Способ ингибирования токсичности лейкоцидина ed staphylococcus aureus у субъекта

Способ ингибирования токсичности лейкоцидина ed staphylococcus aureus у субъекта

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка заявляет приоритет, согласно предварительной заявке на патент США №61/498,606, зарегистрированной 19 июня 2011, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Настоящее изобретение относится к способам лечения и предупреждения ВИЧ-инфекций. Настоящее изобретение также относится к способам лечения воспалительных состояний и инфекций, вызванных Staphylococcus aureus.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Staphylococcus aureus

[0003] Staphylococcus aureus ("S. aureus") является бактерией, которая в качестве комменсала колонизирует более 25% представителей человеческой популяции. Важно отметить, что данный микроорганизм способен мигрировать из начального участка колонизации, что приводит к распространению бактерий и развитию болезни. S. aureus является главной причиной внутрибольничных инфекций, наиболее распространенным возбудителем инфекционного эндокардита, а также возбудителем инфекций кожи и мягких тканей, а также является одним из четырех основных причин болезней пищевого происхождения. В общей сложности, S. aureus заражает более 1,2 миллиона пациентов в год в больницах США. Угроза S. aureus для здоровья человека возрастает в связи с появлением устойчивых к антибиотикам штаммов (т.е. метициллинорезистентных (MRSA) штаммов S. aureus), в том числе штаммов, устойчивых к ванкомицину, антибиотику, который считается последней линией защиты от инфекций S. aureus. Эти факты подчеркивают важность разработки новых лекарственных средств против данного важного патогена.

[0004] S. aureus синтезирует разнообразные факторы вирулентности и токсины, которые позволяют данной бактерии нейтрализовывать и выдерживать атаку различных типов иммунных клеток, в частности, субпопуляций лейкоцитов, которые представляют основную систему защиты организма. Выработка факторов вирулентности и токсинов позволяют S. aureus поддерживать инфекционное состояние (Nizet, "Understanding How Leading Bacterial Pathogens Subvert Innate Immunity to Reveal Novel Therapeutic Targets," J. Allergy din. Immunol. 120(1):13 22 (2007)). Из этих факторов вирулентности S. aureus производит несколько двухкомпонентных лейкотоксинов, которые повреждают мембраны защитных клеток хозяина и эритроцитов объединенным действием двух неассоциированных белков или субъединиц (см. Menestrina et al., "Mode of Action of Beta-Barrel Pore-Forming Toxins of the Staphylococcal Alpha-Hemolysin Family," Toxicol. 39(11):1661-1672 (2001)). Среди этих двухкомпонентных лейкотоксинов, гамма-гемолизин (HlgAB и HlgCB) и Pantone-Valentine лейкоцидин (PVL) описаны наиболее подробно.

[0005] Токсичность лейкоцидинов по отношению к клеткам млекопитающих обусловлена действием двух компонентов. Первая субъединица названа субъединицей класса S (т.е., "slow-eluted", медленно элюируемая), а вторая субъединицей класса F (т.е., " fast -eluted", быстро элюируемая). S-и F-субъединицы действуют синергически и образуют Поры в белых клетках крови, таких как моноциты, макрофаги, дендритные клетки и нейтрофилы (вместе известные как фагоциты) (Menestrina et al., "Mode of Action of Beta-Barrel Pore-Forming Toxins of the Staphylococcal Alpha-Hemolysin Family," Toxicol. 39(11):1661 1672 (2001)). Механизм, с помощью которого двухкомпонентные токсины образуют поры в мембранах клеток-мишеней, изучен не до конца. Предлагаемый механизм действия этих токсинов включает в себя связывание S-субъединицы с мембраной клетки-мишени, скорее всего через рецептор, с последующим присоединением F-субъединицы к S-субъединице, при этом формируется олигомер, который образует предварительные поры в мембране клетки-мишени (Jayasinghe et al., "The Leukocidin Pore: Evidence for an Octamer With Four LukF Subunits and Four LukS Subunits Alternating Around a Central Axis," Protein. Sci. 14(10):2550 2561 (2005)). Поры, образованные двухкомпонентными лейкотоксинами, обычно катион-селективны. Формирование пор вызывает гибель клеток путем лизиса, который, как сообщается, вызывается осмотическим дисбалансом из-за притока катионов в случае, если мишенью являются белые клетки крови (Miles et al., "The Staphylococcal Leukocidin Bicomponent Toxin Forms Large Ionic Channels," Biochemistry 40(29):8514 8522 (2001)).

