Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли

Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к новому применению антитела против CAPRIN-1 или его фрагмента в лекарственном средстве, таком как терапевтическое и/или профилактическое средство, против злокачественной опухоли.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Злокачественная опухоль является основной причиной смерти. Это заболевание в настоящее время лечат в основном с помощью хирургического вмешательства в комбинации с лучевой терапией или химиотерапией. Несмотря на развитие новых хирургических способов или открытие новых средств против злокачественной опухоли в последнее время, исход существующих способов лечения злокачественных опухолей улучшился в недостаточной мере, за исключением некоторых типов злокачественных опухолей. В результате последних достижений в молекулярной биологии и иммунологии злокачественных опухолей, были идентифицированы антитела, которые специфически взаимодействуют со злокачественными опухолями, антигены злокачественных опухолей, распознаваемые цитотоксическими Т-клетками, гены, кодирующие такие антигены злокачественных опухолей, что увеличило ожидания в отношении специфической терапии злокачественной опухоли, нацеленной на антигены злокачественных опухолей (непатентный документ 1).

Для уменьшения побочных эффектов терапии злокачественной опухоли, желательно, чтобы пептиды, полипептиды или белки, распознаваемые в качестве антигенов злокачественных опухолей, редко встречались в нормальных клетках, но специфически существовали в злокачественных клетках. В 1991 году, Boon et al (Ludwig Institute for Cancer Research, Belgium) выделили антиген меланомы человека MAGE 1, распознаваемый CD8-положительными Т-клетками, способом клонирования кДНК на основе экспрессии, используя линию аутологичных злокачественных клеток и Т-клетки, реактивные в отношении злокачественных опухолей (непатентный документ 2). В дальнейшем был описан способ SEREX (серологическая идентификация антигенов путем рекомбинантного клонирования на основе экспрессии), который основан на подходе клонирования генов на основе экспрессии, для идентификации опухолевых антигенов, распознаваемых антителами, продуцированными в ответ на аутологичную злокачественную опухоль in vivo у пациента со злокачественной опухолью (непатентный документ 3 и патентный документ 1). С помощью этого способа были выделены некоторые антигены злокачественных опухолей, которые редко экспрессируются в нормальных клетках, но специфически экспрессируются в злокачественных клетках (непатентные документы 4-9). Кроме того, проводятся клинические испытания клеточной терапии с использованием иммуноцитов, которые специфически взаимодействуют с антигенами злокачественных опухолей, или иммунотерапии, специфичной в отношении злокачественных опухолей, с использованием вакцин и т.п., содержащих антигены злокачественных опухолей.

В последние годы, во всем мире были выпущены различные лекарственные средства на основе антител для лечения злокачественных опухолей, которые нацелены на антигенные белки на злокачественных клетках. Эти лекарственные средства привлекли внимание вследствие их определенной эффективности в качестве терапевтических средств, специфичных к злокачественной опухоли. Однако большинство антигенных белков, на которые нацелены лекарственные средства, также экспрессируется на нормальных клетках. В результате введения антител повреждаются не только злокачественные клетки, но также и нормальные клетки, экспрессирующие антигены, что является неблагоприятным и приводит к побочным эффектам. Следовательно, можно ожидать, что если бы можно было идентифицировать антигены злокачественной опухоли, которые специфически экспрессируются на поверхности злокачественных клеток, и использовать антитела, нацеленные на такие антигены, в качестве лекарственных средств, тогда эти лекарственные средства на основе антител обеспечивали бы лечение, вызывая меньше побочных эффектов.

Цитоплазматический и ассоциированный с пролиферацией белок 1 (CAPRIN-1) известен в качестве внутриклеточного белка, который экспрессируется при активации или клеточном делении покоящихся клеток и формирует внутриклеточные стрессовые гранулы с внутриклеточными РНК для участия в регуляции транспорта и трансляции мРНК. Было обнаружено, что этот белок специфически экспрессируется на поверхности злокачественных клеток и, таким образом, его исследуют в качестве мишени для лекарственных средств на основе антител для лечения злокачественных опухолей (патентный документ 2).

