Применение активных ингредиентов для борьбы с нематодами у сельскохозяйственных культур, резистентных к нематодам

Применение активных ингредиентов для борьбы с нематодами у сельскохозяйственных культур, резистентных к нематодам

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится в целом к применению N-{[3-хлор-5-(трифторметил)-2-пиридинил]-этил}-2,6-дихлорбензамида (флуопирама) для борьбы с нематодами у сельскохозяйственных культур, резистентных к нематодам, и способам, особенно применимым для борьбы с нематодами и/или увеличения урожайности у этих культур.

Описание современной технологии

Флуопирам определяют как соединение формулы (I)

а также N-оксиды его соединения.

Флуопирам представляет собой фунгицид широкого спектра действия с проникающими и трансламинарными свойствами для применений, связанных с листвой, капельным орошением, смачиванием и обработкой семян в широком диапазоне различных сельскохозяйственных культур, против многих экономически важных заболеваний растений. Он является очень эффективным при профилактических применениях против вида настоящей мучнистой росы, видов серой плесени и белой плесени. Он имеет эффективность действия против многих других заболеваний растений. Флуопирам показал активность в тестах на прорастание спор, удлинение зародышевой трубочки и проверка на задержку роста мицелия. На биохимическом уровне, флуопирам ингибирует митохондриальное дыхание посредством блокирования электронного транспорта в дыхательной цепи сукцинатдегидрогеназы (комплекс II - ингибитор СДГ).

Флуопирам и процесс его производства, начинающийся из известных и доступных на рынке соединений, описан в EP-A-1389614 и WO 2004/016088.

Общее описание нематоцидной активности производных пиридилэтилбензамида найдена в WO-A 2008/126922.

Нематоды представляют собой крошечных, червеобразных, многоклеточных животных приспособленных к проживанию в воде. Число видов нематод оценивают в полмиллиона. Важная часть фауны почвы, нематоды живут в лабиринте взаимосвязанных каналов, называемых порами, которые образуются под действием почвенных процессов. Они двигаются в пленках воды, которые плотно облегают частицы почвы. Паразитирующие на растениях нематоды, большинство которых являются корнеедами, обнаружены в ассоциации с большинством растений. Некоторые являются эндопаразитическими, проживая и питаясь внутри ткани корней, клубней, бутонов, семян, и т.д. Другие являются эктопаразитическими, питаясь внешним образом через стенки растений. Единственная эндопаразитическая нематода может уничтожить растение или снизить его продуктивность. Эндопаразитические корнееды включают таких экономически важных вредителей, как яванская галловая нематода (Meloidogyne species), почковидные нематоды (Rotylenchulus species), цистообразующие нематоды (Heterodera species) и повреждающие корень нематоды (Pratylenchus species). Непосредственное поедание нематодами может коренным образом снизить поглощение растением питательных компонентов и воды. Нематоды обладают огромным воздействием на продуктивность культуры, когда они нападают на корни рассады сразу же после прорастания семян. Поедание нематодами также создает открытые раны, которые обеспечивают вход широкому разнообразию патогенных для растений грибков и бактерий. Эти микробные инфекции часто являются более повреждающими в экономическом отношении, чем непосредственные эффекты от поедания нематодами.

В целом, резистентность к нематодам характеризуется смертью клеток растения-хозяина на участке питания паразитирующей нематоды или поблизости от него. Конкретные гены резистентности и взаимодействие с нематодами влияют на временные характеристики и локализацию резистентного ответа. Williamson et al. (Trends in Genetics, Vol.22, No.7, July 2006) описывает природу и механизмы взаимодействия растение - нематода по отношению к резистентности в растениях.

Растения, резистентные к нематодам, могут относиться к трем основным подходам, являющимися мишенями у нематод, граница между нематодой и культурой и ответ растения. Антифидинг или нематоцидные белки, дестабилизация эссенциальной генной экспрессии нематод посредством РНК-интерференции, дестабилизация сенсорной функции посредством РНК-интерференции, пептиды или растительные тельца или нематоцидные метаболиты являются примерами мишеней у нематод; дестабилизация факторов патогенности нематод, касающихся миграции и инвазии или касающихся индукции участка питания и поддержания посредством РНК-интерференции, пептиды или растительные тельца, малозаметные или невосприимчивые растения; или превращение растений-хозяев в растения-нехозяева представляют собой примеры взаимодействий на границе раздела нематода-культура, во время активации гена резистентности растения или гиперчувствительного ответа посредством инвазии нематодами; индуцированная гибель клеток или другая несовместимость на участке под действием сайт-специфичных промоторов или конверсия культур в сторону толерантности представляют собой примеры ответа растения.