[0006] Разработка эффективной терапии для лечения MRSA-инфекции была особенно сложной. В дополнение к устойчивости к метициллину и родственным антибиотикам, для MRSA также были показаны значительные уровни устойчивости к макролидам (например, к эритромицину), комбинациям ингибиторов бета-лактамаз (например, Unasyn, Augmentin) и фторхинолонам (например, ципрофлоксацину), а также к клиндамицину, триметоприму/сульфаметоксизолу (Bactrim) и рифампицину. В случае серьезной инфекции S. aureus, врачи прибегают к внутривенному введению ванкомицина. Тем не менее, были сообщения об устойчивости S. aureus к ванкомицину. Таким образом, существует необходимость в разработке новых антибиотиков, которые смогут эффективно бороться с инфекцией S. aureus.

С-С рецептор хемокина 5

[0007] С-С рецептор хемокина 5 (CCR5) является членом семьи бета-рецепторов хемокинов (Samson M et al., "Molecular Cloning and Functional Expression of a New Human CC-Chemokine Receptor Gene" Biochemistry 35:3362 (1996)). Нормальными лигандами для этого рецептора являются RANTES, Miplb и Mipla (см. Samson, выше and Gon W et al "Monocyte Chemotactic Protein-2 Activates CCR5 and Blocks CD4/CCR5 Mediated HIV-1 Entry/Replication," J. Biol. Chem. 273:4289 (1998)). CCR5 экспрессируется в подмножестве Т-клеток, макрофагов, дендритных клеток, естественных клеток-киллеров, и микроглии. CCR5"¹" Т-клетки секретируют провоспалительные цитокины и скапливаются в местах воспаления. Таким образом, вполне вероятно, что CCR5 играет важную роль в воспалительных реакциях при инфекции и в патологических состояниях, таких как аутоиммунные заболевания. CCR5 также является рецептором для основного штамма ВИЧ-инфекции. (Deng H et al., "Identification of a Major Co-Receptor for Primary Isolates of HIV-1," Nature 381:661-666 (1996)). У лиц, инфицированных ВИЧ, вирусы, использующие CCR5 являются преобладающими элементами, выделяемыми на ранних стадиях вирусной инфекции. Предполагается, что эти вирусы могут иметь селективное преимущество при передаче или острой фазе заболеваний. Более того, по меньшей мере у половины всех инфицированных были отмечены только использующие CCR5 вирусы на протяжении всего течения инфекции. Около 1% северных европейцев лишены функциональной экспрессии CCR5 в связи с делецией в 32 паре нуклеотидов в данном гене. Лица с Д32 аллелью CCR5 здоровы, что предполагает, что CCR5 является в значительной степени несущественным элементом. Тем не менее, эти люди имеют очень сильный иммунитет к ВИЧ-инфекции (Liu R et al., "Homozygous Defect in HIV-1 Coreceptor Accounts for Resistance of Some Multiply-Exposed Individuals to HIV-1 Infection," Cell 86:367-377 (1996)). Действительно, больной СПИДом, который имел миелоидный лейкоз, был подвержен химиотерапии для подавления рака, в результате которого погибли все его Т-клетки. Затем пациенту была перелита донорская кровь, которая содержала мутантные 32 bp CCR5 с делецией, для восстановления иммунной системы. После 600 дней пациент был здоров и в крови, тканях мозга и ректальных тканях ВИЧ обнаружен не был (Hutter G et al., "Long-Term Control of HIV by CCR5 Delta32/Delta32 Stem-Cell Transplantation," N. Engl. J. Med. 360:692-698 (2009)). Был разработан ряд новых экспериментальных лекарств против ВИЧ, названных «ингибиторами входа», чтобы помешать взаимодействию CCR5 и ВИЧ, в том числе PRO 140, Vicriviroc, Aploviroc и Maraviroc (Pfizer), из которых последний в настоящее время является одобренным препаратом против ВИЧ-инфекции.

[0008] CCR5 также участвует в неконтролируемом воспалении (Charo et al., "The Many Roles of Chemokine Receptors in Inflammation," N. Engl. J. Med. 354:610-621 (2006)). Данная ассоциация основана на роли этого рецептора хемокинов при рекрутировании воспалительных лейкоцитов. В частности, CCR5 экспрессируется в подмножестве эффекторных Т-клеток, которые продуцируют провоспалительные цитокины, такие как гамма-интерферон (IFNg) и интерлейкин-17 (IL-17), количество которых увеличивается локально во время воспаления. Таким образом, CCR5 в настоящее время рассматривается в качестве мишени для ослабления воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (RA), болезнь Крона (CD), атеросклероз и псориаз.