Список литературы

Патентная литература

Патентный документ 1: Патент США №5698396

Патентный документ 2: WO 2010/016526

Непатентная литература

Непатентный документ 1: Tsuyoshi Akiyoshi, "Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy", 1997, Vol. 24, p. 511-519 (Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Publishers Inc., Japan)

Непатентный документ 2: Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647 (1991)

Непатентный документ 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813 (1995)

Непатентный документ 4: Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997)

Непатентный документ 5: Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998)

Непатентный документ 6: Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998)

Непатентный документ 7: Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999)

Непатентный документ 8: Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996)

Непатентный документ 9: Hum. Mol. Genet., 6: 33-39, 1997

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА

Задачей настоящего изобретения является получение антитела, которое нацелено на CAPRIN-1, специфически экспрессируемый на поверхности злокачественных клеток, и которое имеет улучшенную противоопухолевую активность по сравнению с общепринятыми антителами, и обеспечение применения антитела в качестве терапевтического и/или профилактического средства против злокачественной опухоли.

РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ

Настоящее изобретение имеет следующие аспекты:

Настоящее изобретение относится к антителу или его фрагменту, которое(ый) обладает иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1, причем антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 5, 6 и 7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 9, 10 и 11.

В другом варианте осуществления антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или биспецифическое антитело.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащей антитело или его фрагмент в качестве активного ингредиента.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак толстого кишечника, рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

Настоящее описание охватывает содержание заявки на патент Японии № 2011-171377, на основе которой испрашивается приоритет настоящей заявки.

ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Антитело против CAPRIN-1, используемое в рамках настоящего изобретения, повреждает злокачественные клетки. Таким образом, антитело против CAPRIN-1 применимо при лечении и/или профилактике злокачественной опухоли.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Антитело против полипептида CAPRIN-1, используемое в рамках настоящего изобретения, можно исследовать в отношении его противоопухолевой активности, как описано ниже, путем исследования in vivo ингибирования пролиферации опухоли у животного, имеющего злокачественную опухоль, или путем исследования ex vivo присутствия или отсутствия опосредуемой иммуноцитами или комплементом цитотоксической активности, которую проявляет антитело против опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид.

Антитело против CAPRIN-1, используемое в рамках настоящего изобретения, представляет собой моноклональное антитело, специфически связывающееся с белком CAPRIN-1. Такое моноклональные антитело может представлять собой любой тип антитела, которое может проявлять противоопухолевую активность, и включает, например, антитела не являющихся человеком животных (например, моноклональные антитела мыши, крысы, кролика и курицы), рекомбинантные антитела (например, синтетические антитела, полиспецифические антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела и одноцепочечные антитела (scFv)), антитела человека и фрагменты этих антител (например, Fab, F(ab')₂ и Fv). Эти антитела и их фрагменты могут быть получены способами, в основном известными специалистам в данной области. Если исследуемым индивидуумом является человек, антитело человека или гуманизированное антитело является предпочтительным для предотвращения или подавления отторжения.

Антитело представляет собой молекулу иммуноглобулина любого класса, например, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD или IgY, или любого подкласса, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2.

Кроме того, антитело может быть модифицировано ацетилированием, формилированием, амидированием, фосфорилированием, пегилированием и т.п., в дополнение к гликозилированию.

В этом контексте, выражение "специфически связывающееся с белком CAPRIN-1" означает, что антитело специфически связывается с белком CAPRIN-1 и по существу не связывается с другими белками.

Более того, исследуемым индивидуумом, которому проводят лечение и/или профилактику злокачественной опухоли в соответствии с настоящим изобретением, является млекопитающее, такое как человек, домашнее животное, скот или спортивное животное, предпочтительно человек.

