Способ получения алкенов путем комбинированного ферментативного превращения 3-гидроксиалкановых кислот

Способ получения алкенов путем комбинированного ферментативного превращения 3-гидроксиалкановых кислот

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способу получения алкенов с помощью биологического процесса. Более специфически, изобретение относится к способу получения алкенов (например, пропилена, этилена, 1-бутилена, изобутилена или изоамилена) из молекул 3-гидроксиалканоатного типа.

В настоящее время много химических продуктов получают из нефтяного сырья. Алкены (такие, как этилен, пропилен, различные бутены, или, например, также пентены) используют в производстве пластмасс, например, для получения полипропилена или полиэтилена, и в других областях химической промышленности и топлив.

Этилен, самый простой алкен, занимает центральное место в промышленной органической химии: он является органическим соединением, которое вырабатывается в наибольшем количестве во всем мире. Он используется, в частности, для получения полиэтилена, основной пластмассы. Этилен также может быть превращен во многие промышленно используемые продукты путем реакции (окисления, галогенирования).

Пропилен занимает сходную важную роль: при его полимеризации получают пластмассовый материал, полипропилен. Технические свойства этого продукта в отношении устойчивости, плотности, твердости, деформируемости, и прозрачности несравненны. Во всем мире производство полипропилена непрерывно увеличивается с его изобретения в 1954 г.

Бутилен существует в четырех формах, один из которых, изобутилен, входит в состав метил-трет-бутилового эфира (МТВЕ), антидетонационной присадки для автомобильного топлива. Изобутилен также может использоваться для получения изооктена, который, в свою очередь, может быть восстановлен до изооктана (2,2,4-триметилпентан); очень высокое октановое число изооктана делает его наилучшим топливом для так называемых "бензиновых" двигателей.

Амилен, гексен и гептен существуют во многих формах в соответствии с положением и конфигурацией двойной связи. Эти продукты имеют реальное промышленное применение, но являются менее важными, чем этилен, пропилен или бутены.

Все эти алкены в настоящее время продуцируются путем каталитического крекинга нефтепродукты (или с помощью производного процесса Фишера-Тропша в случае гексена, из угля или газа). Их стоимость соответственно естественно индексирует цену нефти. Кроме того, каталитический крекинг иногда связан со значительными техническими сложностями, которые повышают сложность процесса и себестоимость производства.

Несмотря на представленный выше анализ, биополучение пластмасс ("биопластиков") является бурно развивающейся областью. Этот подъем обусловлен экономическим интересом, связанным с ценой на нефть, и экологическими соображениями, которые являются как глобальными (продукты с нулевым балансом выбросов углерода) и локальными (организация сбора и удаления отходов).

Основным семейством биопластиков является семейство полигидроксиалканоатов (РНА). Они представляют собой полимеры, получаемые путем конденсации молекул, содержащих как кислотную группу, так и спиртовую группу. Конденсация происходит путем эстерификации кислоты на спирте последующего мономера. Эта сложноэфирная связь не является настолько стабильной, как прямая углерод-углеродная связь, присутствующая в полимерах общепринятых пластмасс, что объясняет, почему РНА имеют способность к биологическому разложению от нескольких недель до нескольких месяцев.

РНА семейство включает, в частности, поли-3-гидроксибутират (РНВ), полимер 3-гидроксибутирата, и полигидроксибутират-валерата (PHBV), сополимер с регулярным чередованием мономерных единиц 3-гидроксибутирата и 3-гидроксивалерата.

РНВ естественно продуцируется некоторыми штаммами бактерий, таких как Alcaligenes eutrophus и Bacillus megaterium. Были сконструированы лабораторные бактерии, такие как Е.coli, имеющие интегрированные синтетические пути, приводящие к РНВ или к РНА в целом. Соединение или его полимер может, в определенных лабораторных условиях, обуславливать вплоть до 80% бактериальной массы (Wong MS и др., Biotech. Bioeng.99 (2008), 919-928). Попытки получения РНВ в промышленном масштабе осуществлялись в 1980х гг., но стоимость получения соединения путем ферментации считалась слишком высокой в то время. Разрабатываются проекты, направленные на прямое получение этих соединений в генетически модифицированных растениях (имеющие интегрированные ключевые ферменты пути синтеза РНВ, присутствующие в бактериях-продуцентах) и они должны быть менее затратными.