[0009] Настоящее изобретение направлено на преодоление этих и других ограничений в данной области.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0010] Первый аспект настоящего изобретения относится к способу профилактики или лечения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) у субъекта. Этот способ включает введение состава, содержащего выделенный лейкоцидин Е (LukE) в виде белка или полипептида и выделенный лейкоцидин D (LukD) в виде белка или полипептида в количестве, эффективном для профилактики или лечения ВИЧ-инфекции у субъекта.

[0011] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу профилактики ВИЧ-инфекции у субъекта. Этот способ включает получение состава, содержащего выделенный белок LukE или его полипептид и выделенный белок LukD или его полипептид и контакт ткани субъекта с составом в условиях, эффективных для блокирования инфекционности ВИЧ клеток в ткани и, тем самым, ингибирования ВИЧ-инфекции субъекта.

[0012] Другой аспект настоящего изобретения относится к составу, включающему терапевтически эффективное количество выделенного белка LukE или его полипептида, выделенного белка LukD или его полипептида, или их комбинации, и одного или более дополнительных средств, выбранных из группы, состоящей из лубриканта, противомикробного средства, увлажнителя, эмульгатора, и смеси двух или более из них.

[0013] Другой аспект изобретения относится к способу лечения воспалительного состояния у субъекта. Этот способ включает введение составу, включающему выделенный белок LukE или его полипептид и выделенный белок LukD или его полипептид в количестве, эффективном для лечения воспалительного состояния у субъекта.

[0014] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу профилактики болезни«трансплантат против хозяина» (graft-versus-host-disease или GVHD) у субъекта. Этот способ включает введение составу, включающему выделенный белок LukE или его полипептид и выделенный белок LukD или его полипептид в количестве, эффективном для предотвращения болезни «трансплантат против хозяина» (GVHD) у субъекта.

[0015] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения инфекции Staphylococcus aureus у субъекта. Этот способ включает выбор субъекта, имеющего инфекцию S. aureus, и введение ему составу, включающему антагонист CCR5 в количестве, эффективном для лечения инфекции S. aureus у данного субъекта.

[0016] Как показано в данном документе, заявители обнаружили, что двухкомпонентный лейкотоксин Staphylococcus aureus, лейкоцидин E/D, реализует свою цитотоксичность с помощью рецептора CCR5 на поверхности лейкоцитов. Эксплуатация данного взаимодействия токсина-рецептора имеет ряд терапевтических последствий. Во-первых, поскольку LukE/D играют значительную роль в патогенезе S. aureus, использование антагонистов рецепторов CCR5 предполагает новый терапевтический подход для лечения инфекций S. aureus, особенно таких, которые вызваны штаммами MRSA. Во-вторых, в связи с его участием в инфекционности ВИЧ, разнообразные ССР5-антагонисты в настоящее время проходят клинические испытания в качестве анти-ВИЧ препаратов. Использование состава, включающего LukE и LukD, для поражения латентно-инфицированных клеток у ВИЧ-инфицированных лиц представляет собой превосходную терапевтическую стратегию по сравнению с ССР5-антагонизмом, поскольку использование этого токсина будет истощать все CCR5-положительные клетки, тем самым устраняя ВИЧ-положительные клетки. Состав, содержащий LukE и LukD, также можно вводить профилактически для предотвращения передачи ВИЧ, убивая при этом CCR5-положительные клетки, которые необходимы для передачи ВИЧ. Данные терапевтические подходы являются новыми, поскольку они будут ликвидировать у субъекта клетки ВИЧ или клетки, восприимчивые к ВИЧ-инфекции. Наконец, так как CCR5 также участвует в неконтролируемом воспалении, применение состава LukE/D для поражения и истощения CCR5-положительных клеток предлагает новый подход в борьбе с локализованными воспалительными состояниями. Этот подход к лечению имеет высокую избирательность по отношению к источнику воспаления, что позволяет тем самым избегать побочных эффектов, часто сопровождающих современные подходы к лечению воспалений.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[0017] На Фигурах 1А-1В проиллюстрировано, что LukE/D способствует инфекции S. aureus в модели системной инфекции у мышей. На Фигуре 1А проиллюстрировано, что LukE/D имеет решающее значение при смерти мышей, системно зараженных S. aureus. Выживание мышей контролировали после внутривенной инъекции с КОЕ ~ 1×10⁷ штамма S. aureus дикого типа Ньюмана, мутанта ΔlukE/D, и дополненного ΔlukE/D::plukE/D штамма. Общее количество мышей в каждой группе было N=6. Статистическая значимость между кривыми выживаемости определялась с помощью Log-rank-теста (тест Мантеля-Кокса) (р≤0,0005). На Фигуре 1 В проиллюстрировано, что LukE/D необходим для пролиферации S. aureus in vivo. Бактериальная нагрузка определялась пересчетом бактериальных КОЕ из почек спустя 96 часов после инфицирования, как проиллюстрировано на фигуре 1А. Статистическая значимость была определена с использованием 1-Way ANOVA с множественными посттестовыми сравнениями Тьюки (***, p≤0.0005).

