Фармацевтическая композиция для профилактики и(или) лечения заболеваний вич у людей

Фармацевтическая композиция для профилактики и(или) лечения заболеваний вич у людей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим смесь специфического антигена ВИЧ и непатогенной бактерии. Указанный специфический антиген ВИЧ содержит один или несколько эпитопов из белков Gag и/или Pol и, предпочтительно, находится в крупнодисперсной форме. Указанная бактерия предпочтительно является Lactobacillus plantarum. Эти фармацевтические композиции полезны для профилактики и(или) лечения заболевания ВИЧ у людей.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Спустя более двадцати пяти лет после открытия вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) прогнозы, содержащиеся в программе Всемирной организации здравоохранения и Организации объединенных наций по ВИЧ/СПИД, свидетельствуют о том, что если развитие пандемии будет продолжаться с нынешней скоростью, к 2011 г. будет инфицировано более 30 млн. человек.

Однако, несмотря на существенные усилия в области научных исследований по выявлению эффективных способов терапии для профилактики инфекции ВИЧ, две недавно испытанные профилактические вакцины либо не дали результата (Me Elrath et al., 2008), либо дали скромные результаты (Rerks-Ngarm et al., 2009).

В публикации: Jae-Sung Yu et al. (Clinical and Vaccine Immunology, Nov. 2006, vol 13, No. 11, 1204-1211) описан рекомбинантный вектор для Mycobacterium smegmatis, сконструированный таким образом, чтобы он мог обеспечивать экспрессию консенсусного гена env из ВИЧ-1 группы М - CON6 - в виде либо поверхностного, либо секретируемого белка. Авторы смогли продемонстрировать, что при введении мышам рекомбинантная М. smegmatis была иммуногенна и индуцировала ВИЧ-1-специфические Т-клеточные ответы на слизистых оболочках.

В публикации Ke-Qin Xin et al. (Blood, 1 July 2003, vol 102, No. 1, 223-228) описан рекомбинантный вектор для Lactococcus lactis, обеспечивающий экспрессию петли V2-V4 белка Env из ВИЧ-1 на поверхности ее клетки. Пероральная иммунизация мышей этим вектором вызывала следующие эффекты:

- как мукозный, так и гуморальный иммунные ответы, что было показано путем выявления высоких уровней ВИЧ-специфических IgG в сыворотке и антител IgA в фекалиях; и

- клеточный иммунный ответ, что было показано по повышению количества ВИЧ-специфических клеток, секретирующих IFN-гамма.

Для того чтобы экспрессия на поверхности клеток L. lactis проходила правильно, можно применять сегменты генов размером 1 т.п.н. или менее.

Большинство ученых, участвующих в исследованиях патогенеза с участием ВИЧ и его профилактики, полагают, что перед тем как тестировать профилактические вакцины против ВИЧ или другие биологические композиции для профилактики или лечения ВИЧ-инфекции у человека, было бы полезнее протестировать их аналоги на приматах, отличных от человека (Morgan С, et al., 2008). Из приматов, отличных от человека, выбран макак-резус, а среди макаков, как было убедительно показано, макаки китайского происхождения, инфицированные вирусом иммунодефицита обезьян (SIV) 239, представляют собой самую лучшую модель, воспроизводящую большинство клинических, вирологических и иммунологических особенностей развития ВИЧ-инфекции у человека (Marcondes МС, et al. 2006; Stahl-Hennig С, et al. 2007; Chen S, et al. 2008).

Наконец, в настоящее время научное сообщество пришло к согласию о том, что как только будет открыта эффективная профилактическая биологическая композиция или вакцина против SIV239 для макака, ее, по всей вероятности, можно будет успешно адаптировать для человека с целью защиты его от СПИД.

Несмотря на постоянные исследовательские усилия, прилагаемые научным сообществом, все еще имеется потребность в эффективных стратегиях профилактики и терапии, необходимых для борьбы с всемирной пандемией СПИД.

Было описано, что различные бактерии обладают интересными свойствами адъювантности и иммуномодуляции при введении пациентам. В частности, сообщалось, что молочнокислые бактерии способствуют развитию эффекта толерантности иммунной системы.

Например, в WO 2006/123230, опубликованной 23 ноября 2006 г. от имени Stallergenes S.A., описано применение бактерии, выбранной из Bifidobacteria и молочнокислых бактерий, в качестве адъюванта в иммуногенной композиции, способной индуцировать антиген-специфическую толерантность при сублингвальном, перилингвальном или пероральном введении пациенту. Предполагается, что иммуногенная композиция полезна для лечения аллергии, аутоиммунных заболеваний или для профилактики отторжения трансплантата.