Несмотря на то, что растения, резистентные к нематодам, описаны как резистентные по отношению к конкретным нематодам, все еще существуют некоторые взаимодействия между нематодой и культурой, которые, вследствие различных защитных реакций растения, могут приводить к частично поврежденному растению. Одним примером этих защитных реакций является гиперчувствительный ответ. Одно последствие может приводить в результате к поврежденным корням и потере жизненности подвергшихся воздействию растений.

Принятая в настоящее время борьба с нематодами сфокусирована по существу на предотвращении нападения нематод на растение. Как только растение паразитируется, становится практически невозможным уничтожить нематоды без разрушения также и растения. Следовательно, было бы благоприятным предоставить улучшенные соединения для борьбы с нематодами и способы обработки растений, резистентных к нематодам, для предотвращения или снижения повреждения от нематод.

Большая часть повреждений у культурных растений, которые вызывают вредители, происходит еще тогда, когда семя подвергается нападению во время хранения и после внесения семени в почву, во время и сразу же после прорастания растений. Эта фаза является особенно критической, так как корни и побеги растущего растения являются особенно чувствительными и даже небольшое повреждение может привести к смерти целого растения. Таким образом, является желательным разработать способы защиты семени и прорастающего растения, которые обходятся без дополнительного применения средств защиты культур после посева или после появления всходов растений. Кроме того является желательным оптимизировать количество используемого активного соединения таким образом, чтобы предоставить максимальную защиту для семени и прорастающего растения от нападения вредителей, но без повреждения самого растения используемым активным соединением. В частности, в способах обработки семян следует принимать во внимание характерные инсектицидные свойства трансгенных растений, чтобы достичь оптимальной защиты семени и также прорастающего растения с использованием минимума средств защиты сельскохозяйственных культур.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение сейчас предоставляет выгодные применения флуопирама для борьбы с нематодами, заражающими сельскохозяйственные культуры, резистентные к нематодам, и/или увеличения урожайности.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к применению композиций, содержащих флуопирам для борьбы с нематодами, заражающими сельскохозяйственные культуры, резистентные к нематодам, и/или увеличения урожайности.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к применению композиций, содержащих

A) флуопирам и

B) по меньшей мере одно агрохимически активное соединение, для борьбы с нематодами, заражающими сельскохозяйственные культуры, резистентные к нематодам, и/или увеличения урожайности.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к применению композиций, содержащих

A) флуопирам и

B) по меньшей мере одно агрохимически активное соединение, для борьбы с нематодами, заражающими сельскохозяйственные культуры, резистентные к насекомым.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение также относится к применению композиций, содержащих

A) флуопирам и

B) средство биологической борьбы Bacillus firmus штамм CNCM I-1582, в частности, споры (патент США №6,406,690) для борьбы с нематодами, заражающими сельскохозяйственные культуры, резистентные к нематодам, и/или увеличения урожайности.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение также относится к применению композиций, содержащих

A) флуопирам и

B) средство биологической борьбы Bacillus firmus штамм CNCM I-1582, в частности споры (патент США №6,406,690) для борьбы с нематодами заражающими сельскохозяйственные культуры, резистентные к насекомым.

Иллюстративный способ по изобретению включает в себя внесение флуопирама по изобретению либо в почву или нанесение его на растение (например, семена или на листву) для борьбы с повреждением от нематод и/или увеличения урожайности.

Настоящее изобретение направлено на композиции и способы для регуляции резистентности к вредителям или толерантности у растений или растительных клеток. Под "резистентностью" подразумевают, что вредитель (например, насекомое или нематода) уничтожается при поедании или другом контакте с растением или его частями. Под "толерантностью" подразумевают нарушение или снижение движения, питания, репродукции или других функций вредителя. Способы определения пестицидной активности являются хорошо известными в данной области техники. См, например, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и патент США №5,743,477, все из которых включены в в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте.