[0018] На Фигурах 2А-2В проиллюстрировано, что LukE/D является токсичным для определенных линий иммунных клеток человека. На Фигуре 2А проиллюстрировано, что LukE/D селективно токсичен для моноцит-подобных клеток линии ТНР-1 и лимфоцит-подобных клеток линии Hut. Цитотоксичность определялась жизнеспособностью клеток, когда указанные линии иммунных клеток человека вводились в состояние интоксикации различными концентрациями эквимолярной смеси LukE+LukD (LukE/D). Жизнеспособность клеток контролировалась спустя 1 час после интоксикации с помощью CellTiter, где клетки, выращенные в среде, были определены как имеющие 100% клеточную гибель. Результаты представляют среднее значение по трем образцам ±S.D. На Фигуре 2В проиллюстрировано, что LukE/D убивает Hut-клетки, но не другие Т-лимфоцит-подобные клеточные линии. Указанные клеточные линии были введены в состояние интоксикации различными концентрациями эквимолярной смеси LukE+LukD (LukE/D), жизнеспособность данных клеток отображена на фигуре 2А. Результаты представляют среднее значение трех образцов j: S.D.

[0019] На Фигуре 3 проиллюстрировано, что CCR5 рецептор хемокинов необходим и его наличия достаточно, для того, чтобы сделать клетки млекопитающих чувствительными к цитотоксичности LukE/D. Родительские клетки Jurkat (сверху, слева) и клетки GHOST (внизу, слева) или эти же клетки, трансдуцированные CCR5 кДНК (Jurkat CCR5⁺, сверху/справа; GHOST CCR5⁺, внизу/справа), были подвержены интоксикации LukE, LukD или эквимолярной смесью LukE+LukD (LukE/D). Жизнеспособность клеток спустя один час после интоксикации контролировали с помощью CellTiter, где клетки, выращенные в среде, были определены как имеющие 100% клеточную гибель. Результаты представляют среднее значение по трех образцам ±S.D.

[0020] На фигурах 4А-4С проиллюстрировано, что цитотоксичность LukE/D по отношению к клеткам-хозяевам блокируется ингибиторами CCR5. На Фигуре 4А проиллюстрировано, что ССР5-специфичный антагонист эффективно блокирует цитотоксичность LukE/D по отношению к CCR5⁺-клеткам. Клетки CCR5⁺ Jurkats предварительно инкубировали с различными концентрациями Maraviroc (MVC), Vicriviroc (VVC), или ТАК-779 (ТАК) в течение 30 минут с последующей интоксикацией эквимолярной смесью LukE+LukD (LukE/D). Процент смертности среди клеток спустя один час после интоксикации контролировали с помощью CellTiter, где клетки, выращенные в среде +LukE/D, были определены, как имеющие 100% клеточную гибель. Результаты представляют среднее значение по трех образцам ±S.D. На Фигуре 4В проиллюстрировано, что моноклональные антитела к CCR5 ингибируют цитотоксичность LukE/D по отношению к CCR5⁺-клеткам. Клетки CCR5⁺Jurkat преинкубировали с указанными моноклональными антителами в течение 30 минут, после чего интоксицировали эквимолярной смесью LukE+LukD (LukE/D). Жизнеспособность клеток спустя один час после интоксикации контролировали с помощью CellTiter, где клетки, выращенные в среде, были определены как имеющие 100% клеточную гибель. Результаты представляют среднее значение по трех образцам ±S.D. На Фигуре 4С проиллюстрировано, что CCR5 лиганды ингибируют цитотоксичность LukE/D по отношению к CCR5⁺-клеткам. Клетки CCR5⁺ Jurkat преинкубировали с буфером (PBS; отрицательный контроль) или с различными концентрациями указанных лигандов в течение 30 минут, после чего интоксицировали эквимолярной смесью LukE+LukD (LukE/D). Жизнеспособность клеток спустя один час после интоксикации контролировали с помощью CellTiter, где клетки, выращенные в среде, были определены как имеющие 100% клеточную гибель. Результаты представляют среднее значение по трех образцам ±S.D.