Например, в WO 2009/093900 опубликованной 30 июля 2009 г. от имени организации Stichting Top Institute Food and Nutrition, описана толерогенная композиция, содержащая существенное количество молочнокислых бактерий, находящихся в середине логарифмической фазы роста. Эта композиция при введении пациенту индуцирует не специфическую к антигену иммунологическую толерантность. Предполагается, что композиция будет применяться для профилактики, замедления и/или лечения состояний или заболеваний, связанных с воспалительными ответами, которые могут приводить к повреждению тканей, таких как аллергии, аутоиммунные заболевания и воспалительные заболевания кишечника.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторам изобретения удалось показать, что, неожиданно, исходные фармацевтические композиции, описанные в разделе примеров, индуцировали эффективную антиген-специфическую иммунную защиту против вируса SIV у макаков. Более того, авторы изобретения показали, что при индукции указанной SIV-специфической иммунной защиты она предотвращает репликацию/диссеминацию вируса SIV и последующее возникновение инфекции in vivo.

Действительно, авторы изобретения неожиданно продемонстрировали, что при введении фармацевтической композиции, раскрытой в этом документе, либо на слизистую оболочку, либо внутрикожно или интраэпителиально, репликация вируса была существенно подавлена или даже прекращена или предотвращена.

Фактически, авторы изобретения впервые могли наблюдать, что нецитотоксический CD8+ T-клеточный ответ супрессировал раннюю активацию CD4+ Т-клеток, презентирующих антиген вируса SIV, у макаков. Таким образом, не следуя какой-то определенной теории, фармацевтические композиции по настоящему изобретению индуцируют неожиданный новый тип вирусоспецифической иммунотолерантности при введении пациентам на слизистые, или внутрикожно, или интраэпителиально. Эта иммунотолерантность, по-видимому, является специфической к антигенам ВИЧ - Gag и/или Pol - иммунотолерантностью, индуцируемой супрессорными CD8+ T-клетками (также называемой в этом документе «Ts»-иммунотолерантностью, что означает «Т-супрессорная» иммунотолерантность), которая ограничена МНС («главный комплекс гистосовместимости»)-Ib/Е-и не является цитотоксической.

В свете сообщаемых здесь результатов в настоящем изобретении предлагается новая фармацевтическая композиция, способная обеспечивать достижение «Ts»-иммунотолерантности, как указано выше, для профилактики и/или лечения заболевания ВИЧ человека.

Целью настоящего изобретения является, таким образом, предложение фармацевтической композиции, содержащей смесь антигена и непатогенной живой бактерии, при этом, предпочтительно, указанный антиген является крупнодисперсным и/или содержит один или несколько эпитопов из белков ВИЧ - Gag и/или Pol, и при этом указанная бактерия предпочтительно является Lactobacillus plantarum.

Еще одной целью настоящего изобретения является предложение фармацевтической композиции, описанной выше, для применения в качестве вакцины.

Еще одной целью настоящего изобретения является предложение способа профилактики и/или лечения заболевания ВИЧ у человека, которому это необходимо, включающего по меньшей мере этап введения через слизистые (предпочтительно - перорально), или внутрикожно, или интраэпителиально эффективного количества фармацевтической композиции, упомянутой выше, указанному человеку.

Еще одной целью настоящего изобретения является предложение способа защиты человека от заболевания ВИЧ, включающего по меньшей мере этап введения через слизистые (предпочтительно - перорально), или внутрикожно, или интраэпителиально эффективного количества фармацевтической композиции, упомянутой выше, указанному человеку.

Еще одной целью настоящего изобретения является предложение способа защиты человека от сероконверсии под действием ВИЧ, включающего по меньшей мере этап введения через слизистые (предпочтительно - перорально), или внутрикожно, или интраэпителиально эффективного количества фармацевтической композиции, упомянутой выше, указанному человеку.

И еще одной целью настоящего изобретения является предложение фармацевтического набора для профилактики и/или лечения заболевания ВИЧ у человека, которому это необходимо, включающего:

- в первом контейнере - антиген; и

- во втором контейнере - непатогенную бактерию,

при этом указанный антиген и указанная бактерия находятся в фармацевтически приемлемых носителях для введения через слизистые, или внутрикожно, или интраэпителиально, при этом, предпочтительно, указанный антиген является крупнодисперсным и/или содержит один или несколько эпитопов из белков ВИЧ - Gag и/или Pol, и при этом указанная бактерия предпочтительно является Lactobacillus plantarum.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими фигурами, на которые сделаны ссылки в неограничивающих примерах, приведенных ниже.

Фиг.1. Внутривенная (в/в) провокационная проба SIVmac239 макакам-резус, после предварительного интравагинального введения iSIV/BCG (БЦЖ).

Фиг.2. Интраректальная (и/р) провокационная проба SIVmac239 макакам-резус, после предварительного интравагинального введения iSIV/BCG (БЦЖ).