В сочетании с настоящим изобретением "борьба" обозначает профилактическое или целебное снижение заражения насекомыми или нематодами по сравнению с необработанными культурами, более предпочтительно, заражение по существу отражается, наиболее предпочтительно, заражение полностью подавляется.

Под "пестицидно-эффективным количеством" подразумевают количество пестицида, которое способно приводить к гибели по меньшей мере одного вредителя, или заметно снижать рост, питание, или нормальное физиологическое развитие вредителя. Данное количество будет варьировать в зависимости от таких факторов как, например, конкретные целевые вредители, с которыми проводится борьба, конкретное окружение, расположение, растение, культура или сельскохозяйственный участок, подлежащий обработке, условия окружающей среды и способ, степень, концентрация, стабильность и количества внесения пестицидно-эффективной полипептидной композиции.

Настоящее изобретение также относится к способу защиты семян и прорастающих растений или растения от нападения вредителей, посредством селективного нанесения пестицидных средств на семя трансгенного растения. Пестицидные средства включают химические композиции или средства биологической борьбы, наносимые на семя трансгенного растения, где средство предназначено для обеспечения защиты растения или его семян от повреждения, вызываемого одним или несколькими вредителями растений. Кроме того, изобретение относится к семени, которое было обработано пестицидным средством, как описано в настоящем изобретении. Нанесение пестицидного средства на семя трансгенного растения приводит к улучшенной резистентности или толерантности к одному или более вредителей растений и/или улучшенной урожайности или жизненности по сравнению с трансгенным растением, культивируемым из семени, необработанном пестицидным средством, как описано в настоящем изобретении, или растению того же самого вида, что и сравниваемое трансгенное растение, которое культивировали из семени, обработанного пестицидным средством, как описано в настоящем изобретении, но у которого отсутствует трансген (оба из которых могут в настоящем изобретении именоваться "контрольным" растением).

В некоторых вариантах осуществления обработка семени такими средствами не только защищает само семя, но также приводит к растениям готовым к экстренной защите от вредителей. Таким образом, можно обходиться без непосредственной обработки культуры во время засева или вскоре после него.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Было обнаружено, что способы в соответствии с настоящим изобретением обеспечивают более высокую степень жизненности растения и урожайность в окружающих условиях при заражении нематодами и грибками, чем могло бы ожидаться от внесения средства биологической или химической борьбы или присутствия по отдельности гена для борьбы с насекомым или нематодой. Было показано, что по меньшей мере некоторые из средств борьбы с насекомыми в пределах объема настоящего изобретения предоставляют увеличенную корневую массу даже в отсутствие воздействия насекомых, причем увеличенная корневая масса ведет к улучшенной приживаемости благоприятных бактерий в пределах ризосферы, которое, в свою очередь снижает общие потери в урожайности и жизненности культуры, вызываемые либо паразитирующими на растении нематодами, либо грибками. Наряду с физической комбинацией этих компонентов во время обработки растений и растительного материала в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, композиции настоящего изобретения составляли для предоставления стабильного окружения для живых средств биологической борьбы, таких как спорообразующие, колонизирующие корни бактерии. Разнообразные добавки могут добавляться к каждой изобретательской композиции в зависимости от желательных свойств для конечного состава, который имеет необходимую физическую и химическую стабильность для производства промышленно приемлемого продукта.

Растения, резистентные к нематодам

Флуопирам является особенно применимым для борьбы с паразитирующими на растениях нематодами у растений, несущих один или несколько генов, приведенных в Таблице 1. флуопирам в комбинации с по меньшей мере одним агрохимически активным соединением является особенно применимым для борьбы с паразитирующими на растениях нематодами у растений, несущих один или несколько генов, приведенных в Таблице 1. флуопирам в комбинации со средством биологической борьбы Bacillus firmus штамм CNCM I-1582 является особенно применимым для борьбы с паразитирующими на растениях нематодами у растений, несущих один или несколько генов, приведенных в Таблице 1. Информация по нуклеотидной и аминокислотной последовательности для каждого из этих генов представлена посредством SEQ ID №, приведенной в столбцах 4 и 5 Таблицы 1 по отношению к серийному номеру патентной заявки Соединенных Штатов, приведенному в столбце 2 Таблицы 1.