[0021] На Фигурах 5А-5С проиллюстрировано, что блокирование связывания LukE/D и плазматической мембраны клеток-мишеней защищает клетки от цитотоксического воздействия LukE/D. На Фигуре 5А проиллюстрировано, что LukE/D связывается к клетками-хозяевами CCR5-зависимым путем и что это связывание эффективно подавляется Maraviroc. Клетки Jurkat (CCR5⁺) и CCR5⁺ Jurkat (CCR5⁺) предварительно инкубировали с буфером или с Maraviroc (CCR5⁺+MVC) с последующим инкубированием эквимолярной смесью LukE, связанного с зеленым флуоресцентным белком (GFP), и LukD токсином (^GFPLukE/D). Связывание токсина с плазматической мембраной клеток контролировали с помощью проточной цитометрии. На Фигуре 5 В проиллюстрировано, что LukE/D формирует поры в плазматической мембране CCR5⁺-клеток, и этот способ эффективно блокируется Maraviroc. Клетки CCR5⁺ Jurkat предварительно инкубировали с Maraviroc (MVC) и впоследствии подвергали интоксикации эквимолярной смесью LukE+LukD (LukE/D) в присутствии этидиумбромида. Формирование пор контролировалось во времени путем мониторинга связывания этидиумбромида. Результаты представляют среднее значение по трем образцам ±S.D. Фигура 5С демонстрирует, что формирование пор под действием LukE/D связано с клеточным отеком, причем данный цитопатический эффект эффективно ингибируется Maraviroc. Клетки CCR5⁺ Jurkat предварительно инкубировали с буфером (NO MVC) или с Maraviroc (MVC), а затем вводили в состояние интоксикации эквимолярной смесью of LukE+LukD (LukE/D) в присутствии этидиумбромида. Мониторинг интоксицированных клеток проводился при свете (верхние панели) и с помощью флуоресцентной микроскопии для определения поглощение этидиумбромида. Репрезентативные изображения показаны.

[0022] На фигурах 6А-С проиллюстрировано, что LukE/D эффективно убивает CCR5⁺ первичные иммунные клетки человека. На Фигуре 6А проиллюстрировано, что мишенью LukE/D являются первичные Т-лимфоциты человека CCR5-зависимым образом. Т-клетки человека, такие как мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) дикого типа CCR5 и донора A32CCR5 были выращены in vitro и затем инкубировались в среде (при отрицательном контроле) с эквимолярной смесью LukE+LukD (LukE/D) или с Maraviroc (MVC), с последующей интоксикацией эквимолярной смесью LukE+LukD (LukE/D). Затем клетки окрашивали антителом к CCR5 и их жизнеспособность оценивалась с помощью контроля красителя способом проточной цитометрии. На Фигурах 6 В-6С проиллюстрировано, что LukE/D цитотоксичен по отношению к первичным человеческим макрофагам (фигура 6В) и первичных дендритных клеток человека (фигура 6С) и что Maraviroc эффективно защищает данные клетки от цитотоксичности LukE/D. Макрофаги и дендритные клетки инкубировали в среде (при отрицательном контроле) с эквимолярной смесью LukE+LukD (LukE/D) или с Maraviroc (MVC), с последующей интоксикацией эквимолярной смесью LukE+LukD (LukE/D). Процент смертности оценивался спустя один час после интоксикации с помощью проточной цитометрии.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0023] Первый аспект настоящего изобретения относится к составу, содержащему терапевтически-эффективное количество выделенного белка LukE или его полипептида, выделенного белка LukD или его полипептида и фармацевтически приемлемого носителя.

[0024] В соответствии с данным аспектом настоящего изобретения, подходящие выделенные белки LukE включают такие, которые можно получить из любого штамма S. aureus. Аминокислотная последовательность белков LukE из различных штаммов S. aureus, которые подходят для состава согласно настоящему изобретению, показаны в таблице 1, приведенной ниже (т.е. SEQ ID Nos:1-10). SEQ ID NO:11 в таблице 1 представляет консенсусную последовательность LukE и демонстрирует высокий уровень идентичности последовательности с белками LukE различных штаммов S. aureus. Соответственно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения выделенный белок LukE содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, выделенный белок LukE содержит аминокислотную последовательность, имеющую около 70-80% сходство последовательности с SEQ ID NO:11 или, что более предпочтительно, около 80-90% сходство последовательности в SEQ ID NO:11, или более предпочтительное 90-95% сходство последовательности с SEQ ID NO:11, или наиболее предпочтительное около 95-99% сходство с последовательностью SEQ ID NO:11.

