Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток

Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данная заявка претендует на привилегии, предоставляемые в связи с подачей предварительной заявки на патент США № 61/289671, поданной 23 декабря 2009 г., которая в полном объеме включается в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении описываются способы содействия дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток в клетки, вырабатывающие инсулин. В частности, настоящее изобретение обеспечивает способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, соэкспрессирующих NKX6.1, инсулин и минимальное количество глюкагона.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1 типа и нехватка островков Лангерганса для трансплантации заставили обратить внимание на разработку источников инсулин-продуцирующих клеток, или β-клеток, подходящих для трансплантации. Одним из подходов является формирование функциональных β-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.

При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентные клетки дают начало группе клеток, формирующих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и эндодерму) в ходе процесса, именуемого гаструляцией. Такие ткани, как, например, щитовидная железа, тимус, поджелудочная железа, кишечник и печень, будут развиваться из эндодермы через промежуточную стадию. Промежуточной стадией данного процесса является образование дефинитивной эндодермы. Клетки дефинитивной эндодермы экспрессируют ряд маркеров, таких как HNF3 beta, GATA4, MIXL1, CXCR4 и SOX17.

Формирование поджелудочной железы происходит при дифференцировке дефинитивной эндодермы в панкреатическую эндодерму. Клетки панкреатической эндодермы экспрессируют ген панкреатическо-дуоденального гомеобокса, PDX1. При отсутствии PDX1 развитие поджелудочной железы не идет дальше формирования вентрального и дорзального зачатков. Таким образом, экспрессия PDX1 характеризует критическую стадию органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, помимо других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировке панкреатической эндодермы.

По имеющимся данным, клетки, обладающие свойствами островковых клеток, были получены из эмбриональных клеток мыши. Например, в публикации Lumelsky et al. (Science 292: 1389, 2001) сообщается о дифференцировке мышиных эмбриональных стволовых клеток в инсулин-секретирующие структуры, аналогичные островкам поджелудочной железы. Soria и соавторы (Diabetes 49: 157, 2000) сообщают, что инсулин-секретирующие клетки, полученные из мышиных эмбриональных стволовых клеток, нормализовали гликемию у мышей с диабетом, вызванным стрептозотоцином.

В одном примере, в публикации Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002), описывается, что обработка мышиных эмбриональных стволовых клеток ингибиторами фосфоинозитид-3-киназы (LY294002) приводила к получению клеток, подобных β-клеткам.

В другом примере, в публикации Blyszczuk et al. (PNAS 100: 998, 2003), сообщается о получении инсулин-продуцирующих клеток из мышиных эмбриональных стволовых клеток с конститутивной экспрессией Pax4.

В публикации Micallef et al. сообщается, что ретиноевая кислота может регулировать способность эмбриональных стволовых клеток формировать PDX1-положительную панкреатическую эндодерму. Ретиноевая кислота с наибольшей эффективностью индуцирует экспрессию Pdx1 при добавлении в культуру на 4 день дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в течение периода, соответствующего концу гаструляции эмбриона (Diabetes 54: 301, 2005).

В публикации Miyazaki et al. сообщается о линии мышиных эмбриональных стволовых клеток со сверхэкспрессией Pdx1. Результаты показывают, что экспрессия экзогенного Pdx1 очевидно повышает экспрессию генов инсулина, соматостатина, глюкокиназы, нейрогенина 3, p48, Pax6 и HNF6 в образующихся дифференцированных клетках (Diabetes 53: 1030, 2004).

В публикации Skoudy et al. сообщается, что активин A (входящий в суперсемейство TGF-β) повышает экспрессию экзокринных панкреатических генов (p48 и амилаза) и эндокринных генов (Pdx1, инсулин и глюкагон) в эмбриональных стволовых клетках мыши. Максимальный эффект наблюдался при использовании активина A в концентрации 1 нМ. Они также отметили, что ретиноевая кислота не влияла на уровень экспрессии инсулина и Pdx1 мРНК; однако, лечение с использованием 3 нМ FGF7 привело к повышению уровня транскрипта для Pdx1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).

