Составы рекомбинантного фурина

Составы рекомбинантного фурина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет Предварительной Заявки U.S. No. 61/492,712, поданной 2 июня 2011 года, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки во всей его полноте и во всех смыслах.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ОПИСАНИЯ

[0002] Это описание, главным образом, относится к области протеиновых составов.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Семейство протеолитических субтилизин-подобных протеиновых конвертаз млекопитающих (SPC или PC) являются гомологичными с бактериальными субтилизинами и дрожжами Кех2р. На сегодняшний день были определены семь различных членов семейств SPC, включая фурин, РС1 (также известный как РС3), РС2, РАСЕ4, РС4, РС5 (также известный как РС6), PC7 (LPC, РС8 или SPC7), каждый из которых проявляет уникальное распределение в тканях.

[0004] Фурин, также называемый РАСЕ (спаренный с щелочным аминокислотным расщепленным энзимом) повсеместно экспрессируется во всех тканях млекопитающих и клеточных линиях и способен обрабатывать широкий спектр биологически активных прекурсорных белков в секреторный путь, включая, в том числе, гормоны, факторы роста, рецепторы, вирусные и бактериальные белки и плазменные белки. Это кальций-зависимая серии ендопротеаза, структурно расположенная в нескольких доменах, а именно сигнальный пептид, пропептид, каталитический домен, средний домен, (также именуемый гомо-В или Р-домен), С-терминально расположенный цистеин-богатый домен, трансмембранный домен и внутриклеточный концевой сегмент. Сайт расщепления фурина протеазы содержит последовательность распознавания, которая характеризуется аминокислотной послдеовательностью Arg-X-Lys/Arg-Arg (Hosaka и др., J Biol Chem. 1991;266:12127-30).

[0005] Фурин принадлежит к семейству про-белковых конвертаз и зависит от кальция (Са²⁺). Фурин специфически расщепляет С-терминальную пептидную связь аргинина в определенной последовательности, содержащей аргинин в положениях -1 и -4. Эта последовательность может быть найдена в многочисленных белках человека, показывая, что фурин играет важную роль в созревании ряда про-белков человека. Соответственно, фурин представляет собой пропротеин конвертазу, которая перерабатывает латентные белки предшественники в их биологически активные продукты. Фурин представляет собой кальций-зависимую серии эндопротеазу, которая расщепляет белки предшественники на их парные основные аминокислотные сайты процессинга. Одним субстратом для фурина является фактор фон Виллебранда (vWF).

[0006] Фурин (к примеру, рфурин) является способным к превращению про-VWF (προ-фактор фон Виллебранда) в зрелый VWF посредством расщепления Arg741-Ser742 пептидной связи VWF. Этот этап созревания является частью, к примеру, процесса обработки rVWF, который обеспечивает лечение такой болезни фон Виллербанда Типа В. Производства активированных рекомбинантных белков имеет высокую клиническую и диагностическую важность. К примеру, активные или зрелые белки, такие как зрелый VWF, могут быть использованы для контроля сворачивания крови.

[0007] Составы фурина, в частности составы рекомбинантного фурина (рфурин), зачастую имеют малый срок годности (менее чем 6 месяцев) в связи с потерей активности рфурина от разрушения белка (зачастую от саморасщепления белка фурина). Кроме того, при использовании в определенных производственных процессах, таких как производство зрелого vWF, составы рфурина разбавляют, часто в 200 раз, и разбавленный рфурин, главным образом, показывает непропорциональное снижение активности. Соответственно, существует потребность в области способов и составов, которые стабилизируют композиции фурина (к примеру, рфурин), а также способы разбавления композиций коцентрированного фурина (к примеру, рфурин), не теряя значительную часть активности фурина.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] Настоящее описание изобретения удовлетворяет эти и другие потребности в области состава фурина (к примеру, рфурина), хранения и обработки посредством предоставления способов и составов для стабилизации фурина (к примеру, композиций рфурина). Эти потребности удовлетворяются, по крайней мере, частично, посредством открытия того, что добавление сахара, сахарных спиртов и/или неионных поверхностно-активных веществ значительно повышает стабильность композиций фурина (к примеру, рфурина) во время хранения и механического воздействия.

[0009] Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает высокостабилизированные составы фурина, в частности высокостабилизированные составы рфурина, которые демонтрируют повышенную устойчивость в условиях повышенной температуры, перемешивания и различных рН по сравнению с начальными (контрольными) составами фурина.