[0025] В другом варианте осуществления настоящего изобретения состав содержит выделенный полипептид LukE. Подходящие полипептиды LukE имеют длину от около 50 до около 100 аминокислот. Более предпочтительные LukE полипептиды имеют в длину примерно 100-200 аминокислот, более предпочтительные - около 200-250 аминокислот в длину, а наиболее предпочтительные - 250-300 аминокислот в длину. Аминокислотные остатки N-концов полного LukE представляют нативную последовательность секреции/сигналинга. Таким образом, «зрелая» секретируемая форма LukE представлена аминокислотными остатками 29-311 в каждой из последовательностей SEQ ID NO:1-10 и SEQ ID NO:11. Соответственно, аминокислотные остатки 1-311 в каждом из SEQ ID NO:1-10 и SEQ ID NO:11, обозначаются как "незрелая" форма LukE. Соответственно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид LukE содержит аминокислотные остатки 29-311 из SEQ ID NO:11, аминокислотные остатки 48-291 из SEQ ID NO:11, аминокислотные остатки 29-301 из SEQ ID No:11 и аминокислоты 48-301 из SEQ ID NO:11. В любом случае, подходящие полипептиды LukE также включают те полипептиды, которые содержат аминокислотную последовательность, имеющую сходство около 70-80%, предпочтительнее сходство последовательностей 80-90%, более предпочтительно сходство последовательностей 90-95% и наиболее предпочтительно 95-99% сходство последовательности аминокислотным остаткам 29-311 из SEQ ID NO:11 или 48-291 из SEQ ID NO:11.

[0026] В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения, подходящие выделенные белки LukD включают такие, которые получены из любого штамма S. aureus. Аминокислотная последовательность LukD белков из различных штаммов S. aureus, которые подходят для состава согласно настоящему изобретению, показаны в таблице 2, приведенной ниже (т.е. SEQ ID Nos: 12-21). SEQ ID NO:22 в таблице 2 представляет собой консенсусную последовательность белка LukD, которая демонстрирует высокий уровень идентичности последовательности с белками LukD различных штаммов S. aureus. Соответственно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения, выделенный белок LukD содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:22. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, выделенный белок LukD содержит аминокислотную последовательность, имеющую сходство последовательностей около 70-80% с SEQ ID NO:22, предпочтительнее около 80-90% сходство последовательности с SEQ ID NO:22, более предпочтительно 90-95% сходство последовательности с SEQ ID NO:22, и наиболее предпочтительно около 95-99% сходство последовательности с SEQ ID NO:22.

[0027] В другом варианте осуществления настоящего изобретения состав содержит выделенный полипептид LukD. Подходящие полипептиды LukD имеют от около 50 до около 100 аминокислот в длину. Более предпочтительны полипептиды LukD около 100-200 аминокислот в длину, более предпочтительны около 200-250 аминокислот в длину и наиболее предпочтительны около 250-300 аминокислот в длину. Аминокислотные остатки N-концов от полного LukD представляют собой нативную последовательность секреции/сигналинга. Таким образом, "зрелая" секретируемая форма LukD представлена аминокислотными остатками 27-327 в каждой из последовательностей SEQ ID NO:12-21 и SEQ ID NO:22. Соответственно, аминокислотные остатки 1-327 из SEQ ID NO:12-21 и SEQ ID NO:22 обозначаются как "незрелая" форма LukD. Соответственно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид LukD содержит аминокислотные остатки 27-327 из SEQ ID NO:22. В другом случае, полипептид LukD согласно настоящего изобретения содержит аминокислотные остатки 46-307, аминокислотные остатки 27-312, и аминокислотные остатки 46-312 из SEQ ID NO:22. В любом случае, подходящими полипептидами являются такие, которые включают аминокислотную последовательность, имеющую сходство около 70-80%, предпочтительнее 80-90% сходство последовательностей, более предпочтительно 90-95% сходство последовательностей и наиболее предпочтительно 95-99% сходство последовательности аминокислотным остаткам 27-327 из SEQ ID NO:22, аминокислотным остаткам 46-307 из SEQ ID NO:22, аминокислотным остаткам 46-312 из SEQ ID NO:22, или аминокислотным остаткам 27-312 из SEQ ID NO:22.

[0028] Таким образом, если не указано обратное, как незрелые, так и зрелые формы нативных LukE и LukD, а также последовательности, имеющие менее 100% сходство с нативным LukE (т.е. нативные последовательности и аналоги, вместе называемые в данном документе "LukE" и "LukD"), могут быть использованы в способах для настоящего изобретения.

