что изобретение не может датироваться задним числом по факту более раннего создания настоящего изобретения (antedate).

Определения

По всему описанию и в прилагаемой формуле изобретения, если контекстом не требуется иначе, слово "включать" и такие его варианты, как "включает" и "включающий", следует понимать, как включение приведенного числа или стадии, но не исключение любого другого числа или стадии или группы чисел или стадий.

Сокращения "F" или "F0" здесь применяются взаимозаменяемым образом и относятся к белку слияния парамиксовирусов, предпочтительно вируса RSV.

Сокращение "G" относится к гликопротеину парамиксовирусов, предпочтительно пневмовирусов, более предпочтительно вируса RSV.

Сокращение "Н" относится к белку гемагглютинину парамиксовирусов, предпочтительно морбилливирусов.

Сокращение "HN" относится к белку гемагглютинину-нейраминидазе парамиксовирусов, в частности респировируса, авулавируса и рубулавируса.

Сокращение "N" относится к нуклеокапсидному белку парамиксовирусов, предпочтительно вируса RSV.

Сокращение "М" относится к гликозилированному матриксному белку парамиксовирусов, предпочтительно вируса RSV.

Что касается парамиксовирусов, то сокращение "М2" or "М2-1" относится к негликозилированному матриксному белку парамиксовирусов, предпочтительно вируса RSV.

Сокращение "Ρ" относится к фосфопротеину парамиксовирусов, предпочтительно вируса RSV.

Что касается парамиксовирусов, то сокращения "NS1" и "NS2" относятся к неструктурным белкам 1 и 2 парамиксовирусов, предпочтительно вируса RSV.

Сокращение "L" относится к каталитической субъединице полимеразы парамиксовирусов, предпочтительно вируса RSV.

Сокращение "НА" относится к гемагглютинину ортомиксовирусов, предпочтительно вирусов гриппа, более предпочтительно вируса гриппа А.

Сокращение "НАО" относится к белку-предшественнику субъединиц НА1 и НА2 гемагглютинина ортомиксовирусов, предпочтительно вирусов гриппа, более предпочтительно вируса гриппа А.

Сокращение "H1p" относится к модифицированному гемагглютинину ортомиксовирусов, предпочтительно вирусов гриппа, более предпочтительно вируса гриппа А.

Сокращение "NA" относится к нейраминидазе ортомиксовирусов, предпочтительно вирусов гриппа, более предпочтительно вируса гриппа А.

Сокращение "NP" относится к нуклеопротеину ортомиксовирусов, предпочтительно вирусов гриппа, более предпочтительно вируса гриппа А.

Сокращение "M1" относится к матриксному белку 1 ортомиксовирусов, предпочтительно вирусов гриппа, более предпочтительно вируса гриппа А.

Что касается ортомиксовирусов, то сокращение "М2" относится к матриксному белку М2 ортомиксовирусов, предпочтительно вирусов гриппа, более предпочтительно вируса гриппа А.

Что касается ортомиксовирусов, то сокращение "NS1" относится к неструктурному белку 1 ортомиксовирусов, предпочтительно вирусов гриппа, более предпочтительно вируса гриппа А.

Сокращение "NS2/NEP" относится к неструктурному белку 2 (также называется NEP, ядерный экспортный белок) ортомиксовирусов, предпочтительно вирусов гриппа, более предпочтительно вируса гриппа А.

Сокращение "РА" относится к белку субъединицы полимеразы ортомиксовирусов, предпочтительно вирусов гриппа, более предпочтительно вируса гриппа А.

Сокращение "РВ1" относится к белку субъединицы полимеразы ортомиксовирусов, предпочтительно вирусов гриппа, более предпочтительно вируса гриппа А.

Сокращение "РВ2" относится к белку субъединицы полимеразы ортомиксовирусов, предпочтительно вирусов гриппа, более предпочтительно вируса гриппа А.

Сокращение "PB1-F2" или "PB1F2" относится к белку, кодируемому альтернативной рамкой считывания у сегмента гена РВ1 ортомиксовирусов, предпочтительно вирусов гриппа, более предпочтительно вируса гриппа А.

Термином "экспрессионная система" в настоящем изобретении обозначается система, предназначенная для получения одного или нескольких представляющих интерес генных продуктов. Как правило, такая система разрабатывается "искусственно", т.е. посредством генных технологий, применимых для получения представляющего интерес генного продукта как в бесклеточных системах in vitro, так и в клеточных системах in vivo. Понятно, что естественные экспрессионные систем, такие, к примеру, как нативные вирусы, не охватываются экспрессионной системой настоящего изобретения.