[0010] В одном аспекте, настоящее описание обеспечивает стабилизированную водную композицию рекомбинантного фурина (рфурина), композиция содержит: от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина; от 100 ммоль до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли; от 0.5 ммоль до 2 ммоль кальция; от 2% до 20% сахара или сахарного спирта; от 10 до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества; от 10 до 200 ммоль буферного вещества; и значение рН от 5.5 до 7.5.

[0011] В одном воплощении композиции, обеспеченные выше, включают от 150 ммоль до 250 ммоль фармацевтически приемлемой соли. В другом воплощении, композиции, обеспеченные выше, включают 190±10 ммоль фармацевтически приемлемой соли. В другом воплощении, композиции, обеспеченные выше, включают 190 ммоль фармацевтически приемлемой соли.

[0012] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия. В другом воплощении композиций, обеспеченных выше, фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид калия.

[0013] В одном воплощении композиции, обеспеченные выше, включают 0.9±0.2 ммоль кальция. В другом воплощении, композиции, обеспеченные выше, включают 0.92 ммоль кальция.

[0014] В одном воплощении композиции, обеспеченные выше, включают от 5% до 15% сахара или сахарного спирта. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, включают 10±2% сахара или сахарного спирта. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, включают 10% сахара или сахарного спирта.

[0015] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, сахар или сахарный спирт выбран из группы, которая состоит из сахарозы, трегалозы, маннита и их комбинаций. В другом воплощении композиций, обеспеченных выше, сахар или сахарный спирт представляет собой трегалозу. В другом воплощении композиций, обеспеченных выше, сахар или сахарный спирт представляет собой сахарозу.

[0016] В одном воплощении композиции, обеспеченные выше, включают от 10 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, включают от 50 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, включают 75 ppm неионного поверхностно-активного вещества.

[0017] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80.

[0018] В одном воплощении композиции, обеспеченные выше, включают от 50 ммоль до 150 ммоль буферного вещества. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, включают 90±10 ммоль буферного вещества. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, включают 91 ммоль буферного вещества.

[0019] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, буферное вещество содержит ацетат.В другом воплощении композиций, обеспеченных выше, буферное вещество содержит HEPES. В другом воплощении композиций, обеспеченных выше, буферное вещество содержит MES. В другом воплощении композиций, обеспеченных выше, буферное вещество содержит ацетат и HEPES.

[0020] В одном воплощении, композиции, обеспеченные выше, включают от 25 ммоль до 75 ммоль ацетата и от 25 до 75 ммоль HEPES. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, включают 45±5 ммоль ацетата и 45±5 ммоль HEPES. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, включают 45 ммоль ацетата и 46 ммоль HEPES.

[0021] В одном воплощении композиции, обеспеченные выше, имеют значение рН от 5.5 до 7.0. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, имеют значение рН от 5.5 до 6.5. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, имеют рН 6.0±0.2. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, имеют рН 6.0.

[0022] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, композиция имеет повышенную стабильность при хранении при 37°С по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит сахара или сахарного спирта.

[0023] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, композиция сохраняет високий процент активности рфурина при хранении при 37°С по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит сахара или сахарного спирта.

[0024] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, композиция сохраняет высокий процент содержания мономера рфурина при хранении при 37°С по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит сахара или сахарного спирта.

[0025] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, композиция имеет повышенную стабильность при перемешивании по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит неионное поверхностно-активное вещество.

[0026] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, композиция сохраняет высокий процент активности фурина при перемешивании по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит неионное поверхностно-активное вещество.

[0027] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, композиция сохраняет высокий процент содержания мономера рфурина при перемешивании по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит неионное поверхностно-активное вещество.

[0028] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, композиция имеет повышенную стабильность при разбавлении по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит неионное поверхностно-активное вещество.

[0029] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, композиция сохраняет высокий процент активности рфурина при разбавлении по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит неионное поверхностно-активное вещество.

[0030] В одном воплощении композиций, обеспеченных выше, композиция сохраняет высокий процент содержания мономера рфурина при разбавлении по сравнению с композицией рфурина, которая не содержит неионное поверхностно-активное вещество.