НАИМЕНОВАНИЕ ГЕНА	СЕРИЙНЫЙ НОМЕР ЗАЯВКИ США	ДАТА ПОДАЧИ	SEQ ID NO НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕД.	SEQ ID NO АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕД.
axmi205	12/828,594	7-1-2010	1	2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
optaxmi205v01.03	12/828,594	7-1-2010	10	2
optaxmi205v01.02	12/828,594	7-1-2010	9	2
optaxmi205v01.04	12/828,594	7-1-2010	11	2
optaxmiR1(evo 21)	12/701,058	2-5-2010	12	13
optaxmiR1(evo 22)	12/701,058	2-5-2010	14	15
optaxmiR1(evo 23)	12/701,058	2-5-2010	16	17
optaxmiR1(evo 26)	12/701,058	2-5-2010	18	19
optaxmi115v01	12/497,221	7-2-2009	15	6
optaxmi115v02	12/497,221	7-2-2009	16	6
axmi115v02	61/471,848	4-15-2008	любой из 1-14	любой из 15-31
axmi100	12/491,396	6-25-2009	36, 282	96
axmi076	12/252,453	10-16-2008	4, 6, 11	5
axmi005	12/497,221	7-2-2009	1, 7	4, 9
optcry1Ac	12/249,016	10-10-2008	1, 2, 3, 4, 5	6
axmi031	11/762,886	6-14-2007	20	21
axn2	12/638,591	12-15-2009	7, 10	8

Флуопирам является особенно применимым для борьбы с паразитирующими на растениях нематодами у растений, несущих один или несколько генов, приведенных в Таблице 1. флуопирам в комбинации с по меньшей мере одним агрохимически активным соединением является особенно применимым для борьбы с паразитирующими на растениях нематодами у растений, несущих один или несколько генов, приведенных в Таблице 1. Флуопирам в комбинации со средством биологической борьбы Bacillus firmus штамм CNCM I-1582 является особенно применимым для борьбы с паразитирующими на растениях нематодами у растений, несущих один или несколько генов, приведенных в Таблице 1.

Флуопирам или флуопирам в комбинации со средством биологической борьбы Bacillus firmus штамм CNCM I-1582 или флуопирам в комбинации с по меньшей мере одним агрохимически активным соединением является особенно применимым для борьбы с паразитирующими на растениях нематодами у растений, несущих один или несколько генов, как описано в следующих документах: WO 2009/027539 A2, WO 2009/027313 A2, WO 2008/152008 A2, WO 2008/110522 A1, WO 2008/095972 A1, WO 2008/095970 A1, WO 2008/095969 A1, WO 2008/095919 A1, WO 2008/095916 A1, WO 2008/095911 A2, WO 2008/095910 A1, WO 2008/095889 A1, WO 2008/095886 A1, WO 2008/077892 A1, WO 2008/071726 A2, WO 2006/020821 A2, WO 2005/082932 A2, WO 2009/048847 A1, WO 2007/095469 A2, WO 2005/012340 A1, WO 2007/104570 A2, 11/765,491, 11/765,494, 10/926,819, 10/782,020, 12/032,479, 10/783,417, 10/782,096, 11/657,964, 12/192,904, 11/396,808, 12/166,253, 12/166,239, 12/166,124, 12/166,209, 11/762,886, 12/364,335, 11/763,947, 12/252,453, 12/209,354, 12/491,396 или 12/497,221.

Флуопирам или флуопирам в комбинации со средством биологической борьбы Bacillus firmus штамм CNCM I-1582 или флуопирам в комбинации с по меньшей мере одним агрохимически активным соединением является особенно применимым для борьбы с паразитирующими на растениях нематодами у растений, несущих один или несколько генов Hs1^pro-1, Mi-1, Mi-1.2, Hero A, Gpa2, Gro1-4, Rhg1, Rhg4, Mi-3, Mi-9, Cre1, Cre3, Ma, Hsa-1^g, Me3, Rmc1, CLAVATA3-подобных пептидов (например, SYV46).

Предпочтительный вариант осуществления включает в себя растение, резистентное к нематодам, как описано выше, обработанное флуопирамом.

Предпочтительный вариант осуществления включает в себя растение, резистентное к нематодам, как описано выше, обработанное флуопирамом в комбинации со средством биологической борьбы Bacillus firmus штамм CNCM I-1582.

Предпочтительный вариант осуществления включает в себя растение, резистентное к нематодам, как описано выше, обработанное флуопирамом в комбинации с по меньшей мере одним агрохимически активным соединением.