[0029] Белки и полипептиды LukE и LukD, описанные в настоящем изобретении, могут отличаться от нативных полипептидов, обозначенных как SEQ ID NOS:1-11 и 12-22 соответственно с точки зрения одной или более дополнительных аминокислотных вставок, замен или делеций. К примеру, один или несколько аминокислотных остатков в SEQ ID NOS:1-22 могут быть замещены другой аминокислотой подобной полярности, которая действует как функциональный эквивалент, и приводит к "молчащему" изменению. То есть изменение относительно нативной последовательности не будет заметно уменьшать основные свойства нативных LukE или LukD. Любой подобный аналог LukE или LukD может быть подвергнут скринингу в соответствии с протоколами, приведенными в данном документе (например, анализа цитотоксичности и анализа повреждений мембраны), чтобы определить сохраняет ли аналогактивность нативных LukE или LukD. Замены для этих лейкоцидинов могут быть выбраны из других членов класса, к которому принадлежит аминокислота. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты, а именно аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярными нейтральными аминокислотами являются глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженными (основными) аминокислотами являются аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженными (кислыми) аминокислотами являются аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота.

[0030] В других вариантах осуществления неконсервативные изменения (например, одна или несколько аминокислотных замен, делеций и/или дополнений) могут быть сделаны для целей повышения селективности и/или активность LukE и/или LukD. Модифицированный LukE и LukD могут использовать в лекарственных средствах, описанных в данном документе. Молекулярные изменения могут быть выполнены способами, хорошо известными в данной области, в том числе удлинением праймера на матрице плазмиды с использованием одноцепочечных шаблонов (Kunkel et al.,, Proc. Acad. Sci:, USA 52:488-492 (1985), цитата в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки), двухцепочечные ДНК-матрицы (Papworth et al., Strategies 9(3):3-4 (1996), цитата в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки) и с помощью ПЦР-клонирования (Braman, J. (ed.), IN VITRO MUTAGENESIS PROTOCOLS, 2nd ed. Humana Press, Totowa, N.J. (2002), цитата в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки). Способы определения того, изменяет ли данная молекулярная альтернатива LukE и LukD цитотоксичность LukE/D, описаны в данном документе.

[0031] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используется высокоочищенный препарат LukE/LukD. Способы очистки токсинов LukE и LukD известны в данной области (Gravet et al., "Characterization of a Novel Structural Member, LukE-LukD, of the Bi-Component Staphylococcal Leucotoxins Family," FEBS 436: 202-208 (1998), цитата в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки). Согласно данному документу, при применении "выделенного" белка или полипептида, они относится к белку или полипептиду, которые были отделены от других белков, липидов и нуклеиновых кислот, с которыми они были естественно ассоциированы. Чистоту можно измерить любым подходящим стандартным способом, например, с помощью колоночной хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле, анализа HPLC. Выделенный согласно настоящему изобретению белок или полипептид может быть очищен из природного источника, получен с помощью технологии рекомбинантной ДНК или с помощью химических способов.

[0032] Лекарственные средства настоящего изобретения получают путем сочетания LukE и LukD с фармацевтически приемлемым носителем и, что необязательно, с фармацевтически приемлемым наполнителем. Используемые в данном документе термины " фармацевтически приемлемый носитель" и "фармацевтически приемлемый наполнитель " (например, добавки, такие как разбавители, иммуностимуляторы, адъюванты, антиоксиданты, консерванты и солюбилизирующие средства) являются нетоксичными для клетки или млекопитающего, подвергаемого воздействию ими в принятых дозах и рабочих концентрациях. Примером фармацевтически приемлемого носителя является вода, к примеру, буферизированная фосфатом, цитратом и другой органической кислотой. Репрезентативные примеры фармацевтически приемлемых наполнителей, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота; низкомолекулярные (менее 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; адъюванты (которые выбирают таким образом, чтобы избежать адъювантно-индуцированной токсичности; такие как β-глюкан, как описано в патенте США 6355625, Pavliak et al., цитата в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки; или гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (GCSF)); гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как EDTA; сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN^®, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и PLURONICS^®.

[0033] Лекарственные средства согласно настоящему изобретению могут быть подготовлены для хранения смешиванием активного ингредиента(ов), имеющих требуемую степень чистоты, с фармацевтически приемлемым носителем и, что необязательно, с эксципиентом и/или дополнительным активным средством в виде лиофилизированных составов или водных растворы.

[0034] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу профилактики или лечения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) у субъекта. Этот способ включает введение составу, включающему выделенный белок LukE или его полипептид и выделенный белок LukD или его полипептид в количестве, эффективном для профилактики или лечения ВИЧ-инфекции у субъекта.

[0035] В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения, подходящий состав для введения субъекту для лечения ВИЧ-инфекции содержит белки или полипептиды как LukE так и LukD, которые способны связываться с рецептором и сохраняют цитотоксическую функцию полных белков LukE или LukD. Подходящий состав для введения субъекту для профилактики ВИЧ-инфекции содержит белки или полипептиды как LukE так и LukD, которые способны связываться с рецептором и сохраняют цитотоксическую функцию. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, LukE и LukD белки сохраняют функцию связывания рецептора, но при этом не цитотоксичны или обладают меньшей цитотоксичностью.