Биологическое получение алканов или молекул других углеводородов, которые можно использовать в качестве топлива или в качестве предшественников синтетических смол, рассматривается в контексте экологически безвредной промышленной эксплуатации в гармонии с геохимическим циклом. Первое поколение биотоплив включает продукты ферментации этанола, в качестве процессов ферментации и перегонки, которые уже существуют в пищевой промышленности. Получение биотполива второго поколения находится на стадии исследования, охватывая получение длинноцепочечных спиртов (бутанол и пентанол), терпенов, линейных алканов и жирных кислот. В двух недавних обзорах представлен обзор исследований в этой области: Ladygina N и др., Process Biochemistry, 2006, 41: 1001; и Wackett LP, Current Opinions in Chemical Biology, 2008, 21: 187.

В химическом семействе алкенов, изопрен (2-метил-1,3-бутадиент) представляет собой терпеновый мотив, который, посредством полимеризации, приводит к каучуку. Могут быть разработаны другие терпены, с помощью химических, биологических или смешанных путей, в качестве полезных продуктов, таких как биотопливо или для приготовления пластмасс. В недавно опубликованной литературе показано, что мевалонатный путь (ключевой промежуточный продукт при биосинтезе стероидов во многих организмах) можно использовать для эффективного получения продуктов терпенового семейства в промышленных выходах (Withers ST и др., Appl. Environ. Microbiol., 2007, 73: 6277).

Получение алкенов, в частности концевых алкенов, [этилен моно- или ди-замещенных в положении 2: H₂C=C(R¹)(R²)], по всей видимости, менее интенсивно исследуется. Было описано превращение изовалерата в изобутилен с помощью дрожжей Rhodotorula minuta (Fujii Т. и др., Appl. Environ. Microbiol., 1988, 54:583), но эффективность этой реакции, охарактеризована очень низким значением числа оборотов (k_cat составляет 1×10^-5 с^-1), не позволяет реализовать промышленное применение. Механизм реакции был описан Fukuda H и др. (BBRC, 1994, 201(2): 516) и задействует фермент цитохром Р450, который декарбоксилирует изовалерат путем восстановления окоферрильной группы Fe^v=O. Ни при каких условиях реакция не включает гидроксилирование изовалерата. Изовалерат также представляет собой промежуточное соединение в катаболизме лейцина. Крупномасштабный биосинтез изобутилена с помощью такого пути представляется чрезвычайно неблагоприятным, поскольку для него будет необходим синтез и разложение одной молекулы лейцина с образованием одной молекулы изобутилена. Кроме того, фермент, катализирующий реакцию, использует гем в качестве кофактора, плохо поддается рекомбинантной экспрессии в бактерии и улучшению параметров фермента. Учитывая все эти факторы, кажется очень маловероятным, что этот путь из уровня техники может служить в качестве основы для промышленного использования. Были описаны другие микроорганизмы в качестве незначительно способных пригодно продуцировать изобутилен из изовалерата; полученные выходы были даже еще ниже, чем выходы, полученные с Rhodotoruia minuta (Fukuda Н. и др, Agric. Biol. Chem., 1984, 48: 1679).

В некоторых исследованиях также было описано природное получение пропилена: многие микроорганизмы способны продуцировать пропилен, однако также с чрезвычайно низким выходом. Продукция этилена растениями давно известна (Meigh и др., 1960, Nature, 186:902). В соответствии с описанным метаболическим путем, метионин является предшественником этилена (Adams и Yang, PNAS, 1979, 76:170). Также было описано превращение 2-окоглутарата (Ladygina N и др., Process Biochemistry 2006, 41:1001). Поскольку для получения двухуглеродной молекулы этилена расходуется четырех- или пяти-углеродная молекула предшественника, то эти пути являются материально и энергетически неблагоприятными для их промышленного применения.