В работе Shiraki et al. изучались эффекты факторов роста, специфически ускоряющих дифференцировку эмбриональных стволовых клеток в PDX1-положительные клетки. Эти авторы наблюдали, что TGF-β2 приводил к воспроизводимому увеличению доли Pdx1-положительных клеток (Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16.).

Gordon и соавторы продемонстрировали индукцию брахиурия-[положительных]/HNF3-бета-[положительных] клеток эндодермы из мышиных эмбриональных стволовых клеток в отсутствие сыворотки и в присутствии активина с ингибитором сигнализации Wnt (US 2006/0003446A1).

В публикации Gordon et al. (PNAS, Vol 103, page 16806, 2006) говорится: «Для образования передней первичной полоски требовались одновременно сигнальные пути Wnt и TGF-бета/Nodal/активин».

Однако модель развития эмбриональных стволовых клеток на мышах может не имитировать в точности программу развития у высших млекопитающих, например у человека.

Thomson и соавторы выделяли эмбриональные стволовые клетки из человеческих бластоцист (Science 282: 114, 1998). Параллельно Gearhart и соавторы получили клеточные линии человеческих эмбриональных зародышевых клеток (чЭЗ, hEG) из ткани половых желез эмбриона (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). В отличие от эмбриональных стволовых клеток мыши, воспрепятствовать дифференцировке которых можно путем простого культивирования с фактором торможения лейкемии (LIF), эмбриональные стволовые клетки человека должны культивироваться в очень специфических условиях (US № 6200806, WO 99/20741, WO 01/51616).

D’Amour и соавторы описывают производство обогащенных культур дефинитивной эндодермы, производной от человеческих эмбриональных стволовых клеток, в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology, 2005). Трансплантация этих клеток под почечную капсулу мышей привела к их дифференцировке в более зрелые клетки, обладающие характерными особенностями некоторых эндодермальных органов. Клетки дефинитивной эндодермы, производные от эмбриональных стволовых клеток человека, могут подвергаться дальнейшей дифференцировке в PDX1-положительные клетки после добавления FGF-10 (US 2005/0266554A1).

В публикации D’Amour et al. (Nature Biotechnology - 24, 1392-1401 (2006)) говорится: «Мы разработали процесс дифференцировки, преобразующий эмбриональные клетки человека (hES) в эндокринные клетки, способные синтезировать гормоны поджелудочной железы: инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид и грелин. Данный процесс имитирует органогенез поджелудочной железы in vivo, проводя клетки через стадии, напоминающие образование дефинитивной эндодермы, эндодермы кишечной трубки, панкреатической эндодермы и превращение предшественников эндокринных клеток в клетки, экспрессирующие эндокринные гормоны».

В другом примере Fisk et al. сообщают о системе для производства островковых клеток поджелудочной железы из человеческих эмбриональных стволовых клеток (US 2006/0040387A1). В данном случае процесс дифференцировки был разделен на три стадии. Сначала человеческие эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы до эндодермы с помощью сочетания бутирата натрия и активина А. Далее клетки культивировались с антагонистами TGF-β, такими как ноггин, в сочетании с EGF или бетацеллюлином с получением PDX1-положительных клеток. Окончательная дифференцировка запускалась никотинамидом.

В одном из примеров Benvenistry et al. сообщают: «Мы делаем вывод, что сверхэкспрессия PDX1 увеличивала экспрессию панкреатических обогащенных генов, а для индукции экспрессии инсулина могут требоваться дополнительные сигналы, присутствующие только in vivo» (Benvenistry et al., Stem Cells 2006; 24: 1923-1930).

В другом примере Grapin-Botton et al. сообщают: «Ранняя активация Ngn3 почти во всех случаях индуцировала клетки глюкагон+, разрушая при этом прогениторные клетки поджелудочной железы. Как и в случае E11.5, прогениторные клетки PDX-1 могут дифференцироваться в инсулин-[положительные] и PP-[положительные] клетки» (Johansson KA et al., Developmental Cell, 12, 457-465, March 2007).