В разнообразных вариантах осуществления композиции и способы настоящего изобретения включают в себя обработку трансгенного растения, содержащего один или несколько генов, приведенных в Таблице 1, флуопирамом или флуопирамом в комбинации со средством биологической борьбы Bacillus firmus штамм CNCM I-1582 или флуопирамом в комбинации с по меньшей мере одним агрохимически активным соединением. В конкретных вариантах осуществления флуопирам или флуопирам в комбинации со средством биологической борьбы Bacillus firmus штамм CNCM I-1582 или флуопирам в комбинации с по меньшей мере одним агрохимически активным соединением наносят на семя трансгенных растений, несущих один или несколько генов, приведенных в Таблице 1, включая их биологически активные варианты и фрагменты.

Иллюстративный способ по изобретению включает в себя нанесение флуопирама или флуопирама в комбинации со средством биологической борьбы Bacillus firmus штамм CNCM I-1582 или флуопирама в комбинации с по меньшей мере одним агрохимически активным соединением по изобретению на материал для размножения (напр. семена) растения для борьбы с повреждением от нематод и/или увеличения урожайности.

Дополнительный иллюстративный способ по изобретению включает в себя внесение флуопирама или флуопирама в комбинации со средством биологической борьбы Bacillus firmus штамм CNCM I-1582 или флуопирама в комбинации с по меньшей мере одним агрохимически активным соединением либо в почву, либо нанесение на растение (например, на листву) для борьбы с повреждением от нематод и/или увеличения урожайности.

В разнообразных вариантах осуществления нематоцидным средством биологической борьбы является флуопирам, а сельскохозяйственная культура, резистентная к нематодам, содержит трансгенное растение, включающее в себя Axmi031 или Axn2 (Таблица 1).

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности с SEQ ID NOs, приведенными в Таблице 1, являются иллюстративными последовательностями и не предназначены для ограничения объема изобретения. Изобретение охватывает растения и части растений, включая растительные клетки и семена, содержащие один или несколько генов, приведенных в столбце 1 Таблицы 1. В некоторых вариантах осуществления изобретение охватывает растения и части растений, включая растительные клетки и семена, содержащие одну или более из нуклеотидных последовательностей, приведенных в столбце 4 Таблицы 1. В некоторых вариантах осуществления изобретение охватывает растения и части растений, включая растительные клетки и семена, содержащие одну или более из нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или несколько полипептидов, приведенных в столбце 5 Таблицы 1.

В еще одном другом варианте осуществления изобретение охватывает растения и части растений, включая растительные клетки и семена, содержащие одну или более из нуклеотидных последовательностей, кодирующих биологически активный вариант или фрагмент аминокислотной(ых) последовательности(ей), приведенных в столбце 5 Таблицы 1.

Фрагмент нуклеотидной последовательности, который кодирует биологически активную часть пестицидного белка по изобретению, будет кодировать по меньшей мере около 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 смежных аминокислот, или вплоть до полного числа аминокислот, присутствующих в непроцессированном пестицидном белке, приведенным в настоящем изобретении в Таблице 2. Такие биологически активные части могут быть получены посредством рекомбинантных методов и оценены на пестицидную активность. Способы определения пестицидной активности являются хорошо известными в данной области техники. См., например, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и патент США №5,743,477, все из которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте.

В некоторых вариантах осуществления фрагмент представляет собой фрагмент протеолитического расщепления. Например, фрагмент протеолитического расщепления может иметь N-концевое или C-концевое усечение из по меньшей мере около 100 аминокислот, около 120, около 130, около 140, около 150 или около 160 аминокислот по отношению к аминокислотной последовательности приведенной в Таблице 2. В некоторых вариантах осуществления фрагменты, охватываемые настоящим изобретением, являются результатом удаления C-концевого домена кристаллизации, например, посредством протеолиза или посредством введения стоп-кодона в кодирующую последовательность.