Таким образом, существует потребность в эффективных методах получения алкенов, таких как этилен, пропилен, 1-бутилен, изобутилен, 1-амилен или изоамилен.

В WO 2010/001078 описан процесс получения алкенов путем ферментативного превращения 3-гидроксиалкановых кислот с помощью фермента, имеющего активность декарбоксилазы. Такой способ является благоприятным, поскольку он помогает избежать применения нефтепродуктов, снижает стоимость получения пластмасс и топлива и может иметь существенное глобальное влияние на окружающую среду вследствие предоставления возможности хранения углерода в твердой форме. Несмотря на то, что способ, описанный в WO 2010/001078, предоставляет возможность получения алкенов путем ферментативного превращения 3-гидроксиалканоатов, он все еще нуждается в улучшении, в частности относительно эффективности процесса таим образом, чтобы сделать его пригодным для промышленных целей. Настоящая заявка решает эту проблему.

В настоящей заявке описан способ получения алкеновых соединений, используя в качестве исходного соединения 3-гидроксиалканоат с помощью биологического процесса, в особенности ферментативный процесс, в котором два типа ферментов комбинированы для повышения эффективности производительности. Более специфически, настоящее изобретение относится к способу получения алкена, который отличается тем, что он включает превращение 3-гидроксиалканоата в указанный алкен с помощью

(i) первого фермента, который обладает активностью превращать 3-гидроксиалканоат в соответствующий 3-фосфоноксиалканоат; и

(ii) второго фермента, который отличается от первого фермента и, который обладает активностью превращать указанный 3-фосфоноксиалканоат в указанный алкен.

Настоящее изобретение также относится к применению по меньшей мере двух ферментов, где один фермент выбирают из (i), как указано выше, и другой фермент выбирают из (ii), как указано выше, или микроорганизма, продуцирующего указанную комбинацию ферментов, для получения алкенового соединения из 3-гидроксиатакажэата. Настоящее изобретение также относится к организмам, предпочтительно микроорганизмам, которые продуцируют по меньшей мере два фермента, где один фермент выбирают из (i), как указано выше, и другой фермент выбирают из (ii), как указано выше.

"3-гидроксиалканоат", как используется в настоящей заявке, обозначает молекулу в соответствии со следующей общей формулой:

C_n+1H_2n+2O₃,

с 1<n<7, и содержащую 3-гидроксипропионат в качестве общего мотива (Фигура 1), и необязательно один или два алкильных заместителя на углероде 3. Указанные алкильные остатки или группы могут быть линейными или разветвленными. Как используется в настоящей заявке, термины "алкоил" и "алкил" имеют аналогичное значение и являются взаимозаменяемыми. Аналогичным образом, термины "остаток" и "группа" имеют аналогичное значение и являются взаимозаменяемыми. Метильная, этильная, пропильная, изопропильная, бутильная, изобутильная группы являются примерами указанных алкильных групп. Углерод 3 становится хиральным центром, если два алкильных заместителя являются различными. Настоящее определение охватывает две хиральные формы, даже если одна из двух форм, например, R форма, является основной формой, продуцируемой в естественных условиях. Примеры 3-гидроксиалканоатов представлены на Фигуре 3. Необязательно, алкильные заместители могут быть добавлены на углероде 2, который впоследствии также может становиться хиральным (если два заместителя являются разными). Равным образом, конфигурации 3-гидроксиалканоатных субстратов в настоящем изобретении охватывает все стереоизомеры. В предпочтительном варианте осуществления, 3-гидроксиалканоаты соответствуют либо 3-гидроксмпропионату или вариантам или производным 3-гидроксипропионата, в которых один из двух или два атома водорода, которые находятся на углероде 3, замещены мотивом, состоящим только из атомов углерода и водорода, количество атомов углерода указанных заместителей находится в диапазоне от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 3, такие как метил, этил, пропил, изопропил, бутил или изобутил. Суффикс "оат", как используется в настоящей заявке, может взаимозаменяемо обозначать либо карбоксилатный ион (СОО-) или карбоновую кислоту (СООН). Он не используется для обозначения сложного эфира. В предпочтительном варианте осуществления, 3-гидроксиалканоаты представлены следующей формулой:

HO-CO-CH₂-C(R¹)(R²)-OH или O^--CO-CH₂-C(R¹)(R²)-OH.