Фиг.3. Повторные провокационные пробы SIVmac239 (3 раза в/в и 2 раза и/р) макакам-резус, после предварительного интравагинального введения iSIV/BCG (БЦЖ).

Фиг.4. Внутривенная провокационная проба SIVmac239 макакам-резус, после предварительного интравагинального введения iSIV/BCG (БЦЖ) и внутрикожной бустер-инъекции.

Фиг.5. Интраректальная провокационная проба SIVmac239 макакам-резус, после предварительного интравагинального введения iSIV/BCG (БЦЖ) и внутрикожной бустер-инъекции..

Фиг.6. Интраректальная провокационная проба SIVmac239 макакам-резус, после предварительного перорального введения iSIV/BCG (БЦЖ).

Фиг.7. Антивирусная активность in vitro CD8+ Т-клеток, полученных от макак-резусов после предварительного интравагинального введения iSIV/BCG.

Фиг.8. Антивирусная активность in vitro CD8+ Т-клеток, полученных от 4 макак-резусов после предварительного перорального введения iSIV/BCG.

Фиг.9. SIV-специфическая супрессия активации CD4+ Т-клеток аутологичными CD8+ Т-клетками, полученными от 4 макаков-резусов после предварительного перорального введения iSIV/BCG.

Фиг.10а. Титры антител IgG против SIV в пробах плазмы, взятых у макаков-резусов, которым предварительно вводили iSIV/LP, iSIV или LP.

Фиг.10b. Пролиферация SIV-специфических Т-клеток в пробах МКПК (мононуклеарных клеток периферической крови), взятых у макаков-резусов, которым предварительно вводили iSIV/LP, iSIV или LP.

Фиг.10c. SIV-специфические Т-клетки, секретирующие IFN-гамма при стимуляции in vitro в присутствии или в отсутствие CD8 или CD25 Т-клеток.

Фиг.10d. SIV-специфическая супрессия активации CD4+ Т-клеток аутологичными CD8+ Т-клетками, полученными от 8 макаков-резусов, которым предварительно перорально вводили iSIV/LP, в сравнении с животными, которым предварительно перорально вводили LP (n=4) или iSIV (n=3).

Фиг.10е. SIV-специфические CD8+ Т-клетки через 60 дней после внутрижелудочного введения препарата iSIV/LP: цитотоксичность АТ-2 SIV-стимулированных CD4+ Т-клеток в присутствии CD8+ Т-клеток или клеток K562 в присутствии натуральных киллерных клеток человека (hNK) (в качестве контролей), со стимуляцией SEB и антителами против CD3/CD28 или без такой стимуляции.

Фиг.11a. Антивирусная активность in vitro (в CD4 клетках) аутологичных CD8+ Т-клеток, полученных от 8 макаков-резусов, которым предварительно перорально вводили iSIV/LP, в сравнении с животными, которым предварительно перорально вводили LP (n=4) или iSIV (n=3).

Фиг.11b. Антивирусная активность in vitro (в CD4 клетках) гетерологичных или аллогенных CD8+ Т-клеток, полученных от 4 из 8 макаков-резусов через 80 дней после перорального введения iSIV/LP.

Фиг.11c-g. Активность CD8+ Т-клеток против SIV через 60 дней после пероральной иммунизации в системе клеточной культуры с замедленной пролиферацией (с), культивируемой на вставках (insert) (d), аллогенной (е), в присутствии антител против MHC-Ia/ABC или антител против MHC-Ib/E (f), и в CD8+ Т-клетках, обедненных TCRγδ+ или Vβ8+ подгруппы (g).

Фиг.12а. Уровни вирусной нагрузки плазмы (количество копий SIV РНК на мл плазмы) после интраректальной и внутривенной провокационной пробы SIVmac239, проведенной макакам-резусам, которым предварительно перорально вводили iSIV/LP, в сравнении с животными, которым предварительно перорально вводили LP или iSIV.

Фиг.12b. Уровни вирусной нагрузки клеток (количество копий SIV ДНК на миллион мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК)) после интраректальной и внутривенной провокационной пробы SIVmac239, проведенной макакам-резусам, которым предварительно перорально вводили iSIV/LP, в сравнении с животными, которым предварительно перорально вводили LP или iSIV.

Фиг.13. Истощение CD8+ Т-клеток периферической крови и лимфатических узлов у 8 предварительно обработанных iSIV/LP макаков путем инфузии антитела против CD8 - сМТ807. а. Количество CD8+ Т-клеток периферической крови до и после введения трех инъекций сМТ807; b. % от CD8+ Т-клеток лимфатических узлов до и после введения трех инъекций сМТ807; с. Вирусная нагрузка плазмы до и после введения трех инъекций сМТ807; d. Нагрузка SIV ДНК в клетках МКПК до и после введения трех инъекций сМТ807; е. Нагрузка SIV ДНК в лимфатических узлах до и после введения трех инъекций сМТ807.