[0031] В одном аспекте, настоящее описание обеспечивает стабилизированные водные композиции рекомбинантного фурина (рфурина), композиция содержит: от 8,000 Ед/мл до 500,000 Ед/мл рфурина; 190 ммоль хлорида натрия; 0.92 ммоль кальция; 10% трегалозы; 75 ppm полисорбата-80; 45 ммоль уксусной кислоты; 46 ммоль HEPES; и значение рН от 5.5 до 7.5.

[0032] В одном воплощении композиции, обеспеченные выше, имеют значение рН от 5.5 до 7.0. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, имеют значение рН от 5.5 до 6.5. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, имеют рН 6.0±0.2. В другом воплощении композиции, обеспеченные выше, имеют рН 6.0.

[0033] В одном аспекте, настоящее описание обеспечивает способ разбавления водной композиции рфурина, где способ включает добавление буфера разбавления, содержащего от 10 ppm до 200 ppm неионного поверхностно-активного вещества в водную композицию рфурина, образуя при этом разбавленную композицию рфурина.

[0034] В одном воплощении способов, обеспеченных выше, буфер разбавления содержит от 10 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В другом воплощении способов, обеспеченных выше, буфер разбавления содержит от 50 ppm до 100 ppm неионного поверхностно-активного вещества. В другом воплощении способов, обеспеченных выше, буфер разбавления содержит 75 ppm неионного поверхностно-активного вещества.

[0035] В одном воплощении способов, обеспеченных выше, буфер разбавления имеет значение рН от 5.5 до 7.5. В другом воплощении способов, обеспеченных выше, буфер разбавления имеет значение рН от 5.5 до 6.5. В другом воплощении способов, обеспеченных выше, буфер разбавления имеет значение рН 6.0±0.2. В другом воплощении способов, обеспеченных выше, буфер разбавления имеет значение рН 6.0.

[0036] В одном воплощении способов, обеспеченных выше, разбавленная композиция рфурина содержит по крайней мере 50% активности рфурина в водной композиции рфурина до разбавления.

[0037] В одном воплощении способов, обеспеченных выше, разбавленная композиция рфурина содержит по крайней мере 75% активности рфурина в водной композиции рфурина до разбавления.

[0038] В одном аспекте, настоящее описание обеспечивает высокостабилизированный состав рекомбинантного фурина (рфурина), указанный состав содержит: 8,000-52,000 Ед/мл рфурина; от 1 ммоль до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли; 0.1 ммоль до 2 ммоль хлорида кальция; от 1% до 20% сахара и/или дигидрата сахара; от 50 до 100 ppm поверхностно-активного вещества; и от 1 ммоль до 100 ммоль карбоновой кислоты, буферное вещество в концентрации, достаточной для поддержания значения рН 4.0-7.0, или оба указанную карбоновую кислоту и указанное буферное вещество.

[0039] В одном воплощении составы, обеспеченные выше, включают 180-200 ммоль соли.

[0040] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, соль представляет собой хлорид натрия.

[0041] В одном воплощении составы, обеспеченные выше, включают 0.5-1.0 ммоль кальция.

[0042] В одном воплощении составы, обеспеченные выше, включают 5-15% сахара или дигидрат сахара.

[0043] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, сахар или дигидрат сахара является выбранным из группы, которая состоит из сахарозы, трегалозы, маннита и их комбинаций.

[0044] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-80.

[0045] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, поверхностно-активное вещество присутствует в концентрации от около 65 до около 85 ppm.

[0046] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, карбоновая кислота представляет собой уксусную кислоту.

[0047] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, карбоновая кислота находится в концентрации 35-55 ммоль.

[0048] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, буферное вещество представляет собой HEPES.

[0049] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, буферное вещество находится в концентрации от около 20 до около 100 ммоль.

[0050] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, состав демонстрирует улучшенную стабильность после хранения при 37°С по сравнению с составом, который не содержит сахар или дигидрат сахара.

[0051] В одном воплощении составов, обеспеченных выше, состав получают путем добавления рфурина в композицию, которая содержит 1% полисорбата-80, 500 ммоль HEPES, 400 ммоль уксусной кислоты, 1 ммоль хлорида кальция и порошка дигидрата трегалозы, в котором указанный состав имеет значение рН 6.0 перед добавлением в указанный рфурин.

[0052] В одном аспекте настоящее описание обеспечивает высокостабилизированный состав рекомбинантного фурина (рфурина), указанный состав содержит: 8,000-57,000 Ед/мл рфурина; 190 ммоль хлорида натрия; 0.92 ммоль хлорида кальция; 10% вес/вес дигидрата трегалозы; 75 ppm полисорбата-80; 45 ммоль уксусной кислоты и 46 ммоль HEPES.