Термин "3-фосфоноксиалканоат" обозначает молекулу, которая соответствует следующей общей формуле:

C_n+1H_2n+3О₆Р,

с 1<n<7, и содержащей 3-фосфоноксипропионат в качестве общего мотива, и необязательно один или два алкильных заместителя на углероде 3.

Термин "алкен", как используется в настоящей заявке, обозначает молекулы, состоящие только из углерода и водорода, содержащие одну углерод-углеродную двойную связь и имеющие химическую формулу мононенасыщенного углеводорода, C_nH_2n, где n равно по меньшей мере двум. Предпочтительно, п равно по меньшей мере 3, 4, 5 или 6. Наиболее предпочтительно п представляет собой самое большее 6. Таким образом, в целом, термин "алкен" относится к молекуле, соответствующей формуле C_nH_2n, с 1<n<7.

В предпочтительном варианте осуществления алкены представлены структурной формулой H₂C=C(R¹)(R²), где R¹ и R² выбирают, независимо, из группы, включающей атом водорода и линейный или разветвленный алкильный радикал, таким образом, что общее количество атомов углерода в алкеновой молекуле составляет самое большее 6.

Предпочтительными примерами алкеновых соединений в соответствии с изобретением являются в особенности этилен, пропилен, изобутилен, и изоамилен (Фигура 4), или также 1-бутилен и 1-амилен.

"Источник углерода", как используется в настоящей заявке, обозначает любое углеродное соединение, которое можно использовать в качестве субстрата для организмов в соответствии с изобретением. Указанный термин включает глюкозу или любую другую гексозу, ксилозу или любую другую пентозу, полиолы, такие как глицерин, сорбит или маннит, или также полимеры, такие как крахмал, целлюлоза или гемицеллюлоза, или также поли-3-гидроксиалканоаты, такие как поли-3-гидроксибутират.Это может быть любой субстрат, предоставляющий возможность роста микроорганизмов, такой как, например, формиат. Это также может быть CO₂ в том случае, если микроорганизмы способны осуществлять фотосинтез.

"Рекомбинантный", как используется в настоящей заявке, обозначает искусственную генетическую модификацию организма, либо путем добавления, удаления, или модификации хромосомного или экстра-хромосомного гена или регуляторного мотива, такого как промотор, или путем слияния организмов, или путем добавления вектора любого типа, например, плазмидного. Термин "рекомбинантная экспрессия" обозначает продукцию белка, включающего генетическую модификацию, предпочтительно для получения белка экзогенного или гетерологического происхождения по отношению к его хозяину, то есть, который в естественных условиях не встречается в продуцирующем хозяине, или для получения модифицированного или мутированного эндогенного белка.

"Сверхэкспрессия" или "сверхэкспрессирующий", как используется в настоящей заявке, обозначает рекомбинантную экспрессию белка в организме-хозяине, предпочтительно имеющего происхождение из организма, отличающегося от того, в котором он экспрессируется, повышенную по меньшей мере на 10% и предпочтительно на 20%, 50%, 100%, 500% и возможно больше по сравнению в естественной экспрессией указанного белка, встречающейся в указанном организме-хозяине. Это определение также охватывает случае, где отсутствует естественная экспрессия указанного белка.

"Ко-субстрат" представляет собой соединение или молекулу, добавляемую к ферментативной реакции, для того, чтобы улучшить их определенные параметры, и главным образом их активность, указанный продукт и основной субстрат расходуются в равных количествах. Таким образом, ко-субстрат следует добавлять к реакции в концентрации, сопоставимой с таковой основного субстрата. В зависимости от фермента, присутствие ко-субстрата может быть необходимым для ферментативной реакции.