Фиг.14. Вирусная нагрузка плазмы (а) и клеток МКПК (b) после третьей интраректальной провокационной пробы, введенной интраректально с применением SIVB670 восьми макакам-резусам, иммунизированным пероральным препаратом, приготовленным из iSIV и LP, и у 2 дополнительных неиммунизированных обезьян.

Фиг.15. Антивирусная активность in vitro и in vivo, опосредованная CD8+ Т-клетками, после внутрижелудочной иммунизации с применением iSIV и LP (иммунизация iSIV/LP №2). а. Активность против SIV (кратность супрессии вируса) CD8+ Т-клеток во время 60-420 дней после иммунизации у 8 макаков-резусов, которым будет проведена интраректальная провокационная проба; b и с. Вирусная нагрузка плазмы и клеток после интраректальной провокационной пробы SIVmac239, проведенной 8 макакам-резусам, иммунизированным с применением перорального препарата iSIV/LP, и у 8 контрольных обезьян, которым вводили только LP (n=4) или только iSIV (n=4).

Фиг.16. Нагрузка SIV ДНК и РНК в интраэпителиальных лимфоцитах слизистой оболочки прямой кишки (IPL) (a-b), клетках базальной мембраны (LPC) (c-d) и в тазовых лимфоузлах (PLN) (е) после интраэпителиальной провокационной пробы SIVmac239, введенной 8 макакам (иммунизация iSIV/LP №2).

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей смесь антигена и непатогенной живой бактерии.

Антиген

Из-за высокой вариабельности генома ВИЧ, вызванной мутациями, рекомбинацией, вставками и/или делециями, классификацию ВИЧ подразделяют на группы, подгруппы, типы, подтипы и генотипы. Существует две основные группы ВИЧ (ВИЧ-1 и ВИЧ-2) и множество подгрупп, потому что геном ВИЧ постоянно мутирует. Основное различие между группами и подгруппами связано с оболочкой вируса. ВИЧ-1 классифицирую на основную подгруппу (М), при этом указанная подгруппа М разделяется на девять подтипов (кладов или подтипов), обозначаемых буквами с А по J (Hu et al., JAMA 275:210-216, 1996; Korber et al., Science 280:1868-1871, 1998), и на 10-ую резко отличную подгруппу (О). Также существует множество других подгрупп, возникающих в результате рекомбинаций in vivo предшествующих подгрупп (Papathanasopoulos MA, et al. Virus Genes 2003, 26:151-163). Предпочтительно, вирус ВИЧ является ВИЧ-1 или ВИЧ-2, включая все известные и еще не известные их клады. Еще более предпочтительно, он является ВИЧ-1.

В контексте настоящего изобретения «антиген» имеет происхождение от ВИЧ, что означает, что он относится к специфичной группе, подгруппе, типу, подтипу ВИЧ или к комбинации нескольких подтипов. Предпочтительно, указанный антиген ВИЧ является антигеном ВИЧ-1 или ВИЧ-2.

Указанный антиген не является инфекционным.

Долгое время научное сообщество подозревало, что активация CD4+ Т-клеток, основной мишени как для ВИЧ-1, так и для SIV, непосредственно участвует в репликации вирусов (Andrieu and Lu, 1995; Korin and Zack, 1999). Однако только недавно эта связь между активацией CD4+ Т-клеток и последующими этапами инфекционного процесса SIV или ВИЧ была выявлена. В покоящихся CD4+ Т-клетках вслед за проникновением вируса в течение 2 ч после входа происходила презентация на плазматической мембране эпитопов, происходящих от белков Gag и Pol входящих вирионов, тогда как для белков Env и Nef был необходим синтез de novo (Sacha et al., 2007). Однако следующие далее фазы инфекционного процесса, т.е., обратная транскрипция с последующей интеграцией вируса, в покоящихся клетках развивались очень неэффективно (Vatakis et al., 2009a and 2009b). В противоположность этому, если CD4+ T-клетки были активированы перед или в течение 48 ч после презентации эпитопов белков Gag и Pol на плазматической мембране, обратная транскрипция ВИЧ/SIV и интеграция его ДНК проходили крайне активно, что позволяло достичь очень высокого уровня репликации вируса и его высвобождения (Vatakis et al., 2009a and 2009b).

Следовательно, авторы изобретения постулируют, что специфическая блокировка in vivo этого раннего развития специфической, опосредуемой белками ВИЧ/SIV Gag или Pol, активации CD4+ Т-клеток после экспозиции ВИЧ/SIV приведет к предотвращению активной репликации вируса.