Получение антигенов, получение антител и фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением будут рассмотрены ниже.

Получение антигена для получения антител

Белки или их фрагменты, используемые в качестве сенсибилизирующих антигенов для получения антитела против CAPRIN-1, используемого в рамках настоящего изобретения, не ограничиваются типом животного, служащего их источником, включая, например, людей, собак, крупный рогатый скот, лошадей, мышей, крыс или кур. Однако, белки или их фрагменты предпочтительно выбирают, принимая во внимание их совместимость с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток. Как правило, предпочтительными являются белки, происходящие из млекопитающих. В частности, предпочтительными являются белки, происходящие из человека. Например, если CAPRIN-1 представляет собой CAPRIN-1 человека, в качестве сенсибилизирующих антигенов можно использовать белки CAPRIN-1 человека, их частичные пептиды или клетки, экспрессирующие CAPRIN-1 человека.

Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности CAPRIN-1 человека и его гомологов могут быть получены, например, путем доступа в GenBank (NCBI, USA) и с использованием алгоритма BLAST или FASTA (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877,1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997).

В соответствии с настоящим изобретением, в тех случаях, когда нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 1 или 3) или аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 2 или 4) CAPRIN-1 человека используют в качестве основной последовательности, мишенями являются нуклеиновые кислоты или белки, состоящие из последовательности, на 70%-100%, предпочтительно, на 80%-100%, более предпочтительно, на 90%-100%, и, еще более предпочтительно, на 95%-100%, например, на 97%-100%, 98%-100%, 99%-100% или 99,5%-100%, идентичной нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности ORF или зрелой части эталонной последовательности. В этом контексте термин "% идентичность последовательностей" означает процент (%) числа идентичных аминокислот (или оснований), от общего числа аминокислот (или оснований), когда две последовательности выравнивают так, чтобы могла достигаться максимальная степень сходства или идентичность, с внесением пропусков или без него.

Фрагменты каждого белка CAPRIN-1 имеют длину в диапазоне от аминокислотной длины эпитопа (или антигенной детерминанты), который является наименьшей единицей, распознаваемой антителом, до менее чем полноразмерной длины этого белка. Эпитоп относится к полипептидному фрагменту, обладающему антигенностью или иммуногенностью у млекопитающих и, предпочтительно, у людей. Его наименьшая единица состоит приблизительно из 7-12 аминокислот, например, 8-11 аминокислот.

Полипептиды, содержащие указанный выше белок CAPRIN-1 человека и его частичные пептиды, могут быть синтезированы в соответствии со способами химического синтеза, такими как способ Fmoc (флуоренилметилоксикарбонил) или способ tBoc (трет-бутилоксикарбонил) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimentation Course in English) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japan), 1981). Также эти пептиды могут быть синтезированы общепринятыми способами с использованием целого ряда коммерчески доступных устройств для синтеза пептидов. Альтернативно можно получать полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, с использованием подходов генной инженерии, известных в данной области (Sambrook et al., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; и т.д.) и встраивать их в экспрессирующие векторы, которые затем вводят в клетки-хозяева, так чтобы клетки-хозяева продуцировали полипептиды. Таким образом, можно получить представляющие интерес полипептиды.

Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, легко могут быть получены с помощью подходов генной инженерии, известных в данной области, или общих способов с использованием коммерчески доступных устройств для синтеза нуклеиновых кислот. Например, ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность гена CAPRIN-1 человека, можно получать с помощью ПЦР с использованием хромосомной ДНК или библиотеки кДНК человека в качестве матрицы и пары праймеров, сконструированных так, чтобы они были способны амплифицировать нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. Условия реакции для этой ПЦР могут быть определены соответствующим образом. Примеры условий могут включать, но не ограничиваются ими, 30 циклов, каждый из которых вовлекает стадии реакции, состоящие из: 94°C в течение 30 секунд (денатурация); 55°C в течение от 30 секунд до 1 минуты (отжиг); и 72°C в течение 2 минут (элонгация) с использованием термостабильной ДНК полимеразы (например, Taq-полимераза, Pfu-полимераза) и Mg²⁺-содержащего буфера для ПЦР, с последующей реакцией при 72°C в течение 7 минут. Подход ПЦР, условия и т.д. описаны, например, в Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (в частности, глава 15).