Например, Diez et al. сообщают: «После 9 и 10 недель большинство глюкагон-положительных клеток соэкспрессировали инсулин, хотя на этих стадиях явно обнаруживались и отдельные клетки, экспрессирующие только инсулин. Клетки, соэкспрессирующие инсулин и глюкагон, наблюдались в течение всего периода исследования (от 9 до 21 недели), но представляли лишь небольшую часть от общего количества экспрессирующих инсулин и глюкагон клеток» (J. Histochem. Cytochem. 2009 Sep; 57(9): 811-24. 2009 Apr 13.)

В одном из примеров Chen и соавторы сообщают: «(-)-индолактам V [(ILV)] активирует сигнализацию протеинкиназы С и направляет поджелудочную спецификацию hESC, которые уже были зафиксированы в линии эндодермы… ILV и ретиноевая кислота воздействуют через соответствующий механизм… ILV демонстрирует более сильную индукцию экспрессирующих PDX-1 клеток (процент клеток, экспрессирующих PDX-1), чем ретиноевая кислота». (Nature Chemical Biology 5, 195-196 (April 2009) doi:10.1038/nchembio0409-195).

Lyttle и соавторы сообщают: «NKX6-1 солокализованы только с клетками инсулина, что указывает на то, что NKX6-1 участвует только в развитии бета-клеток человека». (Diabetologia 2008 Jul: 51(7): 1169-80, 2008).

Таким образом, сохраняется значительная потребность в разработке in vitro способов создания функциональных инсулиноэкспрессирующих клеток, более схожих с β-клетками. Данное изобретение представляет альтернативный подход к повышению эффективности дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека в экспрессирующие инсулин клетки путем генерирования популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, соэкспрессирующих NKX6.1, инсулин и минимальное количество глюкагона.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном варианте настоящее изобретение обеспечивает популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, соэкспрессирующих NKX6.1, инсулин и минимальное количество глюкагона.

В одном варианте настоящее изобретение обеспечивает способ дифференцировки популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, соэкспрессирующих NKX6.1, инсулин и минимальное количество глюкагона, включающий следующие стадии:

a. Культивирование плюрипотентных стволовых клеток,

b. Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы,

c. Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дифференцировки в клетки панкреатической эндодермы, и

d. Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндодермы поджелудочной железы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринной поджелудочной железы, соэкспрессирующие NKX6.1, инсулин и минимальное количество глюкагона, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, средой, обогащенной активатором протеинкиназы С.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг.1 показан эффект от обработки TPB на экспрессию инсулина и глюкагона в клетках согласно данному изобретению. На панелях a и b показана экспрессия инсулина и глюкагона, соответственно, в клетках, обработанных TPB. Контрольные популяции клеток показаны на панелях c и d.

На фиг.2 показано влияние различных концентраций TPB на экспрессию инсулина и глюкагона в клетках, обработанных способом, описываемым в данном изобретении. На панелях с a по d показана экспрессия инсулина и глюкагона в популяциях клеток, обработанных TPB в указанных дозах.

На фиг.3 показано влияние различных концентраций ингибитора протеинкиназы C на экспрессию инсулина и глюкагона в клетках, обработанных способом, описываемым в данном изобретении. На панели a изображена экспрессия инсулина и глюкагона в клетках, обработанных TPB, а на панели c изображено соответствующее маркирование посредством DAPI). На панели b изображена экспрессия инсулина и глюкагона в клетках, обработанных TPB и GÖ 6976, а на панели d изображено соответствующее маркирование посредством DAPI).

На фиг.4 показано влияние различных концентраций активаторов протеинкиназы C на экспрессию инсулина и глюкагона в клетках, обработанных способом, описываемым в данном изобретении. На панели a показана экспрессия инсулина в клетках, обработанных TPB. На панели b показана экспрессия инсулина в клетках, обработанных ILV. На панели c показана экспрессия инсулина в клетках, обработанных PMA.