С учетом этого и с целью индуцировать супрессию активации CD4+ Т-клеток, презентирующих антигены белков ВИЧ - Gag и/или Pol, и, в свою очередь предотвратить репликацию и диссеминацию ВИЧ in vivo у людей, подвергшихся воздействию вируса, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит антиген ВИЧ, который предпочтительно имеет один или несколько эпитопов из белков ВИЧ - Gag и/или Pol. Такой антиген предпочтительно либо содержит белки ВИЧ - Gag и/или Pol, либо происходит от них.

Таким образом, термины «антиген, который содержит белки ВИЧ - Gag и/или Pol - или происходит от них» обозначают антиген ВИЧ:

- который содержит по меньшей мере Gag и/или Pol (и является «антигеном, который содержит белки Gag и/или Pol»); или

- который содержит один или несколько белков, кодируемых геном GAG, таких как белок капсида (p24) и белок матрикса (p17), и/или один или несколько белков, кодируемых геном POL, таких как интеграза, обратная транскриптаза и протеаза (и является «антигеном, который происходит от белков Gag и/или Pol»); или

- который содержит один или несколько эпитопов из этих белков (и тоже и является «антигеном, который происходит от белков Gag и/или Pol»).

В частности, любые другие вирусные белки или их эпитопы, выбранные из группы, состоящей из ENV, VIF, VPR, VPU для ВИЧ-1, VPX для ВИЧ-2, REV, NEF, TAT и т.п., не являются существенными компонентами антигена, содержащегося в фармацевтической композиции, раскрытой в этом документе. Любой из этих белков, если он присутствует, является всего лишь необязательным компонентом антигена, который будет применяться в фармацевтической композиции, раскрытой в этом документе.

Антиген предпочтительно является крупнодисперсным антигеном. Это означает, что он предпочтительно выбран из вирусных частиц, рекомбинантных вирусных частиц, вирусоподобных частиц, экспрессирующих Gag и/или Pol рекомбинантных бактерий или грибов, полимерных микрочастиц, презентирующих на своей поверхности один или несколько вирусных белков или пептидов или эпитопов (содержащих белки ВИЧ - Gag и/или Pol или происходящих от них). Предпочтительно, один или несколько эпитопов из Gag и/или Pol продуцируются или экспрессируются указанным антигеном или содержатся в нем. Когда применяют рекомбинантные вирусные частицы или вирусные частицы или экспрессирующие Gag и/или Pol рекомбинантные бактерии или грибы, они предпочтительно являются инактивированными микроорганизмами.

Антиген может являться вирусной частицей, рекомбинантной вирусной частицей, вирусоподобной частицей или экспрессирующими Gag и/или Pol рекомбинантными бактериями или грибами. Он также может являться одним или несколькими вирусными белками или пептидами (содержащими белки ВИЧ - Gag и/или Pol - или происходящими от них), рекомбинантными или нет, как в форме конъюгатов, так и в форме конкатемеров. Дополнительно, антиген не зависит от нуклеиновых кислот, то есть не зависит от вирусной ДНК или вирусной РНК.

Антиген может быть получен в результате экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты вируса, предпочтительно, содержащейся в соответствующем рекомбинантном микроорганизме.

Если антиген, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, является экспрессирующей Gag и/или Pol рекомбинантной бактерией, то указанная рекомбинантная бактерия предпочтительно отличается от непатогенной живой бактерии, которая также присутствует в композиции.

Когда антиген в фармацевтической композиции по настоящему изобретению является одним или несколькими вирусными белками или пептидами (содержащими белки ВИЧ - Gag и/или Pol - или происходящими от них) он, предпочтительно, находится в крупнодисперсной форме. Фактически, соответствующие крупнодисперсные антигены могут продуцироваться живыми микроорганизмами, такими как дрожжи, таким же способом, что и вакцины против вируса гепатита В, полученные с применением технологий рекомбинантных ДНК, где экспрессируемый полипептид HBsAg в результате самосборки образует иммуногенные сферические частицы, сильно напоминающие природные частицы размером 22 нм, которые обнаруживаются в сыворотке пациентов с хронической инфекцией HBV (Plotkin et al., 2008).

В соответствии с другим вариантом, когда антиген в фармацевтической композиции по настоящему изобретению является одним или несколькими вирусными белками или пептидами (содержащими белки ВИЧ - Gag и/или Pol - или происходящими от них) он, предпочтительно, находится в форме конъюгатов. В таком варианте воплощения, как это хорошо известны специалистам в данной области, целевые белки или пептиды ковалентно конъюгированы с соответствующим носителем. Стандартными носителями, которые доступны для приобретения, являются, среди прочего, белки, такие как белок KLH (гемоцианин фиссуреллы), белок БСА (бычий сывороточный альбумин), белок OVA (овальбумин) и т.п. (которые, предпочтительно, могут быть безопасно введены человеку перорально). Способы получения соответствующих конъюгатов известны специалистам в данной области.