[0053] В одном аспекте, настоящее описание обеспечивает высокостабилизированный состав рекомбинантного фурина (рфурина), который содержит: (а) 8,000-52,000 Ед/мл рфурина; (b) от 1 ммоль до 300 ммоль фармацевтически приемлемой соли; (с) от 0.1 ммоль до 2 ммоль хлорида кальция; (d) от 1% до 20% сахара и/или дигидрата сахара; (е) от 50 до 100 ppm поверхностно-активного вещества; и (f) от 1 ммоль до 100 ммоль карбоновой кислоты или буферного вещества в концентрации, достаточной для поддержания значения рН 4.0-7.0 или оба, и карбоновую кислоту, и буферное вещество.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0054] Фигура 1. рФурин в контрольном составе - исследование температуры, проанализированное с использованием теста активности фурина. Образцы рфурина в контрольном составе были инкубированы при: комнатной температуре, 37°С или 45°С на период до семи дней. Активность образцов рфурина проиллюстрирована в зависимости от количества дней инкубации. Величины погрешностей составляют ±1 стандартной девиации; n=4.

[0055] Фигура 2. рФурин в контрольном составе - исследование температуры, проанализированное с использованием SEC. Те же образцы, как на ФИГ. 1, были проанализированы с использованием SEC. Относительные пиковые значения рфурина проиллюстрированы в зависимости от количества дней инкубации. Относительные пиковые значения были вычислены как процентное содержание пиков рфурина в нулевой момент времени.

[0056] Фигура 3. рФурин в контрольном составе, инкубированном при 37°С, проанализирован с использованием SEC. Образцы рфурина в контрольном составе были инкубированы при 37°С в течение семи дней. Фигура 3 иллюстрирует наложение профилей поглощения SEC при 280 нм в шести моментах времени. Такое же исследование как на ФИГ. 1.

[0057] Фигура 4. рФурин в контрольном составе, инкубированном при комнатной температуре и 37°С, проанализирован с использованием Вестерн-блоттинга. Такие же исследования, как на ФИГ. 1. Полоса: (1) MWM маркер; (2) Τ=0; (3) рфурин, инкубированный при комнатной температуре в течение 1 дня; (4) рфурин, инкубированный при комнатной температуре в течение 2 дней; (5) рфурин, инкубированный при комнатной температуре в течение 3 дней; (6) рфурин, инкубированный при комнатной температуре в течение 7 дней; (7) MWM маркер; (8) рфурин, инкубированный при 37°С в течение 1 дня; (9) рфурин, инкубированный при 37°С в течение 2 дней; (10) рфурин, инкубированный при 37°С в течение 3 дней; и (11) рфурин, инкубированный при 37°С в течение 7 дней.

[0058] Фигура 5. рФурин в контрольном составе - исследования замораживания/оттаивания, проанализированные с использованием теста активности фурина. Активность рфурина показана в зависимости от количества циклов замораживания/оттаивания. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0059] Фигура 6. рФурин в контрольном составе - исследования замораживания/оттаивания, проанализированные с использованием SEC. Пиковые значения рфурина показаны в зависимости от количества циклов замораживания/оттаивания.

[0060] Фигура 7. рФурин в контрольном составе - стадия перемешивания, проанализированная с использованием теста активности. Активность рфурина показана в зависимости от времени перемешиваниия. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0061] Фигура 8. рФурин в контрольном составе - стадия перемешивания, проанализированная с использованием SEC. Пиковые значения рфурина показаны в зависимости от времени перемешиваниия.

[0062] Фигура 9. Сравнение различных долей рфурина с использованием способа Вестерна-блоттинга. Различные доли рфурина были проанализированы с использованием способа Вестерна-блоттинга. Порядок представления обозначается по алфавиту. Полоса: (1) MWM маркер; (2) пример фурина; (3) 03-04-09 (партия 018342, 2 мл сосуд); (4) 03-08-09 (партия 018365, 2 мл сосуд); (5) 03-15-09 (партия 018366, 2 мл сосуд); (6) 03-01-09 (партия 018315, 2 мл сосуд); (7) 07-26-10 (партия Х572, 200 мл бутылка); (8) 03-06-09 (партия 018365, 200 мл бутылка); (9) 08-01-10 (партия Х576, 200 мл бутылка); (10) 03-09-09 (партия 018366, 200 мл бутылка); (11) MWM маркер; (12) пример фурина; (13) 08-03-10 (партия Х577, 200 мл бутылка); (14) 07-24-10 (партия Х573, 200 мл бутылка); (15) 07-30-10 (партия Х575, 200 мл бутылка); (16) 018346 (QC Стабильность при -80°С); (17) 018346 (QC Стабильность при -25°С); (18) 018315 (QC Стабильность при -80°С); и (19) 018315 (QC Стабильность при -25°С).