"Кофактор" представляет собой продукт, добавляемый к ферментативной реакции, для того, чтобы улучшить их определенные параметры, и главным образом их активность, указанный продукт не израсходуется при осуществлении реакции, и поэтому его необходимо добавлять только в низких концентрациях, пропорционально количеству фермента, указанная концентрация, следовательно, обозначается как "каталитическая".

"Часть" аминокислотной последовательности обозначает фрагмент, содержащий по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 20, 30, 40 или 50 последовательных аминокислотных остатков указанной последовательности.

"Гомология", как используется в настоящей заявке, обозначает существование сходства между двумя последовательностями, что измеряется и помощью процента идентичности между указанными двумя последовательностями. В предпочтительном варианте осуществления термин "гомология" обозначает идентичность последовательности.

Химические соединения часто известны под несколькими названиями, официальными или тривиальными. В настоящей заявке, предпочтительными являются тривиальные названия. Таким образом:

- "этилен" используется для обозначения этена

- "пропилен" используется для обозначения пропена

- "бутилен" используется для обозначения бутена

- "изобутилен" используется для обозначения 2-метилпропена или изобутена

- "амилен" используется для обозначения пентена

- "изоамилен" используется для обозначения 2-метил-бут-1-ена или изопентена

- "пропионат" используется для обозначения пропановой кислоты или пропаноатного иона

- "бутират" используется для обозначения бутановой кислоты или бутаноатного иона

- "валерат" используется для обозначения пентановой кислоты или пентаноатного иона.

В настоящей заявке описан способ получения алкеновых соединений, используя в качестве исходного соединения 3-гидроксиалканоат с помощью биологического процесса, в особенности ферментативный процесс, в котором два типа ферментов комбинированы для повышения эффективности производительности. Более специфически, настоящее изобретение относится к способу получения алкена, который отличается тем, что он включает превращение 3-гидроксиалканоата в указанный алкен с помощью

(i) первого фермента, который обладает активностью превращать 3-гидроксиалканоат в соответствующий 3-фосфоноксиалканоат; и

(ii) второго фермента, который отличается от первого фермента и, который обладает активностью превращать указанный 3-фосфоноксиалканоат в указанный алкен.

Как указано выше, в WO 2010/001078 описан способ получения алкенов путем ферментативного превращения 3-гидроксиалкановых кислот с помощью фермента, имеющего активность декарбоксилазы. В WO 2010/001078 было описано, что в целом превращение 3-гидроксиалканоата в алкен с помощью фермента, имеющего активность декарбоксилазы, например, мевалонат дифосфат (MDP) декарбоксилазы (Е.С.4.1.1.33), происходит путем превращения 3-гидроксиалканоата в соответствующий 3-фосфоноксиалканоат, который затем декарбоксилируют, что приводит к получению соответствующего алкена. Характерная реакция, осуществляемая MDP декарбоксилазой с использованием различных 3-гидроксиалканоатов, представлена на Фигуре 2В. Сейчас было обнаружено, что различные декарбоксилазы, в особенности мевалонат дифосфат декарбоксилазы, катализируют две вышеуказанные стадии с различными эффективностями, то есть что некоторые декарбоксилазы катализируют первую стадию с более высокой эффективностью по сравнению с другими декарбоксилазами и что некоторые декарбоксилазы проявляют предпочтение для второй стадии, то есть стадии декарбоксилирования, и что, следовательно, эффективность превращения 3-гидроксиалканоата в алкен, как описано в WO 2010/001078, может быть существенно повышена путем комбинирования соответствующих ферментов. Таким образом, настоящее изобретение в особенности относится к способу достижения более высокой эффективности при ферментативном получении алкенов из 3-гидроксиалканоатов, то есть способу улучшения эффективности такого ферментативного получения.

Термин "фермент, который обладает активностью превращать 3-гидроксиалканоат в соответствующий 3-фосфоноксиалканоат" обозначает фермент, который может фосфорилировать 3-гидроксиалканоат в соответствующий 3-фосфоноксиалканоат.Фосфатная группа предпочтительно поступает из молекулы АТФ.