В соответствии с еще одним вариантом, когда антиген в фармацевтической композиции по настоящему изобретению является одним или несколькими вирусными белками или пептидами (содержащими белки ВИЧ - Gag и/или Pol - или происходящими от них) он, предпочтительно, находится в форме конкатемеров. Как хорошо известно специалистам в данной области, конкатемеры состоят из множества копий целевых белков или пептидов, которые физически соединены друг с другом в одну макромолекулу. В конкатемерах копия целевого белка или пептида может быть соединена с еще одной копией либо напрямую, либо через разделяющий их синтетический спейсер. Таким образом, конкатемер содержит по меньшей мере две копии, предпочтительно - до 10 копий или более целевого белка или пептида. Способы получения соответствующих конкатемеров известны специалистам в данной области.

При использовании в этом документе, термин «вирусоподобная частица» (VLP) означает частицу, которая очень похожа на зрелые вирионы, но не содержит вирусный геномный материал указанного вируса. Более конкретно, VLP, которые также называют псевдо-вирионами, представляют собой субъединичные структуры, состоящие из множества копий белков вирусного капсида и/или других вирусных белков. Эти вирусные белки способны путем самосборки образовывать VLP с заданной сферической симметрией in vivo. Эти VLP не содержат каких-либо молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих вирусные белки, и, более конкретно, не содержат каких-либо молекул нуклеиновой кислоты. Следовательно, VLP не способны к репликации и неинфекционны по своей природе, что делает их безопасными для введения в форме фармацевтической композиции. Способы получения частиц VLP хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Liew et al., 2010; Plummer and Manchester, 2010). Неограничивающие примеры пригодных способов получения частиц VLP описаны в US 5919458, EP 386882, WO 91/07425, US 5861282 и WO 91/05864, где раскрыты частицы VLP ВИЧ (псевдо-вирионы), которые не содержат генома ВИЧ и вообще не содержат молекул нуклеиновой кислоты.

При использовании в этом документе термин «рекомбинантная вирусная частица» означает вирусную частицу, которая содержит или которая экспонирует на своей поверхности белки из различных вирусов. Кроме того, рекомбинантная вирусная частица также может означать бактерию или другую клетку-хозяина, которая содержит, которая продуцирует или которая экспонирует на своей поверхности один или несколько вирусных белков или пептидов или эпитопов, содержащих белки ВИЧ - Gag и/или Pol - или происходящих от них.

Фактически, большинство рекомбинантных вирусных частиц представляют собой вирусные частицы, в которых часть исходных структурных белков (т.е., в основном белки оболочки и белки кора) замещены аналогичными белками из другого вируса. В качестве примера, может быть произведен обмен белков оболочки. В таком случае рекомбинантные вирусные частицы содержат «химерный» геном, представляющий собой геном вируса, в котором последовательность, кодирующая белки оболочки, заменена последовательностью, кодирующей белки оболочки другого вируса. Большинство рекомбинантных вирусных частиц способны к репликации и являются инфекционными.

При использовании в этом документе рекомбинантный вирус, содержащий белки из другого вируса, означает, что рекомбинантная вирусная частица содержит один или несколько вирусных белков или пептидов или эпитопов, содержащих белки ВИЧ - Gag и/или Pol - или происходящие от них, которые либо находятся внутри, либо экспонированы на их поверхности. Неограничивающие примеры способов получения рекомбинантных вирусных частиц описаны для следующих объектов.

* Альфа-вирус: в WO 02/053757, где описан рекомбинантный альфа-вирус, экспрессирующий белок ВИЧ (белок ENV).

* Ретровирус: в ЕР 1499736, в котором раскрыты лентивирусные векторы, экспрессирующие химерные гликопротеины.

* Аденовирусы (например, типов 5, 7 или 35): в US 2007/077257, US 2007/054395, JP 2007037402, WO 2006/120034, US 2004/253210, US 2004/170647, US 2005/070017, US 2003/228329, US 2004/101957, US 2003/219458, US 2004/009936, US 2004/028652, WO 03/050238, WO 03/038057, WO 03/020893, WO 02/31168, WO 02/22080, WO 01/02607 и US6716823, в которых раскрыты рекомбинантные аденовирусы, экспрессирующие белки ВИЧ.

* Поксвирус (канарипокс, вирус коровьей оспы, вирус коровьей оспы Анкара и вирус оспы кур): в US 5766598, ЕР 0592546, US 2007/048861, US 2006/188961, US 2006/134133, ЕР 1789438, WO 2005/017208, WO 2004/035006, US 2004/146528, JP 2003321391, ЕР 1378516, WO 95/07099, JP 7170982, DE 4141741, ЕР 0449116, JP 1148183, JP 1085072, ЕР 0592546, ЕР 0243029, US 2005/287162, JP 2004105187, JP 2004089185, WO 03/095656, ЕР 0592546, WO 96/40880, US 6,136,318, US 5,670,367, в которых раскрыты рекомбинантные поксвирусы, экспрессирующие вирусные белки, в том числе белки ВИЧ.