[0063] Фигура 10. Влияние способа оттаивания на активность рфурина, проанализированное с использованием теста активности фурина. Активность образцов рфурина показана в виде столбиков для различных партий рфурина расстаявшего при: или 4°С (левый) или комнатной температуре (RT; правый). Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0064] Фигура 11. Воздействие значения рН 5 и 5.5 на активность рфурина, проанализированное с использованием теста активности фурина. Образцы рфурина были инкубированы при 37°С при любом рН: 5.0, 5.5, или 6.0 (контрольный состав) в течение периода до семи дней. Активность образцов рфурина показана в зависимости от количества дней инкубации. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0065] Фигура 12. Воздействие значения рН 5 и 5.5 на активность рфурина, проанализированное с использованием SEC. Образцы рфурина были инкубированы при 37°С при любом рН: 5.0, 5.5 или 6.0 (контрольный состав). Относительные пиковые значения рфурина показаны в зависимости от колличества дней инкубации. Относительные пиковые значения были рассчитаны как процентное значение пикового значения фурина в нулевые моменты времени.

[0066] Фигура 13. Стабильность рфурина при 37°С в контрольном составе, проанализированная с использованием SEC. Образец рфурина в контрольном составе был инкубирован в течение четырех дней при 37°С.Наложение 280 нм профилей поглощения показано в трех временных точках: Т=0, 1 день и 4 дня инкубации.

[0067] Фигура 14. Стабильность рфурина в MES рН 6.0, проанализированная с использованием SEC. Образец рфурина был обработан MES (конечные С=100 ммоль, рН 6.0) и инкубирован в течение четырех дней при 37°С.Наложение 280 нм профилей поглощения показано в трех временных точках: Т=0, 1 день и 4 дня инкубации.

[0068] Фигура 15. Стабильность рфурина в HEPES рН 7.0, проанализированная с использованием SEC. Образец рфурина был обработан HEPES (конечные С=100 ммоль, рН 7.0) и инкубирован в течение четырех дней при 37°С.Наложение 280 нм профилей поглощения показано в трех временных точках: Т=0, 1 день и 4 дня инкубации.

[0069] Фигура 16. Стабильность рфурина в HEPES рН 8.0, проанализированная с использованием SEC. Образец рфурина был обработан HEPES (конечные С=100 ммоль, рН 8.0) и инкубирован в течение четырех дней при 37°С.Наложение 280 нм профилей поглощения показано в трех временных точках: Т=0, 1 день и 4 дня инкубации.

[0070] Фигура 17. Воздействие добавок сахарозы и полисорбата-80 на стабильность рфурина при 37°С, проанализированное с использованием SEC. Образцы были инкубированы при 37°С в течение четырех дней. Относительные пиковые значения рфурина показаны в зависимости от времени инкубации. Относительные пиковые значения были вычислены как процентные значения от высоты пиков рфурина в нулевой момент времени.

[0071] Фигура 18. Воздействия добавок сахарозы и полисорбата-80 на стабильность рфурина при 37°С, проанализированное с использованием теста активности фурина. Относительные активности образцов рфурина показаны в зависимости от колличества дней инкубации по сравнению со следующими образцами: контрольный состав без добавок, контрольный состав плюс 10% сахароза, и контрольный состав плюс 10% сахароза плюс 25 ppm полисорбата-80. Значения относительной активности были вычислены как процентные значения от активности фурина в нулевой временной точке. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения = 4.