Также можно получать соответствующие зонды и праймеры на основе информации о нуклеотидных последовательностях гена CAPRIN-1 и аминокислотных последовательностях белка CAPRIN-1 и использовать при скрининге, например, библиотеки кДНК человека, для выделения желаемой ДНК. Предпочтительно такую библиотеку кДНК получают из клеток, органов или тканей, экспрессирующих белок CAPRIN-1. Примеры таких клеток или тканей включают клетки или ткани из семенников или из злокачественных опухолей, или из опухолей, таких как лейкоз, рак молочной железы, лимфома, опухоль головного мозга, рак легких, рак поджелудочной железы и рак толстой кишки. Эти действия, включающие получение зондов или праймеров, конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование представляющего интерес гена, известны специалистам в данной области, и они могут быть выполнены в соответствии со способами, описанными, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989) и Ausbel et al. (ibid.). Из ДНК, полученных таким образом, можно получать ДНК, кодирующие белки CAPRIN-1 человека и их частичные пептиды.

Клетки-хозяева могут представлять собой любую клетку, способную экспрессировать указанные выше полипептиды. Примеры прокариотических клеток включают, но не ограничиваются ими, E. coli. Примеры эукариотических клеток включают, но не ограничиваясь ими: клетки млекопитающих, такие как клетки почки обезьяны COS1 и клетки яичников китайского хомячка CHO; линию клеток эмбриональной почки человека HEK293; линию клеток эмбриональной кожи мыши NIH3T3; клетки дрожжей, такие как почкующиеся дрожжи и делящиеся клетки дрожжей; клетки тутового шелкопряда; и яйцеклетки Xenopus.

В тех случаях, когда прокариотические клетки используют в качестве клеток-хозяев, используемый экспрессирующий вектор имеет ориджин, который позволяет репликацию в прокариотических клетках, промотор, участок связывания с рибосомой, участок множественного клонирования, терминатор, ген устойчивости к лекарственному средству, ген ауксотрофной комплементарности и т.п. Примеры экспрессирующих векторов для E. coli могут включать серию pUC, pBluescript II, экспрессирующие системы pET и экспрессирующие системы pGEX. ДНК, кодирующую указанные выше полипептиды, можно встраивать в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют прокариотические клетки-хозяева, а затем полученные трансформанты культивируют так, чтобы полипептиды, кодируемые этими ДНК, экспрессировались в прокариотических клетках-хозяевах. При этом, полипептиды могут быть экспрессированы в качестве белков, слитых с другими белками.

В тех случаях, когда в качестве клеток-хозяев используют эукариотические клетки, в качестве экспрессирующих векторов используют экспрессирующие векторы для эукариотических клеток, имеющие промотор, область сплайсинга, участок добавления поли(А) и т.п. Примеры таких экспрессирующих векторов включают pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 и pYES2. Аналогично тому, как описано выше, ДНК, кодирующую указанные выше полипептиды, можно встраивать в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют эукариотические клетки-хозяева, а затем полученные трансформанты культивируют так, чтобы в эукариотических клетках-хозяевах экспрессировались полипептиды, кодируемые этими ДНК. В тех случаях, когда используют экспрессирующие векторы, такие как pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1 или pEGFP-C1, полипептиды могут быть экспрессированы в качестве различных слитых белков, меченных His-меткой (например, (His)₆-(His)₁₀), FLAG-меткой, myc-меткой, HA-меткой, GFP и т.п.