* Бактерии, которые содержат, которые продуцируют или которые экспонируют на своей поверхности по меньшей мере один белок вируса: в US 7189402 и WO 96/11708, в которых раскрыты Salmonella или Е.coli, экспрессирующие гликопротеины ВИЧ (т.е., белки оболочки).

Предпочтительно, рекомбинантная вирусная частица соответствует поксвирусу, при этом поксвирус предпочтительно выбран из группы, содержащей канарипокс (например, вирусные векторов ALVAC, такие как раскрытый в патентах US 5766598 и ЕР 0592546), вирус коровьей оспы (например, вирус коровьей оспы, раскрытый в международной публикации патента WO 95/07099), вирус коровьей оспы Анкара (например, вирусные векторы NYVAC, такие как описанный в заявке на патент ЕР 1789438) и, вирус оспы кур (например, вирусные векторы TROVAC, такие как раскрыт в международной заявке на патент WO 03/095656).

Более предпочтительно, указанный поксвирус является канарипокс вирусом. В качестве примера рекомбинантной вирусной частицы, соответствующей канарипокс вирусу и экспрессирующей пептид/белок ВИЧ, можно дать ссылку на вирусные векторы ALVAC, раскрытые в патенте US 5766598 (содержание которого включено сюда начиная с колонки 6, строки 18 и до колонки 82, строки 36), при этом векторы ALVAC экспрессируют, например, белок gp120 из ВИЧ-1, gp160 из ВИЧ-1, нерасщепляемую секретируемую форму env из ВИЧ-1, gp120 из ВИЧ-1, заякоренный с помощью трансмембранной последовательности, gag/pol из ВИЧ-1, gag/pol и env (gp120) из ВИЧ-1, gag/pol и env (gp160) из ВИЧ-1 и gag/pol и env (gp120 с трансмембранной заякоривающей последовательностью) из ВИЧ-1. Предпочтительно, указанный вектор ALVAC экспрессирует gag/pol и env (gp120) из ВИЧ-1, и наиболее предпочтительно - указанный вектор ALVAC является вектором ALVAC VCP1521.

«Вирусная частица» предпочтительно представляет собой частицу SIV или ВИЧ, такую как вирусная частица SIV или ВИЧ, которая может содержать мутированный вирусный геном (например, путем внесения мутации, замены или вставки в нуклеиновую кислоту), что приводит к выработке неинфекционных вирусных частиц.

Вирусные частицы, содержащие мутированный вирусный геном, раскрыты в US 7229625, US 6121021, US 6923970, US 6544527, US 6451322 и US 6080408.

Предпочтительно, и для того, чтобы получить вирусные частицы или рекомбинантные вирусные частицы, которые можно безопасно вводить человеку, указанные вирусные частицы или рекомбинантные вирусные частицы перед введением инактивируют. Такая инактивация может быть необходима для рекомбинантных вирусных частиц, даже для тех из них, которые не способны к репликации.

При использовании в этом документе «инактивированная вирусная частица» (причем указанная вирусная частица может быть как рекомбинантной, так и не быть рекомбинантной) означает вирусную частицу, которая больше не является инфекционной и, предпочтительно, больше не способна к репликации.

Способы инактивации вирусных частиц или рекомбинантных вирусных частиц хорошо известны специалистам в данной области. Неограничивающие примеры инактивации вирусов включают химическую инактивацию, например, обработкой с помощью формалина, хлорамина таурина, формальдегида, параформальдегида, пропиолактена, бета-пропиолактона (REMUNE) или алдритиола-2 (aldrithiol-2, АТ-2, см. US 6001155), термическую инактивацию, физическую инактивацию, например, с помощью УФ- или гамма-облучения или обработки микроволновым излучением, и их сочетания. Информацию по инактивации ВИЧ см. в публикации: RAVIV et al. (J. Virol., vol.79(19), р: 12394-12400, 2005).

В соответствии с одним из вариантов воплощения указанная инактивация является химической инактивацией, выбранной из группы, состоящей из инактивации помощью формалина, хлорамина таурина, формальдегида, параформальдегида, пропиолактена, бета-пропиолактона (REMUNE) или алдритиола-2.

В соответствии с другим вариантом или дополнительно, указанная инактивация является термической инактивацией. Такая инактивация хорошо известна специалистам в данной области и, в качестве примера такого способа, можно дать ссылку на способ, раскрытый в разделе примеров. Действительно, авторы изобретения неожиданно установили, что у макаков химически (т.е. с помощью АТ-2) и/или термически инактивированный вирус индуцирует защитную иммунотолерантность при введении вместе с непатогенной живой бактерией.