Термин "представляющий интерес генный продукт", как правило, относится к таким макромолекулам, без ограничения, как РНК, пептиды, полипептиды или белки либо их сегменты, эпитопы или фрагменты.

В экспрессионной системе определенный генный продукт кодируется одной или несколькими молекулами нуклеиновой кислоты. Молекулы нуклеиновой кислоты понимаются как полимерные макромолекулы, состоящие из мономеров. Нуклеотиды-мономеры состоят из нуклеотидного основания, пятиуглеродного сахара (типа рибозы или 2'-дезоксирибозы, но не ограничиваясь этим) и от одной до трех фосфатных групп. Как правило, полинуклеотид образуется посредством фосфодиэфирных связей между отдельными нуклеотидами-мономерами. В контексте настоящего изобретения к молекулам нуклеиновой кислоты относятся, без ограничения, рибонуклеиновая кислота (РНК) и дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Термины "полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота" применяются здесь взаимозаменяемым образом.

В бесклеточных системах экспрессии в качестве матрицы для реакций трансляции in vitro используются выделенные полинуклеотиды. В клеточных системах экспрессии полинуклеотиды содержатся в одном или нескольких векторах. В настоящем изобретении термин "вектор" относится к белкам или полинуклеотидам либо их смесям, которые могут вводиться или вводить содержащиеся в них белки и/или нуклеиновые кислоты в клетки. В контексте настоящего изобретения предпочтительно, чтобы гены, кодируемые введенным полинуклеотидом, экспрессировались внутри клетки после введения вектора или векторов. Примеры подходящих векторов включают, без ограничения, плазмиды, космиды, фаги, вирусы или искусственные хромосомы.

Фраза "индукция Т-клеточного ответа" относится к образованию или повторной стимуляции специфичных к вирусу Т-клеток CD4+или CD8+. Экспрессионная система изобретения может индуцировать или повторно стимулировать опосредованный Т-клетками адаптивный ответ, направленный на эпитопы МНС класса I или класса II, присутствующие в вирусных белках, экспрессируемых полинуклеотидом. Такой Т-клеточный ответ можно измерить известными методами, предпочтительно посредством повторной стимуляции Т-клеток ex vivo синтетическими пептидами, охватывающими все вирусные белки, и анализа пролиферации или продукции γ-интерферона.

Фраза "индукция В-клеточного ответа" относится к образованию или повторной стимуляции специфичных к вирусу В-клеток, вырабатывающих иммуноглобулины класса IgG или IgA. Экспрессионная система изобретения может индуцировать или повторно стимулировать В-клетки, вырабатывающие антитела, специфичные к патогенным, например, вирусным антигенам, экспрессируемым полинуклеотидом. Такой В-клеточный ответ можно измерить методом ELISA (ферментного иммуносорбентного анализа) с помощью синтетического антигена из сыворотки или иммуноглобулина из слизистой. С другой стороны, титр индуцированных антител можно измерить методами нейтрализации вируса.

Фраза "индукция В-клеточного ответа против патогена" относится к образованию или повторному стимулированию специфичных к вирусу В-клеток, вырабатывающих иммуноглобулины класса IgG или IgA, которые инактивируют, блокируют и/или нейтрализируют соответствующий патоген таким образом, что вызванное патогеном заболевание не возникает и/или его симптомы ослабляются. Это также называется "защитным иммунным ответом" против патогена. Экспрессионные системы настоящего изобретения могут индуцировать или повторно стимулировать В-клетки, вырабатывающие антитела, специфичные к патогенным, например, вирусным антигенам, экспрессируемым полинуклеотидом. Такой В-клеточный ответ можно измерить методом ELISA (ферментного иммуносорбентного анализа) с помощью синтетического антигена из сыворотки или иммуноглобулина из слизистой. С другой стороны, титр индуцированных антител можно измерить методами нейтрализации вируса.

Фраза "усиление иммунного ответа" относится к усилению или интенсификации гуморального и/или клеточного иммунного ответа против иммуногена, предпочтительно патогена, более предпочтительно вируса. Усиление иммунного ответа можно измерить путем сравнения иммунного ответа, вызванного экспрессионной системой изобретения, с иммунным ответом от экспрессионной системы, экспрессирующей тот же самый антиген/иммуноген сам по себе, с помощью описанных здесь тестов и/или тестов, хорошо известных в данной области техники.