Экспрессирующие векторы можно вводить в клетки-хозяева с использованием хорошо известных способов, таких как электропорация, способ с использованием фосфата кальция, способ с использованием липосом, способ с использованием DEAE декстрана, микроинъекция, инфицирование вирусом, липофекция и связывание с пептидом, проникающим через клеточную мембрану.

Представляющий интерес полипептид можно выделять и очищать из клеток-хозяев с помощью комбинации способов разделения, известных в данной области. Их примеры включают, но не ограничиваются ими, обработку денатурирующим веществом (например, мочевина) или детергентом, обработку ультразвуком, ферментативное расщепление, высаливание, фракционирование растворителем и преципитацию, диализ, центрифугирование, ультрафильтрацию, гель-фильтрацию, SDS-PAGE, изоэлектрофокусирующий электрофорез, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию и обращено-фазовую хроматографию.

Структура антитела

В основном, антитела представляют собой гетеромультимерные гликопротеины, содержащие по меньшей мере две тяжелые цепи и две легкие цепи. Иммуноглобулины, отличные от IgM, являются гетеротетрамерными гликопротеинами размером приблизительно 150 кДа, каждый из которых содержит две идентичные легкие (L) цепи и две идентичные тяжелые (H) цепи. Обычно, каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью посредством одной ковалентной дисульфидной связи, хотя количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует среди различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая цепь и легкая цепь также имеет внутрицепочечную дисульфидную связь. Каждая тяжелая цепь имеет вариабельный домен (область VH) на одном конце, за которым следует несколько последовательно расположенных константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (область VL) на одном конце и имеет одну константную область на другом конце. Константная область легкой цепи расположена параллельно первой константной области тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи расположен параллельно вариабельному домену тяжелой цепи. Конкретные области вариабельного домена антитела, которые называются "определяющими комплементарность областями (CDR)", демонстрируют специфическую вариабельность и придают антителу специфичность связывания. Относительно консервативные участки в вариабельной области называются "каркасными областями (FR)". Каждый полный вариабельный домен тяжелой цепи и легкой цепи содержит четыре FR, соединенные друг с другом посредством трех CDR. Эти три CDR обозначаются как CDRH1, CDRH2 и CDRH3, соответственно, в указанном порядке от N-конца тяжелой цепи. Аналогично, в легкой цепи CDR обозначаются как CDRL1, CDRL2 и CDRL3. CDRH3 наиболее важна для специфичности связывания антитела с его антигеном. Кроме того, CDR в каждой цепи удерживаются вблизи друг от друга FR областями, и они вносят вклад в формирование антигенсвязывающего центра в антителе вместе с CDR на другой цепи. Константные области непосредственно не вносят вклад в связывание антитела с антигеном, однако они проявляют различные эффекторные функции, например, вовлечение в антителозависимую клеточноопросредованную цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, опосредуемый связыванием с Fcγ-рецептором, период полужизни/скорость выведения через неонатальный Fc рецептор (FcRn), и комплементзависимую цитотоксичность (CDC) через компонент C1q в каскаде реакций системы комплемента.

Получение антитела

Антитело против CAPRIN-1 в соответствии с настоящим изобретением означает антитело, обладающее иммунологической реактивностью в отношении полноразмерного белка CAPRIN-1 или его фрагмента.

В этом контексте "иммунологическая реактивность" означает свойство связывания антитела с антигеном CAPRIN-1 in vivo. Посредством такого связывания антитело проявляет функцию повреждения (например, гибель, подавление или регрессия) опухоли. В частности, тип антитела, используемого в рамках настоящего изобретения, не ограничивается при условии, что антитело может повреждать опухоли, такие как рак молочной железы рак почки, рак поджелудочной железы, рак толстого кишечника, рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфома, фибросаркома, мастоцитома или меланома, в результате связывания с белком CAPRIN-1.

Ниже приведены примеры получения различных моноклональных антител.