На фиг.5 показана экспрессия маркеров, характерных для эндокринной линии поджелудочной железы в клетках, обработанных способом, описываемым в данном изобретении. На панелях изображена экспрессия инсулина и NKX6.1 (панель a), инсулина и PDX1 (панель b), инсулина и NEUROD1 (панель c), инсулина и соматостатина (панель d), а также инсулина и грелина (панель e).

На фиг.6 показана экспрессия инсулина и глюкагона в клетках, обработанных способом, описываемым в данном изобретении. На панелях с a по c показана экспрессия инсулина (панель a), экспрессия глюкагона (панель b) и окрашивание DAPI (панель c) в клетках, обрабатывавшихся DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл ноггина + 20 нг/мл активина A + ингибитор киназы p38 (раскрывается в US 6214830 при 2,5 мкМ) в течение четырех дней (стадия 3, обработка 8, пример 2). На панелях с d по f показана экспрессия инсулина (панель d), экспрессия глюкагона (панель e) и окрашивание DAPI (панель f) в клетках, обрабатывавшихся глюкозой с высоким уровнем DMEM + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл ноггина в течение четырех дней (стадия 3, обработка 9, пример 2).

На фиг.7 показано обнаружение человеческого С-пептида в (SCID) - бежевые (Bg) мыши, через четыре, восемь и двенадцать недель после получения клеток согласно настоящему изобретению, после сахарной нагрузки.

На фиг.8 показан процент клеток, соэкспрессирующих PDX1 и NKX6.1, полученных после обработки различными ингибиторами протеинкиназы C в указанных концентрациях.

На фиг.9 показана экспрессия NGN3, PDX1, NKX6.1 и PTF1-альфа в клетках, обработанных способами, описанными в примере 6.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для ясности описания, а не для ограничения изобретения, подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцировки из нескольких зародышевых листков (эндодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от нескольких зародышевых листков, и вносить существенный вклад в формирование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.

Стволовые клетки классифицируют по потенциалу развития: (1) тотипотентные, то есть, способные преобразоваться в любой из эмбриональных и внеэмбриональных типов клеток; (2) плюрипотентные, то есть, способные преобразоваться во все типы эмбриональных клеток; (3) мультипотентные, то есть, способные преобразоваться во множество клеточных линий, но в рамках одной ткани, органа или физиологической системы (например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК, HSC) могут порождать ГСК (самообновление), олигопотентные ограниченные клетки-предшественники крови и все типы клеток и элементов (например, тромбоциты), являющиеся стандартными составляющими крови); (4) олигопотентные, то есть, способные преобразоваться в более ограниченное подмножество клеточных линий, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, то есть, способные преобразоваться в единственную клеточную линию (например, сперматогенные стволовые клетки).

Дифференцировка представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, такой как, например, нервная или мышечная клетки. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированной дифференцировкой представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцировки клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцировки обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцировки до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного типа клетки или набора типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному типу. Дедифференцировкой называется процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в линии дифференцировки. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцировки клетки» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцировки клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцировки. Маркером, специфичным для линии дифференцировки, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцировки, которая может использоваться для оценки дифференцировки некоммитированных клеток в клетки данной линии дифференцировки.

Используемые в настоящей заявке термины «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы», «клетки 1-й стадии» или «стадия 1» относятся к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 или OTX2. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, относятся клетки-предшественники первичной полоски, клетки первичной полоски, клетки мезэндодермы и клетки дефинитивной эндодермы.

Используемый в настоящей заявке термин «клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы» относится к клеткам с экспрессией по меньшей мере одного из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF1 beta, PTF1 alpha, HNF6, HNF4 alpha, SOX9, HB9 или PROX1. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, относятся клетки панкреатической эндодермы, клетки первичной кишечной трубки и клетки поздней передней кишки.

Используемый в настоящей заявке термин «дефинитивная эндодерма» относится к клеткам, обладающим характерными особенностями клеток, происходящих в ходе гаструляции от эпибласта, и формирующим желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки дефинитивной эндодермы экспрессируют следующие маркеры: HNF3 beta, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 и MIXL1.

Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.