Эта активность может быть измерена, например, как описано в приложенных примерах, в особенности Примере 5. Таким образом, одной возможностью является инкубирование соответствующего фермента с 3-гидроксиалканоатом и АТФ и измерение продукции АДФ (то отображает продукцию соответствующего 3-фосфоноксиалканоата). Исследования для измерения продукции АДФ известны специалисту в данной области техники. Одним из этих методом является исследование пируват киназа/лактат дегидрогеназа, описанное в примере 5. В этом случае, в исследовании измеряют скорость снижения абсорбции NADH при 340 нм, которая пропорциональна количеству АДФ. В предпочтительном варианте осуществления термин "фермент, который обладает активностью превращать 3-гидроксиалканоат в соответствующий 3-фосфоноксиалканоат" обозначает фермент, который может превращать 3-гидроксиизовалерат и АТФ в 3-фосфоноксиизовалерат и АДФ. Еще более предпочтительно, такой фермент может катализировать реакцию превращения 3-гидроксиалканоата в соответствующий 3-фосфоноксиалканоат, предпочтительно реакцию превращения 3-гидроксиизовалерата и АТФ в 3-фосфоноксиизовалерат и АДФ, с К_М 10 мМ или ниже, например, с К_М 5 мМ или ниже, предпочтительно 1 мМ или ниже и более предпочтительно 0,1 мМ или ниже. В особенно предпочтительном варианте осуществления, такой фермент может катализировать реакцию превращения 3-гидроксиалканоата в соответствующий 3-фосфоноксиалканоат, предпочтительно реакцию превращения 3-гидроксиизовалерата и АТФ в 3-фосфоноксиизовалерат и АДФ, с k_cat по меньшей мере 0,2 с^-1, предпочтительно k_cat по меньшей мере 0,5 с^-1, особенно предпочтительно k_cat по меньшей мере 1,0 с^-1, более предпочтительно по меньшей мере 2,0 с^-1 и еще более предпочтительно k_cat по меньшей мере 5,0 с^-1.

В особенно предпочтительном варианте осуществления способность превращать 3-гидроксиизовалерат и АТФ в 3-фосфоноксиизовалерат и АДФ измеряют в исследовании, как описано в примере 5.

Термин "фермент, который обладает активностью превращать указанный 3-фосфоноксиалканоат в указанный алкен" обозначает фермент, который может катализировать реакцию, посредством которой происходит декарбоксилирование и дефосфорилирование 3-фосфоноксиалканоата, что впоследствии приводит к получению соответствующего алкена.

Эту активность можно измерить, например, как описано в приложенных примерах, в особенности в примере 8. Одной возможностью является инкубирование соответствующего фосфоноксиалканоата в условиях, которые в принципе предоставляют возможность декарбоксилирования и дефосфорилирования и обнаружение продукции соответствующего алкена, например, путем газовой хроматографии. В предпочтительном варианте осуществления термин "фермент, который обладает активностью превращать указанный 3-фосфоноксиалканоат в указанный алкен" обозначает фермент, который может превращать 3-фосфоноксиизовалерат в изобутен, предпочтительно в условиях, описанных в примере 8. Более предпочтительно такой фермент может катализировать реакцию превращения 3-фосфоноксиалканоата в соответствующий алкен (посредством декарбоксилирования и дефосфорилирования) с К_М 100 мМ или ниже, например, с К_М 75 мМ или ниже, или с К_М 50 мМ или ниже, предпочтительно 10 мМ или ниже или 5 мМ или ниже или 1 мМ или ниже, и более предпочтительно 0,1 мМ или ниже. В особенно предпочтительном варианте осуществления, такой фермент может катализировать реакцию превращения 3-фосфоноксиалканоата в соответствующий алкен, предпочтительно реакцию превращения 3-фосфоноксиизовалерата в изобутен, k_cat по меньшей мере 10^-6 с^-1, предпочтительно k_cat по меньшей мере 10^-4 с^-1, например, k_cat по меньшей мере 10^-3 с^-1 или k_cat по меньшей мере 10^-2 с^-1, как, например, k_cat по меньшей мере 10^-1 с^-1, например k_cat по меньшей мере 0,2 с^-1, предпочтительно k_cat по меньшей мере 0,5 с^-1, особенно предпочтительно k_cat по меньшей мере 1,0 с^-1, более предпочтительно по меньшей мере 2,0 с^-1 и еще более предпочтительно k_cat по меньшей мере 5,0 с^-1.