Например, клеточные линии рака молочной железы SK-BR-3, экспрессирующие CAPRIN-1, вводят каждой мыши для иммунизации. Из такой мыши извлекают селезенку. После выделения клеток селезенки, клетки подвергают слиянию с клетками миеломы мыши. Из полученных слитых клеток (гибридом) выбирают клоны, продуцирующие антитела, обладающие антипролиферативным эффектом на злокачественную опухоль. Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, обладающие антипролиферативным эффектом на злокачественные клетки, выделяют и культивируют. Представляющее интерес антитело может быть получено путем очистки из культурального супернатанта обычным способом аффинной очистки.

Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, можно получать, например, следующим образом: сначала животных иммунизируют сенсибилизирующим антигеном способом, известным в данной области. Этот способ иммунизации обычно вовлекает внутрибрюшинную или подкожную инъекцию сенсибилизирующих антигенов млекопитающим. В частности, сенсибилизирующие антигены разбавляют или суспендируют в PBS (фосфатно-буферный солевой раствор), физиологическом растворе и т.п. до получения в результате подходящего количества, а затем смешивают, если желательно, с соответствующим количеством общепринятого адъюванта, например, полного адъюванта Фрейнда. После эмульгирования полученную эмульсию вводят каждому млекопитающему несколько раз каждые от 4 до 21 суток. Альтернативно для иммунизации сенсибилизирующими антигенами можно использовать подходящий носитель.

После подтверждения увеличения уровня желаемого антитела в сыворотке млекопитающего, иммунизированного таким образом, иммуноциты собирают от млекопитающего и подвергают слиянию клеток. Предпочтительные примеры иммуноцитов, в частности, включают клетки селезенки.

В качестве родительских клеток-партнеров, подлежащих слиянию с иммуноцитами, используют клетки миеломы млекопитающих. В качестве клеток миеломы предпочтительно используют различные клеточные линии, известные в данной области, например, P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976). 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), и R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).

Слияние клеток между иммуноцитами и клетками миеломы можно проводить в основном в соответствии со способом, известным в данной области, например, способом Kohler и Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Более конкретно, слияние клеток проводят, например, в присутствии фактора, стимулирующего слияние клеток, в общепринятой питательной среде. Например, в качестве фактора, стимулирующего слияние клеток, используют полиэтиленгликоль (PEG) и японский гемагглютинирующий вирус (HVJ). При желании, для повышения эффективности слияния можно дополнительно добавлять вспомогательное вещество, такое как диметилсульфоксид.

Соотношение между иммуноцитами и используемыми клетками миеломы может быть выбрано произвольно. Например, количество иммуноцитов предпочтительно выбирают так, чтобы оно превышало количество клеток миеломы в 1-10 раз. Примеры среды, которую можно использовать для слияния клеток, включают среду RPMI1640 и среду МЕМ, пригодные для роста линий клеток миеломы, а также другие общепринятые среды, используемые для этого типа клеточной культуры. Далее, в комбинации с этими средами можно использовать добавку на основе сыворотки, такую как эмбриональная сыворотка теленка (FCS).

Для слияния клеток иммуноциты и клетки миеломы хорошо перемешивают в заранее определенном количестве среды. Обычно к смеси добавляют раствор РЕС (средняя молекулярная масса приблизительно от 1000 до 6000), предварительно нагретый приблизительно до 37°C, в концентрации от 30% до 60% (масс./об.), и перемешивают с ним для формирования представляющих интерес гибридом. После этого осуществляют повторяющиеся действия, состоящие в последовательном добавлении соответствующей среды и удалении супернатанта посредством центрифугирования для удаления агентов слияния клеток и т.п., которые не являются благоприятными для роста гибридом.

Полученные таким образом гибридомы культивируют в общепринятой селективной среде, например, среде HAT (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин) для селекции. Культивирование в среде HAT продолжают в течение периода времени (как правило, от нескольких суток до нескольких недель), достаточного для гибели клеток (неслитых клеток), отличных от представляющих интерес гибридом. Далее, проводят скрининг гибридом, продуцирующих представляющее интерес антитело, и клонирование в качестве единичных клонов общепринятым способом лимитирующих разведений.