«Панкреатической эндокринной клеткой», или «клеткой, экспрессирующей гормон поджелудочной железы», или «клеткой, экспрессирующей характеристики эндокринной линии поджелудочной железы» в настоящем документе называется клетка, способная экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.

Выделение, размножение и культивирование плюрипотентных стволовых клеток

Характеристика плюрипотентных стволовых клеток

Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или несколько стадийно-специфичных эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначенными Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к утрате экспрессирования SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81 (при наличии) и к увеличению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных плюрипотентных стволовых клетках, как правило, активна щелочная фосфатаза, которая может быть обнаружена путем фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида, с последующим обнаружением с помощью Vector Red, применяемого в качестве субстрата, в соответствии с инструкциями производителя (Vector Laboratories, Burlingame Calif.). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определяемые с помощью ПЦР в реальном времени.

Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных стволовых клеток является потенциал дифференцировки в клетки всех трех зародышевых листков: в эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Плюрипотентность плюрипотентных стволовых клеток может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида и их гистологического исследования для получения доказательств наличия клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. В качестве альтернативы плюрипотентность можно определить по созданию эмбриоидных телец и анализу их на предмет присутствия маркеров, ассоциирующихся с тремя зародышевыми листками.

Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза (G-banding) и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», т.е. эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений.

Источники плюрипотентных стволовых клеток

К типам плюрипотентных стволовых клеток, которые можно использовать, относятся устойчивые линии плюрипотентных клеток, получаемые из формируемой после вынашивания плода ткани, в том числе из преэмбриональной ткани (такой как бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в ходе вынашивания, как правило, но необязательно, до срока приблизительно 10-12 недель беременности. Примерами, не ограничивающими настоящее изобретение, являются стабильные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток или человеческих эмбриональных зародышевых клеток, например, клеточные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, H7 и H9 (WiCell). Также возможно использование описываемых в настоящей заявке составов в ходе первоначального установления или стабилизации таких клеток, в этом случае исходными клетками являются первичные плюрипотентные клетки, взятые напрямую из тканей-источников. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки мутантных линий эмбриональных стволовых клеток человека, таких как, например, BG01v (BresaGen, Атенс, Джорджия, США).

В одном из вариантов осуществления эмбриональные стволовые клетки человека готовят, как описано в следующих публикациях Thomson et al. (US № 5843780; Science 282: 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 7844, 1995).

Культивирование плюрипотентных стволовых клеток

В одном из вариантов осуществления плюрипотентные стволовые клетки, как правило, культивируют на слое питающих клеток, которые поддерживают плюрипотентные стволовые клетки в различных отношениях. Альтернативно, плюрипотентные стволовые клетки культивируются в культуральной системе, по существу не содержащей питающих клеток, но, тем не менее, поддерживающей пролиферацию плюрипотентных стволовых клеток и не допускающей существенной дифференцировки. Рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцировки поддерживается путем использования среды, кондиционированной посредством предварительного культивирования клеток иного типа. В качестве альтернативы рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцировки поддерживается путем использования среды с химически определенным составом.

Например, в работах Reubinoff et al. (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)) и Thompson et al. (Science 6 November 1998: Vol. 282. № 5391, рр. 1145-1147) описано культивирование линий плюрипотентных стволовых клеток из человеческих бластоцист с применением слоя питающих клеток из мышиных эмбриональных фибробластов.

Richards и соавторы (Stem Cells 21: 546-556, 2003) анализировали набор из одиннадцати слоев питающих клеток, полученных от взрослых, новорожденных и эмбрионов людей, по их способности осуществлять поддержку культуры человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Richards и соавторы сообщают: «линии человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивируемые на питающих слоях из фибробластов кожи взрослых людей, сохраняют морфологию, характерную для эмбриональных стволовых клеток, и остаются плюрипотентными».

В US 20020072117 описываются линии клеток, продуцирующие среду, осуществляющую поддержку плюрипотентных стволовых клеток приматов в культуре, не содержащей питающих клеток. Использованные клеточные линии представляют собой мезенхимо- и фибробластоподобные линии, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В US 20020072117 также описывается использование этих клеточных линий в качестве первичного слоя питающих клеток.