[0036] В соответствии с данным аспектом настоящего изобретения, подходящими белками и полипептидами LukE и LukD являются те, которые описаны выше. Данный аспект настоящего изобретения основан на открытии заявителей, заключающемся в том, что LukE/D связывается с рецептором лейкоцитов CCR5, который опосредует входу и инфекционности клеток ВИЧ. Связывание LukE/D с CCR5 опосредует цитотоксичность LukE/D. Поэтому, при лечении субъекта, имеющего ВИЧ, белки или полипептиды LukE и LukD из состава связываются с рецептором CCR5 и приводят к смерти всех ВИЧ-положительных клеток. Этот способ лечения лучше современных терапевтических стратегий борьбы с ВИЧ, поскольку лечение с помощью LukE/D будет избирательно и специально разрушать все CCR5 положительные, и, соответственно, все ВИЧ-положительные клетки у субъекта.

[0037] При назначении LukE/D составы согласно настоящему изобретению для профилактики ВИЧ-инфекции у субъекта, белки или полипептиды LukE и LukD предпочтительно должны быть изменены, чтобы уменьшить цитотоксичность, как описано выше, и/или должна быть повышена способность LukE/LukD связываться с рецептором. Соответственно, состав может содержать модифицированный белок или полипептид LukE или LukD, который сохраняет, по крайней мере, 70% сходство с последовательностями SEQ ID NO:11 и 22 соответственно. Предпочтительно, чтобы белки или полипептиды LukE и LukD согласно настоящему изобретению сохраняли по крайней мере 80% сходство с последовательностями SEQ ID NO:11 и 22 соответственно. Более предпочтительно, чтобы белки или полипептиды LukE и LukD согласно настоящему изобретению сохраняли по крайней мере 90% сходство с последовательностями SEQ ID NO:11 и 22 соответственно. Наиболее предпочтительно, чтобы белки или полипептиды LukE и LukD согласно настоящему изобретению сохраняли по крайней мере 95% сходство с последовательностями SEQ ID NO:11 и 22 соответственно.

[0038] Лекарственные средства настоящего изобретения могут быть назначены как часть комбинированной терапии в сочетании с другим средством против ВИЧ. Соответственно, состав, включающий выделенный белок LukE или его полипептид и выделенный белок LukD или его полипептид, может дополнительно включать или вводиться в комбинации с одним или более противовирусными или другими средствами, полезными в лечении ВИЧ-инфекции. Подходящими противовирусными средствами являются нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы и ингибиторы протеазы. В частности, подходящими противовирусными средствами являются, без ограничения, зидовудин, ламивудин, зальцитабин, диданозин, ставудин, абакавир, адефовир дипивоксил, лобукавир, ВС Н-10652, эмитрицитабин, бета-L-FD4, DAPD, лоденозин, невирапин, делавиридин, эфавиренц, PNU-142721, AG-1549, МКС-442, (+)-каланолид А и В, саквинавир, индинавир, ритонавир, нелфинавир, лазинавир, DMP- 450, BMS-2322623, АВТ-378, ампренавир, гидроксимочевину, рибавирин, IL-2, IL-12, пентафузид, Yissum №11607 и AG-1549.

[0039] Для целей этого и других аспектов настоящего изобретения, целевой "субъект" является любым животным, предпочтительно млекопитающим, более предпочтительно - человеком. В контексте назначения состава согласно настоящему изобретению для целей профилактики ВИЧ-инфекции у субъекта, целевой субъект - это такой субъект, который находится в опасности заражения ВИЧ-инфекцией. В контексте назначения состава согласно настоящему изобретению в целях лечения ВИЧ-инфекции у субъекта, целевой субъект - это такой субъект, который инфицирован ВИЧ.

[0040] В контексте использования лекарственных средств согласно настоящему изобретению для лечения инфекции ВИЧ, терапевтически эффективное количество LukE и LukD является таким количеством, которое способно привести к уменьшению симптомов, связанных с инфекцией, уменьшению тяжести проявления по крайней мере одного симптома, снижению вирусной нагрузки на субъекта, и, предпочтительно, полному искоренению вируса у субъекта.

[0041] Терапевтически эффективные количества состава LukE и LukD могут быть определены в соответствии со стандартными процедурами, которые принимают во внимание многочисленные факторы, в том числе, например, концентрации этих активных средств в составе, способ и частоту их введения, тяжесть ВИЧ-инфекции, подлежащей лечению (или предотвращению) и учитывают такие детали, как возраст, вес и общее состояние здоровья и иммунитета. Общее руководство можно найти, к примеру, в