[0072] Фигура 19. Воздействие сахарозы и полисорбата-80 на стабильность рфурина в MES буфере при 37°С, проанализированное с использованием теста активности фурина. Относительные активности образцов рфурина показаны в зависимости от колличества дней инкубации по сравнению со следующими образцами: контрольный состав без добавок, обработанные MES (конечные С=100 ммоль, рН 6.0), обработанные MES (конечные С=100 ммоль, рН 6. плюс 10% сахароза, и обработанные MES (конечные С=100 ммоль, рН 6.0) плюс 10% сахароза плюс 25 ppm полисорбата-80. Значения относительной активности были вычислены как процентные значения от активности фурина в нулевой временной точке. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0073] Фигура 20. Сравнение стабильности рфурина при 37°С в контрольном составе с составом в MES буфере, проанализированное с использованием теста активности фурина. Относительные активности образцов рфурина показаны в зависимости от колличества дней инкубации по сравнению со следующими образцами: контрольный состав без добавок, контрольный состав плюс 10% сахарозы, и обработанные MES (конечные С=100 ммоль, рН 6.0) плюс 10% сахарозы. Значения относительной активности были вычислены как процентные значения от активности фурина в нулевой временной точке. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0074] Фигура 21. Сравнение стабильности рфурина при 37°С в сахарозе с маннитом, проанализированное с использованием теста активности фурина. Все образцы были обработаны HEPES/уксусной кислотой, рН 6.0. Относительные активности образцов рфурина показаны в зависимости от колличества дней инкубации по сравнению со следующими образцами: без добавок, 10% сахарозы, 10% маннита, 10% сахарозы плюс 25 ppm полисорбата-80 и 10% маннита плюс 25 ppm полисорбата-80. Значения относительной активности были вычислены как процентные значения от активности фурина в нулевой временной точке. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0075] Фигура 22. Стабильность рфурина при 37°С: Сахароза в сравнении с маннитом, проанализированная с использованием SEC. Такие же образцы, как на ФИГ. 21, были проанализированы с использованием SEC. Относительные пиковые значения рфурина показаны в зависимости от времени инкубации. Относительные пиковые значения были вычислены как процентные значения от высоты пиков фурина в нулевой временной точке.

[0076] Фигура 23. Стабильность рфурина в трегалозе после 5 дней инкубации при 37°С, проанализированная посредством теста активности фурина. Воздействия различных количеств трегалозы и полисорбата-80 на стабильность рфурина при 37°С были изучены с использованием теста активности фурина. Сначала все образцы были обработаны HEPES и уксусной кислотой (конечные концентрации: HEPES - 50 ммоль, уксусная кислота - 50 ммоль, рН 6.0) затем, или 10% сахарозы или различные коллличества трегалозы и/или полисорбата-80 были добавлены. Образец рфурина в контрольный состав также включен. Данные сортируются от высших до низжих значений активности после 5 дней инкубации при 37°С (правая черта в каждой паре). Левая черта в каждой паре изображает значения активности фурина в нулевой временной точке. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0077] Фигура 24. Активность рфурина в трегалозе после 5 дней инкубации при 37°С.Такие же образцы как на ФИГ. 23 отображаются после перерасчета, чтобы показать какой процент от первоначальной активности каждого образца остался после пяти дней инкубации при 37°С. Образец рфурина в контрольный состав также включен. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0078] Фигура 25. Стабильность рфурина в трегалозе после 5 дней инкубации при 37°С проанализированная с использованием SEC. Такие же образцы как на ФИГ. 24. График показывает, какой процент от начального пика фурина каждого образца остался после пяти дней инкубации при 37°С. Образец рфурина в контрольный состав также включен.

[0079] Фигура 26. Стабильность рфурина в трегалозе после 5 дней инкубации при 35°С, проанализированная с использованием способа Вестерна-блоттинга. Такие же образцы, как на ФИГ. 24. Образцы взяты парами: первый образец - в начале отсчета времени, второй образец - инкубирован при 37°С в течение 5 дней. Линии: (1) MWM маркер; (2) источник фурина, (3) контроль; (4) контрольный состав, Т=0; (5) контрольный состав, 5 дней; (6) 10% сахароза, Τ=0; (7) 10% сахароза, 5 дней; (8) 2% трегалоза, Т=0; (9) 2% трегалоза, 5 дней; (10) 10% трегалоза, Т=0; (11) 10% трегалоза, 5 дней; (12) MWM маркер; (13) источник фурина; (14) контроль; (15) 5% трегалоза, Т=0; (16) 5% трегалоза, 5 дней; (17) 5% трегалоза, +10 ppm Твин 80, Т=0; (18) 5% трегалоза,+10 ppm Твин 80, 5 дней; (19) 5% трегалоза, +25 ppm Твин 80, Т=0; (20) 5% трегалоза,+25 ppm Твин 80, 5 дней; (21) 5% трегалоза, +100 ppm Твин 80, Т=0; и (22) 5% трегалоза, +100 ppm Твин 80, 5 дней.