В другом примере Wang et al. (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005) описывают способы длительного выращивания человеческих плюрипотентных стволовых клеток на слоях питающих клеток, полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток.

В другом примере Stojkovic et al. (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005) описывают систему питающих клеток, получаемую в результате спонтанной дифференцировки человеческих эмбриональных стволовых клеток.

В еще одном примере Miyamoto et al. (Stem Cells 22: 433-440, 2004) описывают получение питающих клеток из человеческой плаценты.

Amit et al. (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003) описывают слой питающих клеток, полученных из человеческой крайней плоти.

В другом примере Inzunza et al. (Stem Cells 23: 544-549, 2005) описывают слой питающих клеток, полученных из человеческих фибробластов постнатальной крайней плоти.

В US 6642048 описывают среду, поддерживающую рост плюрипотентных стволовых клеток приматов (пПС, pPS) в среде, не содержащей питающих клеток, и клеточные линии, которые могут использоваться для производства такой среды. В US 6642048 говорится: «Данное изобретение включает мезенхимо- и фибробластоподобные клеточные линии, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В документе описываются и иллюстрируются способы получения таких клеточных линий, обработки среды и выращивания стволовых клеток с применением кондиционированной среды”.

В другом примере, WO 2005014799, описывают кондиционированную среду для поддержания, пролиферации и дифференцировки клеток млекопитающих. В WO 2005014799 говорится: «Питательная среда, подготовленная в соответствии с настоящим изобретением, обусловлена секрецией мышиных клеток; в частности, дифференцированных и иммортализованных трансгенных гепатоцитов под названием MMH (гепатоциты мышей Met)».

В другом примере Xu et al. (Stem Cells 22: 972-980, 2004) описывают кондиционированную среду, полученную из производных человеческих эмбриональных стволовых клеток, генетически модифицированных для увеличения экспрессии обратной транскриптазы человеческой теломеразы.

В другом примере, US 20070010011, описывают культуральную среду определенного химического состава для поддержания плюрипотентных стволовых клеток.

В альтернативной культуральной системе используется не содержащая сыворотки среда, обогащенная факторами роста, способными стимулировать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток. Например, Cheon et al. (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005) описывают не содержащую питающих клеток и сыворотки культуральную систему, в которой эмбриональные стволовые клетки поддерживаются в некондиционированной заменяющей сыворотку среде (SR), обогащенной различными факторами роста, способными запустить самообновление эмбриональных стволовых клеток.

В другом примере Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568-574, 2006) описывают способы длительного культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток в отсутствие фибробластов или кондиционированной среды, с применением среды, обогащенной основным фактором роста фибробластов (bFGF).

В другом примере, US 20050148070, описан способ культивирования эмбриональных стволовых клеток человека в среде с определенным составом, не содержащей сыворотки и не содержащей питающих клеток - фибробластов. Данный способ заключается в культивировании стволовых клеток в культуральной среде, содержащей альбумин, аминокислоты, витамины, минеральные вещества, по меньшей мере один трансферрин или заместитель трансферрина, по меньшей мере один инсулин или заместитель инсулина, причем упомянутая культуральная среда существенно свободна от эмбриональной сыворотки млекопитающих и содержит по меньшей мере приблизительно 100 нг/мл фактора роста фибробластов, способного активировать сигнальный рецептор фактора роста фибробластов, где упомянутый фактор роста поступает из источника, отличного от просто питающего слоя фибробластов; данная среда поддерживает пролиферацию стволовых клеток в недифференцированном состоянии в отсутствие питающих клеток или кондиционированной среды.

В другом примере, US 20050233446, описывают среду с определенным составом, которая может использоваться при культивировании стволовых клеток, включая недифференцированные зародышевые стволовые клетки приматов. В растворе среда по существу является изотонической относительно культивируемых стволовых клеток. В данной культуре указанная среда содержит основную среду и количество каждого из bFGF, инсулина и аскорбиновой кислоты, достаточное для поддержки роста зародышевых стволовых клеток без существенной дифференцировки.