В экспрессирующей системе определенный ген может кодироваться одним полинуклеотидом или несколькими отдельными полинуклеотидами. В клеточных системах экспрессии один или несколько полинуклеотидов могут содержаться в одном или нескольких отдельных векторах. Каждый из этих полинуклеотидов может кодировать весь генный продукт или его часть.

Кроме того, экспрессионные системы могут включать и "контролирующие экспрессию последовательности", регулирующие экспрессию данного гена. Как правило, контролирующие экспрессию последовательности представлены полипептидами или полинуклеотидами, такими, без ограничения, как промоторы, энхансеры, сайленсеры, инсуляторы или репрессоры.

Соответственно, вектор, содержащий один или несколько полинуклеотидов, кодирующих один или несколько генных продуктов, может содержать дополнительные контролирующие экспрессию последовательности. У вектора, содержащего один или несколько полинуклеотидов, кодирующих один или несколько генных продуктов, экспрессия может контролироваться вместе или по отдельности одной или несколькими контролирующими экспрессию последовательностями. В частности, каждый полинуклеотид, содержащийся в векторе, может контролироваться отдельной контролирующей экспрессию последовательностью, или же все полинуклеотиды в векторе могут контролироваться одной контролирующей экспрессию последовательностью. Полинуклеотиды, содержащиеся в одном векторе контролем одной контролирующей экспрессию последовательности, предпочтительно образуют открытую рамку считывания.

Термин "экспрессионная система" также охватывает экспрессию определенного генного продукта, включая транскрипцию полинуклеотидов, сплайсинг РНК, трансляцию в полипептид и посттрансляционную модификацию полипептида или белка.

Термин "открытая рамка считывания" (ORF) относится к последовательности нуклеотидов, которая может транслироваться в аминокислоты. Как правило, такие ORF содержат стартовый кодон, а последующие участки обычно имеют длину, кратную 3 нуклеотидам, но не содержат стоп-кодон (TAG, ТАА, TGA, UAG, UAA или UGA) в данной рамке считывания. Как правило, ORFs встречаются в природе или конструируются искусственно, т.е. средствами генной технологии. ORF кодирует белок, причем аминокислоты, в которые он может транслироваться, образуют соединенную пептидными связями цепь.

Термины "белок", "полипептид" и "пептид" применяются здесь взаимозаменяемым образом и относятся к любой соединенной пептидными связями цепи аминокислот, независимо от длины или посттрансляционной модификации.

Термин "посттрансляционные" в настоящем изобретении относится к событиям, происходящим после трансляции триплета нуклеотидов в аминокислоту и образования пептидной связи со следующей аминокислотой в последовательности. Такие посттрансляционные события могут происходить после того, как образуется полипептид, или же в процессе трансляции в тех частях полипептида, которые уже подверглись трансляции. Посттрансляционные события, как правило, изменяют или модифицируют химические или структурные свойства образующегося полипептида. Примеры посттрансляционных событий включают, без ограничения, такие события, как гликозилирование или фосфорилирование аминокислот либо расщепление пептидной цепи, например, эндопептидазой.

Термин "котрансляционные" в настоящем изобретении относится к событиям, происходящим во время процесса трансляции триплета нуклеотидов в аминокислотную цепь. Эти события, как правило, изменяют или модифицируют химические или структурные свойства образующейся аминокислотной цепи. Примеры котрансляционных событий включают, без ограничения, события, которые могут полностью остановить процесс трансляции или прервать образование пептидной связи, приводя к образованию двух отдельных продуктов трансляции.

Термины "полипротеин" или "искусственный полипротеин" в настоящем изобретении относятся к такой аминокислотной цепи, которая содержит или в основном состоит или состоит из двух аминокислотных цепей, которые не соединяются в природе друг с другом. Полипротеин может содержать одну или несколько дополнительных аминокислотных цепей. Каждая аминокислотная цепь предпочтительно составляет полный белок, т.е. охватывает весь ORF, или же его фрагмент, домен или эпитоп. Отдельные части полипротеина могут постоянно либо временно соединяться друг с другом. Те части полипротеина, которые соединены постоянно, транслируются с одного ORF и после этого не отделятся ко- или посттрансляционно. Те части п