В дополнение к такому получению гибридом путем иммунизации не являющихся человеком животных антигенами, гибридомы, продуцирующие антитела человека, обладающие желаемой активностью (например, антипролиферативной активностью в отношении клеток), можно получать путем сенсибилизации лимфоцитов человека, например, инфицированных вирусом EB лимфоцитов человека, белками, экспрессирующими белок клетками или их лизатами in vitro, и слияния сенсибилизированных лимфоцитов с происходящими из человека клетками миеломы, способными постоянно делиться, например, U266 (номер доступа № TIB196).

Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, полученные таким образом, можно субкультивировать в общепринятой среде и также можно хранить в жидком азоте в течение длительного периода времени.

В частности, желаемые антигены или клетки, экспрессирующие желаемые антигены, используют в качестве сенсибилизирующих антигенов при иммунизации в соответствии с общепринятым способом иммунизации. Полученные иммуноциты подвергают слиянию с родительскими клетками, известными в данной области, в соответствии с общепринятым способом слияния клеток. Клетки (гибридомы), продуцирующие моноклональное антитело, можно подвергать скринингу общепринятым способом скрининга для получения представляющего интерес антитела.

В этом контексте, например, мыши KM (Kirin Pharma Co., Ltd./Medarex) или мыши XenoMouse (Amgen Inc.) известны в качестве мышей, продуцирующих антитела человека (например, международные публикации № WO02/43478 и WO02/092812). Из крови таких мышей, иммунизированных белками CAPRIN-1 или их фрагментами, можно получить полные поликлональные антитела человека. Альтернативно из мышей, иммунизированных таким образом, можно выделять клетки селезенки и подвергать слиянию с клетками миеломы. Таким образом, можно получать моноклональные антитела человека.

Антигены можно получать, например, способом с использованием клеток животных (публикация патента Японии (Kohyo) № 2007-530068) или способом с использованием бакуловируса (например, международная публикация № WO98/46777). Антигены, обладающие низкой иммуногенностью, могут быть связаны с иммуногенными макромолекулами, такими как альбумин, для иммунизации.

Альтернативно можно использовать рекомбинантные антитела, получаемые с использованием способа рекомбинации генов, который вовлекает клонирование генов антител из гибридом; встраивание генов антител в соответствующие векторы; и введение векторов в хозяев (см., например, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). В частности, кДНК вариабельной области (V-область) антитела синтезируют из мРНК гибридом с использованием обратной транскриптазы. После получения ДНК, кодирующей представляющие интерес V-области, ДНК лигируют с ДНК, кодирующей желаемые константные области антитела (C-области). Полученные в результате продукты лигирования встраивают в экспрессирующие векторы. Альтернативно, ДНК, кодирующие V-область антитела, можно встраивать в экспрессирующие векторы, содержащие ДНК С-области антитела. Эти ДНК встраивают в экспрессирующие векторы таким образом, чтобы они экспрессировались под контролем областей контроля экспрессии, например, энхансера или промотора. Далее, клетки-хозяева можно трансформировать полученными экспрессирующими векторами и позволять им экспрессировать антитела.

Как описано выше, антитело против CAPRIN-1 по настоящему изобретению представляет собой любое из различных моноклональных антител, включающих моноклональные антитела не являющегося человеком животного, моноклональные антитела человека и рекомбинантные антитела.

Эти моноклональные антитела не являющихся человеком животных или человека можно получать культивированием гибридом, полученных слиянием между клетками селезенки не являющихся человеком животных (например, мышей, мышей, продуцирующих антитела человека, кур или кроликов), иммунизированных белками CAPRIN-1, и клетками миеломы.

Рекомбинантное антитело включает, как описано выше, химерные антитела, гуманизированные антитела, одноцепочечные антитела, полиспецифические антитела и т.п.