В особенно предпочтительном варианте осуществления способность превращать 3-фосфоноксиизовалерат в изобутен измеряют в исследовании, как описано в примере 8.

В одном предпочтительном варианте осуществления фермент, указанный в (i) и (ii), выше, представляет собой фермент, который можно найти в NCBI или эквивалентном источнике как имеющий COG3407 домен.

В предпочтительном варианте осуществления способа в соответствии с изобретением первый фермент (i), который обладает активностью превращать 3-гидроксиалканоат в соответствующий 3-фосфоноксиалканоат, выбирают из группы, включающей

(A) белок, содержащий аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:1, или белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 15% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, и проявляет активность превращать 3-гидроксиалканоат в соответствующий 3-фосфоноксиалканоат, которая по меньшей мере такая же высокая, как и соответствующая активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1;

(B) белок, содержащий аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:2, или белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 15% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, и проявляет активность превращать 3-гидроксиалканоат в соответствующий 3-фосфоноксиалканоат, которая по меньшей мере такая же высокая, как и соответствующая активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2;

(C) белок, содержащий аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:3, или белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 15% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и проявляет активность превращать 3-гидроксиалканоат в соответствующий 3-фосфоноксиалканоат, которая по меньшей мере такая же высокая, как и соответствующая активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3; и

(D) белок, содержащий аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:4, или белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 15% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, и проявляет активность превращать 3-гидроксиалканоат в соответствующий 3-фосфоноксиалканоат, которая по меньшей мере такая же высокая, как и соответствующая активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4.

SEQ ID NO:1, представлена аминокислотная последовательность фермента из Picrophilus torridus DSM 9790 (GenBank номер доступа ААТ43941; Swissprot/TrEMBL номер доступа Q6KZB1).

SEQ ID NO:2, представлена аминокислотная последовательность фермента из Thermoplasma acidophilum (GenBank номер доступа САС12426; Swissprot/TrEMBL номер доступа Q9HIN1).

SEQ ID NO:3, представлена аминокислотная последовательность фермента из Thermoplasma volcanium (GenBank номер доступа ВАВ59465; Swissprot/TrEMBL номер доступа Q97BY2).

SEQ ID NO:4, представлена аминокислотная последовательность фермента из Ferroplasma acidarmanus fer1 (GenBank номер доступа ZP_05571615).

В дальнейшем предпочтительном варианте осуществления способа в соответствии с изобретением, второй фермент (ii), который обладает активностью превращать указанный 3-фосфоноксиалканоат в указанный алкен, выбирают из группы, включающей

(a) белок, содержащий аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:5, или белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 15% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:5, и проявляет активность превращать указанный 3-фосфоноксиалканоат в указанный алкен, которая по меньшей мере такая же высокая, как и соответствующая активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5;

(b) белок, содержащий аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:6, или белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 15% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:6, и проявляет активность превращать указанный 3-фосфоноксиалканоат в указанный алкен, которая по меньшей мере такая же высокая, как и соответствующая активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:6;

(c) белок, содержащий аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:7, или белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 15% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:7, и проявляет активность превращать указанный 3-фосфоноксиалканоат в указанный алкен, которая по меньшей мере такая же высокая, как и соответствующая активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:7;

(d) белок, содержащий аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:8, или белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 15% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:8, и проявляет активность превращать указанный 3-фосфоноксиалканоат в указанный алкен, которая по меньшей мере такая же высокая, как и соответствующая активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8;

(e) белок, содержащий аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:9, или белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 15% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:9, и проявляет активность превращать указанный 3-фосфоноксиалканоат в указанный алкен, которая по меньшей мере такая же высокая, как и соответствующая активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9;

(f) белок, содержащий аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:10, или белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 15% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:10, и проявляет активность превращать указанный 3-фосфоноксиалканоат в указанный алкен, которая по меньшей мере такая же высокая, как и соответствующая активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10;