Предпочтительные пестицидные белки в соответствии с настоящим изобретением кодируются нуклеотидной последовательностью, в достаточной степени идентичной нуклеотидной(ым) последовательности(ям), приведенным в Таблице 2, или представляют собой пестицидные белки, которые являются в достаточной степени идентичными аминокислотной(ым) последовательности(ям), приведенным в Таблице 2. Под "в достаточной степени идентичной" подразумевают аминокислотную или нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере около 60% или 65% идентичности последовательности, около 70% или 75% идентичности последовательности, около 80% или 85% идентичности последовательности, около 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по сравнению с референтной последовательностью с использованием одной из программ выравнивания, описанных в настоящем изобретении, с использованием стандартных параметров. Специалист в данной области техники сможет понять, что эти значения могут соответствующим образом регулироваться для определения соответствующей идентичности белков, кодируемых двумя нуклеотидными последовательностями, принимая во внимание вырожденность кодонов, сходство аминокислот, позиционирование рамки считывания и т.п.

Для определения процентной идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеотидных последовательностей, последовательности выравнивают с целью оптимального сравнения. Процентная идентичность между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений, сравниваемых последовательностей (т.е. процентная идентичность = число идентичных положений/общее число положений (например, перекрывающихся положений) × 100). В одном варианте осуществления две последовательности имеют одну и ту же длину. В еще одном варианте осуществления процентную идентичность рассчитывают на протяжении всей полноты референтной последовательности (например, последовательности, приведенной в Таблице 2). Процентная идентичность между двумя последовательностями может определяться с использованием методов, аналогичных тем, что описаны ниже, с разрешенными разрывами или без них. При расчете процентной идентичности производят подсчет, как правило, точных совпадений. Разрыв, т.е. положение при выравнивании, где остаток присутствует в одной последовательности, но отсутствует в другой, считают положением с неидентичными остатками.

Определение процентной идентичности между двумя последовательностями может осуществляться с использованием математического алгоритма. Неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения двух последовательностей, является алгоритм Karlin и Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, модифицированный, как у Karlin и Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Такой алгоритм включен в программы BLASTN и BLASTX из Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Нуклеотидный поиск BLAST может осуществляться с помощью программы BLASTN, балльная оценка = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидных последовательностей гомологичных пестицидно-подобных молекул нуклеиновой кислоты по изобретению. Поиск белка BLAST может осуществляться с помощью программы BLASTX, балльная оценка = 50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных пестицидным молекулам по изобретению. Для получения содержащих разрывы выравниваний с целью сравнения, BLAST с разрывами (в BLAST 2.0) могут использоваться, как описано у Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Альтернативно, PSI-Blast может применяться для проведения итерационного поиска, который обнаруживает дальнее родство между молекулами. См., Altschul et al. (1997) supra. При использовании программ BLAST, BLAST с разрывами и PSI-Blast могут применяться параметры по умолчанию соответствующих программ (например, BLASTX и BLASTN). Выравнивание может также проводиться вручную посредством проверки.

Еще один неограничивающий пример математического алгоритма, используемый для сравнения последовательностей, представляет собой алгоритм ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW сравнивает последовательности и выравнивает полные аминокислотные или ДНК последовательности, и, таким образом, может предоставить данные о сохранении последовательности целой аминокислотной последовательности. Алгоритм ClustalW применяют в нескольких доступных для приобретения пакетах программного обеспечения анализа ДНК/аминокислоты, таких как модуль ALIGNX программного пакета Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). После выравнивания аминокислотных последовательностей с помощью ClustalW, можно оценить процент аминокислотной идентичности. Неограничивающим примером программного обеспечения, применимого для анализа выравниваний ClustalW является GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas), который позволяет проводить оценку аминокислотного (или ДНК) сходства и идентичности между множеством белков. Еще одним неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Myers и Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Такой алгоритм введен в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью пакета программного обеспечения GCG Wisconsin Genetics Software Package, Версия 10 (доступного от Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USA). При использовании программы ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей, может применяться таблица веса остатков РАМ120, штраф за длину пропуска, равный 12, и штраф за пропуск в последовательности, равный 4.

Если не утверждается иначе, GAP Version 10, в которой используют алгоритм Needleman и Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, будет применяться для определения идентичности последовательности или сходства, с использованием следующих параметров: % идентичности и % сходства для нуклеотидной последовательности с использованием веса гэпа, равной 50, и веса длины, равной 3, и матрица балльной оценки nwsgapdna.cmp; % идентичности или % сходства для аминокислотной последовательности с использованием веса гэпа, равной 8 и веса длины, равной 2, и программы подсчета балльной оценки BLOSUM62. Могут также применяться эквивалентные программы. Под "эквивалентной программой" подразумевают любую программу сравнения последовательности, которая для любых двух запрашиваемых последовательностей генерирует выравнивание, имеющее идентичное совпадение нуклеотидного остатка, и идентичный процент идентичности последовательности при сравнении с соответствующим выравнивании, генерируемым GAP Версия 10.