Химерное антитело можно получать путем: лигирования ДНК, кодирующих вариабельные области легкой или тяжелой цепи антитела, происходящего из не являющегося человеком животного (например, мыши, крысы, кролика или курицы), с ДНК, кодирующими константные области легкой или тяжелой цепи, происходящие из антитела человека; встраивания полученных слитых генов в экспрессирующие векторы; и введения векторов в хозяев, так чтобы продуцировались антитела.

В частности, химерное антитело представляет собой, например, антитело, состоящее из вариабельных областей тяжелых и легких цепей антител мыши и константных областей тяжелой и легкой цепей антител человека. Химерное антитело можно получать с использованием способа, известного в данной области, который вовлекает, например: лигирование ДНК, кодирующих V-области антитела мыши, с ДНК, кодирующими C-области антитела человека; встраивание полученных продуктов лигирования в экспрессирующие векторы; и введение векторов в хозяев, так чтобы продуцировались антитела. В описанных ниже примерах получали химерные антитела человека-мыши и было подтверждено, что они обладают противоопухолевым эффектом. Эти моноклональные антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, где VH-область содержит CDR1, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, CDR2, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и CDR3, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, и VL-область содержит CDR1, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, CDR2, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, и CDR3, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11.

Гуманизированное антитело, также называемое реконструированным антителом человека, представляет собой антитело, полученное способами инженерии. Гуманизированное антитело конструируют путем пересадки в CDR антитела человека CDR, соответствующих антителу, происходящему из иммунизированного животного. В частности, получают ДНК, в которых кодирующие последовательности CDR в ДНК, кодирующих происходящую из антитела человека вариабельную область легкой или тяжелой цепи, заменены на соответствующие кодирующие последовательности CDR антитела, происходящего из не являющегося человеком животного (например, мыши, крысы, кролика или курицы), и лигируют их с ДНК, кодирующими константные области легкой или тяжелой цепи, происходящие из антитела человека. Полученные слитые гены можно включать в экспрессирующие векторы, которые затем вводят в хозяев для продукции антител с целью получения представляющего интерес гуманизированного антитела.

В частности, например, последовательность ДНК, сконструированную таким образом, чтобы связать CDR антител мыши и курицы с каркасными областями (FR) антитела человека, синтезируют с помощью ПЦР с использованием нескольких олигонуклеотидов, полученных таким образом, чтобы они имели концевые части, перекрывающиеся друг с другом. Полученные ДНК лигируют с ДНК, кодирующими константные области антител человека. Затем полученные продукты лигирования встраивают в экспрессирующие векторы, которые затем вводят в хозяев для продукции антител с целью получения представляющего интерес антитела (см. публикацию патентной заявки Европы № EP239400 и международную публикацию № WO96/02576). FR антитела человека, соединенные через CDR, выбирают так, чтобы CDR образовывали подходящий антигенсвязывающий центр. При необходимости, аминокислоты в каркасных областях вариабельных областей антитела могут быть заменены таким образом, чтобы CDR в полученном в реконструированном антителе человека образовывали соответствующий антигенсвязывающий центр (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856). Кроме того, эти каркасные области могут быть заменены каркасными областями, происходящими из различных антител человека (см. международную публикацию № WO99/51743).

Каркасные области антитела человека, соединенные через CDR, выбирают так, чтобы CDR образовывали подходящий антигенсвязывающий центр. При необходимости, аминокислоты в каркасных областях вариабельных областей антитела могут быть заменены таким образом, чтобы CDR полученного реконструированного антитела человека образовывали соответствующие антигенсвязывающие центры (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856).

Одноцепочечное антитело относится к антителу или его фрагменту, содержащим вариабельные области тяжелой и легкой цепей, линейно связанные друг с другом через линкер. ДНК, кодирующую одноцепочечное антитело, можно получать путем лигирования ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, ДНК, код