[0080] Фигура 27. Воздействие содержания трегалозы на активность рфурина протестированная после 5 дней инкубации при 37°С.Такой же эксперимент как на ФИГ. 24. Сначала, все образцы были обработаны HEPES и уксусной кислотой (конечные концентрации: HEPES - 50 ммоль, уксусная кислота - 50 ммоль, рН 6.0) затем, различные количества трегалозы были добавлены. Активность фурина после пяти дней инкубации при 37°С показана в зависимости от процентного значения трегалозы, добавленной в образцы. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0081] Фигура 28. Воздействие содержания трегалозы на стабильность рфурина при 37°С проанализировано с использованием SEC после 5 дней инкубации. Такой же эксперимент, как на ФИГ. 27. Высота пиков рфурина после пяти дней инкубации при 37°С показана в зависимости от процентного значения трегалозы добавленной к образцам.

[0082] Фигура 29. Воздействие содержания полисорбата-80 на активность рфурина, протестированное после 5 дней инкубации при 37°С.Такой же эксперимент, как на ФИГ. 24. Сначала все образцы были обработаны HEPES, уксусной кислотой (конечные концентрации: HEPES - 50 ммоль, уксусная кислота - 50 ммоль, рН 6.0), и 5% трегалозой затем различные количества полисорбата-80 были добавлены. Активность фуриана после пяти дней инкубации при 37°С показана в зависимости от количества полисорбата-80, добавленного к образцам. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0083] Фигура 30. Воздействие содержания Полисорбата-80 на стабильность рфурина при 37°С, проанализированное с использованием SEC после 5 дней инкубации. Такие же образцы, как на ФИГ. 29. Высота пиков рфурина после пяти дней инкубации при 37°С показана в зависимости от количества полисорбата-80, добавленного к образцам.

[0084] Фигура 31. рФурин в высокостабилизированном составе - исследование перемешивания проанализировано с использованием теста активности фурина. Образцы рфурина в высокостабилизированном составе были обработаны различными колличествами полисорбата-80. График показывает значения активности фурина до и после трех часов перемешиваниия. Значения отсортированы от наибольшей до наименьшей активности. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4. Левые черты в каждой паре показывают активность при времени 0, правые черты в каждой паре показывают активность после перемешиваниия.

[0085] Фигура 32. рФурин в высокостабилизированном составе - исследование перемешивания проанализировано с использованием SEC. Такой же эксперимент как на ФИГ. 31. График показывает высоты пиков фурина до и после трех часов перемешиваниия. Значения отсортированы от наибольшего до наименьшего. Левые черты в каждой паре показывают активность при времени 0, правые черты в каждой паре показывают активность после перемешиваниия.

[0086] Фигура 33. рФурин в высокостабилизированном составе - воздействие содержания полисорбата в исследовании перемешивания, проанализированное с использованием теста активности фурина. Такие же образцы, как на ФИГ. 32. Активность фурина после трех часов перемешивания показана в зависимости от содержания полисорбата-80. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0087] Фигура 34. рФурин в высокостабилизированном составе - воздействие полисорбата-80 в исследовании перемешивания, проанализированное с использованием SEC. Такие же образцы, как на ФИГ. 32. Высоты пиков рфурина после трех часов перемешивания показаны в зависимости от содержания полисорбата-80.

[0088] Фигура 35. рФурин в контрольном составе - исследование перемешивания проанализировано с использованием SEC. Хроматограмма показывает наложение SEC профилей поглощения при 280 нм сравнении образцов рфурина в контрольном составе до и после трех часов перемешивания. Пик рфурина перемешанного образца значительно меньше, чем в контрольном образце. Наблюдается отсутствие высоких пиков молекулярных масс в перемешанном образце (см. параграф 3.5.1 для пояснения).

[0089] Фигура 36. УФ спектр рфурина в контрольном составе (такие же образцы, как на ФИГ. 35). УФ спектр образца рфурина после трех часов перемешивания показывает наклоненный и чрезвычайно повышенный профиль по сравнению с образцом до перемешиваниия, что указывает на наличие значительного уровня агрегатов в возбужденном образце.