(g) белок, содержащий аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:11, или белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 15% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:11, и проявляет активность превращать указанный 3-фосфоноксиалканоат в указанный алкен, которая по меньшей мере такая же высокая, как и соответствующая активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11;

(h) белок, содержащий аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:12, или белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 15% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:12, и проявляет активность превращать указанный 3-фосфоноксиалканоат в указанный алкен, которая по меньшей мере такая же высокая, как и соответствующая активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:12;

(i) белок, содержащий аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:13, или белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 15% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:13, и проявляет активность превращать указанный 3-фосфоноксиалканоат в указанный алкен, которая по меньшей мере такая же высокая, как и соответствующая активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:13;

(j) белок, содержащий аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:14, или белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 15% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:14, и проявляет активность превращать указанный 3-фосфоноксиалканоат в указанный алкен, которая по меньшей мере такая же высокая, как и соответствующая активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:14; и

(k) белок, содержащий аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:15, или белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 15% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:15, и проявляет активность превращать указанный 3-фосфоноксиалканоат в указанный алкен, которая по меньшей мере такая же высокая, как и соответствующая активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:15.

SEQ ID NO:5, представлена аминокислотная последовательность фермента, клонированного из Streptococcus gordonii. SEQ ID NO:6, представлена аминокислотная последовательность фермента из Streptococcus gordonii str. Challis substr. CH1 (GenBank номер доступа ААТ43941; Swissprot/TrEMBL номер доступа A8UU9). SEQ ID NO:7, представлена аминокислотная последовательность фермента из Streptococcus infantarius subsp infarrtarius ATCC BAA-102 (GenBank номер доступа EDT48420.1; Swissprot/TrEMBL номер доступа B1SCGO). SEQ ID NO:8, представлена аминокислотная последовательность фермента из Homo sapiens (GenBank номер доступа ААС50440.1; Swissprot/TrEMBL номер доступа Р53602.1). SEQ ID NO:9, представлена аминокислотная последовательность фермента из Lactobacilius delbrueckii (GenBank номер доступа САI97800.1; Swissprot/TrEMBL номер доступа Q1GAB2). SEQ ID NO:10, представлена аминокислотная последовательность фермента из Streptococcus mitis (штамм В6) (GenBank номер доступа CBJ22986.1). SEQ ID NO:11, представлена аминокислотная последовательность фермента из Streptococcus gallolyticus UCN34 (GenBank номер доступа СВ113757.1). SEQ ID NO:12, представлена аминокислотная последовательность фермента из Streptococcus sanguinis SK36 (GenBank номер доступа ABN43791.1). SEQ ID NO:13, представлена аминокислотная последовательность фермента из Streptococcus sp.M143 (GenBank номер доступа EFA24040.1). SEQ ID NO:14, представлена аминокислотная последовательность фермента из Streptococcus suis 89/1591 (GenBank номер доступа EEF63672.1). SEQ ID NO:15, представлена аминокислотная последовательность фермента из Streptococcus salivarius SK126 (GenBank номер доступа ЕЕК09252).

В предпочтительном варианте осуществления способа в соответствии с изобретением первый фермент (i) имеет значение, как определено в (А) выше, и второй фермент (ii) имеет значение, как определено в (а) или (b), указанных выше, более предпочтительно второй фермент имеет значение, как определено в (f), (g), (h), (i), (j) или (k), указанных выше. Как проиллюстрировано в примерах, комбинация этих ферментов особенно эффективна для получения алкеновык соединений в соответствии с настоящим изобретением.

В другом предпочтительном варианте осуществления способа в соответствии с изобретением второй фермент (ii), который обладает активностью превращать указанный 3-фосфоноксиалканоат в указанный алкен, выбирают из любого из белков, перечисленных в последующей таблице, или из белка, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 15% идентична аминокислотной последовательности такого белка и проявляет активность превращать указанный 3-фосфоноксиалканоат в указанный алкен, которая по меньшей мере такая же высокая, как и соответствующая активность указанного белк