Предпочтительно, для целей введения людям, вирусные частицы инактивируют по меньшей мере дважды, в типичном случае с применением по меньшей мере двух способов инактивации, упомянутых выше.

Предпочтительно, как указано выше, вирусные частицы (рекомбинантные или нет, VLP или нет), которые применяют в качестве антигенов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению, не зависят от нуклеиновой кислоты (т.е., ДНК или РНК), что означает, что вирусные частицы не содержат какой-либо вирусной ДНК или РНК или, если они содержат ДНК или РНК, она не играет роли в иммуногенности.

В соответствии с другим вариантом, полимерные микрочастицы (в форме микрокапсул, микросфер и т.п.) с различными структурами и презентирующие на своей поверхности один или несколько вирусных белков или пептидов или эпитопов, содержащих белки ВИЧ - Gag и/или Pol - или происходящих от них, могут применяться в качестве антигенов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению. Такие микрочастицы могут быть изготовлены из соответствующих биологических или химических полимеров, таких как метакрилированный декстран, метакрилированный полиэтиленгликоль и/или желатин, на которые можно прикрепить вирус ВИЧ или вирусные белки или пептиды или эпитопы, содержащие белки ВИЧ - Gag и/или Pol - или происходящие от них. Примеры таких полимерных микрочастиц можно найти в литературных источниках (например, см. публикации: Wei Li Lee et al. (2010), Sandri et al. (2007), Goldberg et al. (2003), Delie F. (1998), Ponchel et al. (1998), Mathiowitz et al. (1997), Fasano et al. (1997), Chickering et al. (1997)).

В предпочтительном варианте воплощения антиген в фармацевтической композиции ВИЧ-1 по настоящему изобретению является одной или несколькими вирусными частицами, способными экспрессировать один или несколько вирусных белков или пептидов или эпитопов, содержащих белки ВИЧ - Gag и/или Pol - или происходящих от них. В соответствии с другим вариантом воплощения антиген в фармацевтической композиции ВИЧ-1 по настоящему изобретению является одной или несколькими полимерными микрочастицами, презентирующими на своей поверхности один или несколько вирусных белков или пептидов или эпитопов, содержащих белки ВИЧ - Gag и/или Pol - или происходящих от них.

Предпочтительно, антиген, который будет применяться в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, имеет размер не менее чем примерно 110 кДа. Предпочтительно, он имеет размер по меньшей мере примерно 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 кДа или даже больше.

Эффективное количество вирусного антигена, которое будет применяться в контексте изобретения, может легко определить специалист в данной области, применяя общеизвестные знания и с учетом примеров, раскрытых в этом документе далее, в связи с вирусами SIV и ВИЧ.

В качестве примера, когда указанный антиген является крупнодисперсным антигеном и, в частности, вирусной частицей, количество вирусных частиц составляет от примерно 10⁶ до примерно 10¹² на миллилитр указанной смеси.

Непатогенная бактерия

Как показали авторы изобретения в случае вируса SIV у макаков, при введении через слизистые, или внутрикожным, или интраэпителиальным путем вместе с соответствующим антигеном, указанным выше, непатогенная живая бактерия в составе фармацевтической композиции способна индуцировать и, предпочтительно, поддерживать состояние иммунотолерантности к вышеуказанному антигену. У человека это дает возможность предотвращать и/или лечить заболевание ВИЧ.

Указанная бактерия может, таким образом, рассматриваться как состоящий из частиц адъювант, который может обозначаться в этом документе как «толерогенный адъювант» или «толерогенный носитель» или «носитель толерантности» или «носитель толеризации», при этом данные термины являются синонимичными.

Предпочтительно, все эти эквивалентные термины означают непатогенную живую бактерию, которую применяют в сочетании с антигеном ВИЧ, указанным выше, для достижения специфической иммунной защиты (предпочтительно, иммунотолерантности) к антигену, тем самым предотвращая и/или обеспечивая лечение заболевания ВИЧ у человека.

Более предпочтительно, «толерогенный носитель» - это непатогенная живая бактерия, которую вводят в смеси с антигеном ВИЧ, указанным выше, с целью достижения одного или нескольких, предпочтительно - 2 или нескольких, еще более предпочтительно - 3 или нескольких из следующих иммунопротекторных эффектов:

1) «Толерогенный носитель» не индуцирует существенный уровень выработки системных антител, специфичных к антигену ВИЧ.

В частности, не наблюдается существенного уровня выработки системных антител против ВИЧ классов IgM и/или IgG. Например, не наблюдается существенного уровня системного гуморального ответа, то есть, либо отсутствует специфический детектируемый системный гуморальный иммунный ответ, который можно определить с применением классических клинических лабораторных способов, таких как анализ ELISA, либо, в случае, если детектируются системные антитела, они не могут служить защитой от инфекции вируса ВИЧ.

2) «Толерогенный носитель