[0090] Фигура 37. УФ спектр образцов рфурина в высокостабилизированном составе без полисорбата-80. УФ спектр образца рфурина после трех часов перемешивания показывает повышенный профиль по сравнению с образцом до перемешиваниия, что указывает на наличие значительного уровня агрегатов в перемешанном образце.

[0091] Фигура 38. рФурин в высокостабилизированном составе без полисорбата-80 - исследование перемешивания проанализировано с использованием SEC. Хроматограмма показывает наложение SEC профилей поглощения при 280 нм, сравнивая образцы рфурина в высокостабилизированном составе без полисорбата-80 до и после трех часов перемешивания. Пик рфурина перемешанного образца значительно ниже, чем у контрольного образца. Наблюдается отсутствие высоких пиков молекулярных масс.

[0092] Фигура 39. УФ спектр образцов рфурина в высокостабилизированном составе, содержащем 10 ppm полисорбата-80. УФ спектр образца рфурина после трех часов перемешивания показывает слегка повышенный профиль по сравнению с образцом до перемешиваниия, что указывает на наличие агрегатов в возбужденном образце. Спектр состояния 'перемешивания' ближе к спектру состояния 'перед перемешиванием', по отношению к тем, которые наблюдаются в образцах без полисорбата (Фигуры 36 и 37), которые показывают, что уровень агрегации меньше, чем тот, который виден в образцах без полисорбата.

[0093] Фигура 40. УФ спектр образцов рфурина в высокостабилизированном составе, содержащем 25 ppm полисорбата-80. УФ спектр образца рфурина после трех часов перемешивания показывает слегка повышенный профиль по сравнению с образцом до перемешиваниия, что указывает на наличие небольшого количества агрегатов в перемешанном образце.

[0094] Фигура 41. УФ спектр образцов рфурина в высокостабилизированном составе, содержащем 50 ppm полисорбата-80. УФ спектр образца рфурина после трех часов перемешивания показывает очень схожий профиль с образцом до перемешиваниия. Спектр ни наклонен, ни повышен, что свидетельствует о том, что ни один образец не содержит значительное количество крупных агрегатов.

[0095] Фигура 42. УФ спектр образцов рфурина в высокостабилизированном составе, содержащем 100 ppm полисорбата-80. УФ спектр образца рфурина после трех часов перемешивания показывает очень схожий профиль с образцом до перемешиваниия. Спектр ни наклонен, ни повышен, что свидетельствует о том, что ни один образец не содержит значительное количество крупных агрегатов.

[0096] Фигура 43. рФурин в высокостабилизированном составе - исследование замораживания/оттаивания, проанализированное с использованием теста активности фурина. Образцы рфурина в высокостабилизированном составе были обработаны различными количествами полисорбата-80. Данные показывают активность рфурина в образцах до и после 5 циклов замораживания/оттаивания. Данные отсортированы от наибольшего до наименьшего. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0097] Фигура 44. рФурин в высокостабилизированном составе - исследование замораживания/оттаивания, проанализированное с использованием SEC. Такие же образцы как на Фигуре 43. Данные показывают высоты пиков рфурина до и после 5 циклов замораживания/оттаивания. Данные отсортированы от наибольшего до наименьшего.

[0098] Фигура 45. рФурин в высокостабилизированном составе - исследование замораживания/оттаивания, проанализированное с использованием SEC. Такие же образцы, как на ФИГ. 44. Относительные пиковые значения рфурина показаны в зависимости от количества циклов замораживания/оттаивания. Относительные пиковые значения были рассчитаны как процентные значения высот от пиков рфурина перед первым циклом замораживания/оттаивания.

[0099] Фигура 46. Стабильность рфурина в высокостабилизированном составе при 37°С, проанализированная с использованием теста активности фурина. Образцы рфурина в либо контрольном составе, либо в высокостабилизированном составе были инкубированы при 37°С в течение 4 дней. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0100] Фигура 47. Стабильность рфурина в высокостабилизированном составе при 37°С, проанализированная с использованием теста активности фурина. Такие же образцы, как на ФИГ. 46 перерассчитаны. Относительная активность каждого образца была рассчитана как процент от начальной активности. Величины погрешностей составляют ±1 стандартного отклонения; n=4.

[0101] Фигура 48. Стабильность рфурина в высокостабилизированном составе при 37°С проанализирована с использованием SEC. Такие же образцы, как на ФИГ. 46. Относительная высота пика рфурина