В другом примере, US 6800480, говорится: “В одном варианте осуществления предлагается культуральная среда для выращивания клеток зародышевых стволовых клеток приматов, в значительной степени в недифференцированном состоянии, включающая основную среду с низким содержанием эндотоксина и низким осмотическим давлением, которая эффективно поддерживает рост зародышевых стволовых клеток приматов. Основная среда объединяется с питательной сывороткой, способной поддерживать рост зародышевых стволовых клеток приматов, и субстратом, выбираемым из группы, включающей питающие клетки и экстраклеточный матрикс, полученный из питающих клеток. Среда также содержит аминокислоты, не относящиеся к незаменимым, антиоксидант и первый фактор роста, выбираемый из группы, содержащей нуклеозиды и соль пируват”.

В другом примере, US 20050244962, говорится: «В одном примере в изобретении предлагается способ культивирования эмбриональных стволовых клеток приматов. Стволовые клетки культивируются в культуре, в основном не содержащей эмбриональной сыворотки млекопитающих (предпочтительно также в основном не содержащей эмбриональной сыворотки любых животных) и в присутствии фактора роста фибробластов, полученного из источника, иного, чем просто питающие клетки-фибробласты. В предпочтительной форме слой питающих фибробластов, ранее необходимый для поддержания культуры стволовых клеток, становится необязательным вследствие добавления достаточного количества фактора роста фибробластов».

В другом примере, WO 2005065354, описана существенно свободная от питающих клеток и сыворотки изотоническая питательная среда с определенным составом, которая включает a. основную среду; b. инсулин в количестве bFGF, достаточном для поддержания роста существенно недифференцированных стволовых клеток млекопитающих; c. инсулин в количестве, достаточном для поддержания роста существенно недифференцированных стволовых клеток млекопитающих; и d. аскорбиновую кислоту в количестве, достаточном для поддержания роста существенно недифференцированных стволовых клеток млекопитающих.

В другом примере, WO 2005086845, описывается способ поддержания недифференцированных стволовых клеток, где упомянутый способ включает воздействие на стволовые клетки одним членом семейства белков трансформирующего ростового фактора-бета (TGF-β), одним членом семейства белков фактора роста фибробластов (FGF) или никотинамидом (NIC) в количестве, достаточном для поддержания клеток в недифференцированном состоянии в течение периода времени, достаточного для получения желаемого результата.

Плюрипотентные стволовые клетки могут быть высеяны на соответствующий культуральный субстрат. В одном из вариантов осуществления соответствующим культуральным субстратом является компонент внеклеточного матрикса, такой как, например, полученный из базальной мембраны или тот, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с участием молекулы адгезивного слоя. В одном из вариантов осуществления подходящим культуральным субстратом является MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® представляет собой растворимый препарат из клеток опухоли Энгельбрета-Холма-Суорма, который при комнатной температуре превращается в гель и образует восстановленную базальную мембрану.

В качестве альтернативы можно использовать другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. В зависимости от типа пролиферирующих клеток это может быть ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.п., по отдельности или в различных сочетаниях.

Плюрипотентные стволовые клетки могут высеиваться на субстрат с соответствующим распределением по поверхности и в присутствии среды, поддерживающей выживание, размножение и сохранение требуемых характеристик клеток. Все эти характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению клеток при посеве и могут быть определены специалистом в данной области.

Подходящая культуральная среда может быть изготовлена, например, из следующих компонентов: модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Gibco № 11965-092, нокаутная модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (KO DMEM), Gibco №10829-018, основная среда Хэма F12/50% DMEM, 200 мМ L-глутамина, Gibco № 15039-027; раствор неосновных аминокислот, Gibco 11140-050; β-меркаптоэтанол, Sigma № M7522; человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF), Gibco № 13256-029.

Формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток из плюрипотентных стволовых клеток

В одном варианте настоящее изобретение обеспечивает способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные линии поджелудочной эндодермы из плюрипотентных стволовых клеток, включающий следующие стадии:

a. Культивирование плюрипотентных стволовых клеток,

b. Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы,

c. Дифференцировка клеток, экспре