"Варианты" аминокислотных последовательностей, приведенные в Таблице 2, включают те последовательности, которые кодируют пестицидные белки, раскрытые в настоящем изобретении, но которые отличаются консервативно, вследствие вырожденности генетического кода, а также те, которые являются достаточно идентичными, как обсуждается выше. Природные аллельные варианты могут быть идентифицированы с применением хорошо известных методов молекулярной биологии, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и методов гибридизации, как изложено ниже. Вариантные нуклеотидные последовательности также включают синтетически полученные нуклеотидные последовательности, которые были генерированы, например, посредством применения сайт-направленного мутагенеза, но которые все еще кодируют пестицидные белки, раскрытые в настоящем изобретении, как обсуждается ниже.

Специалист в данной области техники сможет дополнительно понять, что изменения могут вводиться посредством мутации нуклеотидных последовательностей по изобретению, что приводит к изменениям в аминокислотной последовательности кодируемых пестицидных белков, без изменения биологической активности белков. Таким образом, вариантные изолированные молекулы нуклеиновой кислоты могут быть созданы посредством введения одной или нескольких нуклеотидных замен, вставок или делеций в соответствующую нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящем изобретении, таким образом, что одна или несколько аминокислотных замен, вставок или делеций вводятся в кодируемый белок. Мутации могут вводиться посредством стандартных методов, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Такие вариантные нуклеотидные последовательности также охватываются настоящим изобретением.

Например, консервативные аминокислотные замены могут быть проведены по одному или нескольким, предсказанным, несущественным аминокислотным остаткам. "Несущественный" аминокислотный остаток представляет собой остаток, который может быть изменен из последовательности дикого типа пестицидного белка без изменения биологической активности, в то время как "существенный" аминокислотный остаток требуется для биологической активности. "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, в которой аминокислотный остаток заменен на аминокислотный остаток, имеющий сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвлеными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

Аминокислотные замены могут быть проведены в неконсервативных областях, которые сохраняют функцию. Как правило, такие замены не могут быть проведены для консервативных аминокислотных остатков, или для аминокислотных остатков, располагающихся в пределах консервативного мотива, где такие остатки являются существенными для активности белка.

Примеры остатков, которые являются консервативными, и которые могут быть существенными для активности белка, включают, например, остатки, которые являются идентичными между всеми белками, содержащимися при выравнивании сходных или родственных токсинов с последовательностями изобретения (например, остатки, которые являются идентичными при выравнивании гомологичных белков). Примеры остатков, которые являются консервативными, но которые могут обеспечить замены консервативных аминокислот и все еще сохраняют активность, включают, например, остатки, которые имеют только консервативные замены между всеми белками, содержащимися при выравнивании сходных или родственных токсинов с последовательностями изобретения (например, остатки, которые имеют только консервативные замены между всеми белками, содержащимися при выравнивании гомологичных белков). Однако, специалист в данной области техники сможет понять, что функциональные варианты могут иметь минорные консервативные или неконсервативные изменения в консервативных остатках.

Альтернативно, вариантные нуклеотидные последовательности могут быть получены посредством введения мутаций случайным образом вдоль всей кодирующей последовательности или ее части, таким образом, как посредством насыщающего мутагенеза, и полученные в результате мутанты могут подвергаться скринингу на способность придавать пестицидную активность для идентификации мутантов, которые сохраняют активность. После мутагенеза, кодируемый белок может экспрессироваться рекомбинантно, и активность белка может быть определена с использованием стандартных аналитических методов.

С использованием методов, таких как ПЦР, гибридизация и т.п., соответствующие пестицидные последовательности могут быть идентифицированы, причем такие последовательности имеют значительную идентичность с последовательностями по изобретению. См., например, Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) и Innis, el al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).

Вариантные нуклеотидные и аминокислотные последовательности в соответствии с настоящим изобретением также охватывают последовательности, полученные в результате мутагенных и рекомбиногенных методик, таких как перестановка в ДНК. С помощью такой методики, различные одна или несколько областей, к