Способ лечения патологического синдрома и лекарственное средство центрального и периферического действия для лечения патологического синдрома

Способ лечения патологического синдрома и лекарственное средство центрального и периферического действия для лечения патологического синдрома

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для повышения эффективности лечения различных заболеваний, включая ожирение, преимущественно экзогенно-конституциональное, в том числе в сочетании с нарушениями липидного обмена, включая метаболический синдром, а также и для лечения зависимости от наркотических и/или психоактивных веществ.

Согласно данным Международной рабочей группы по проблеме ожирения (International Obesity Task Force), более 300 млн. человек на нашей планете страдают ожирением, а еще 800 млн. человек имеют избыточную массу тела. При сохранении таких высоких темпов роста заболеваемости к 2025 г. ожидается двукратное увеличение числа страдающих ожирением.

Избыточный вес и ожирение являются одной из наиболее распространенных проблем в развитых странах, и повышают риск развития заболеваний сердечно-сосудистой системы, дислипидемии, сахарного диабета 2 типа, онкологических заболеваний.

Среди современных препаратов, используемых для снижения массы тела, можно выделить три основные группы - препараты периферического и центрального действия усиливающие «сжигание» калорий, препараты, снижающие поступления жиров в организм, и препараты центрального действия (регуляторы аппетита) (Padwal R.S., Majumdar S.R., Drug treatments for obesity: orlistat, sibutramine, and rimonabant. Lancet 2007; 366 (9555):71-7). Препараты всех групп имеют множественные побочные эффекты, в связи с чем их применение в повседневной практике крайне ограничено. Таким образом, разработка и внедрение новых безопасных и эффективных препаратов для снижения массы тела являются весьма актуальными.

Из уровня техники известна композиция для лечения ожирения и резистентности к инсулину при регуляции уровня глюкозы в крови, содержащая соединение, выделенное из натурального источника и очищенное, выбираемое из группы, включающей антоцианин, антоцианидин и их смеси (RU 2359689 С2, А61К 36/45, 10.09.2008). Однако при использовании данной композиции возникает сложностью подбора дозы.

Также известно использование лекарственного препарата на основе антител к липазе для лечения ожирения у млекопитающих (WO/1999/002187, A61K 38/00, 21.01.1999). Однако данный препарат может вызывать выраженные побочные эффекты и вследствие этого применяется в незначительном числе случаев.

Из уровня техники известно лекарственное средство для перорального лечения ожирения, сахарного диабета и других заболеваний, сопровождающихся нарушением толерантности к глюкозе, содержащее антитела к бета-субъединице рецептора инсулина в активированной форме (WO 2007/149010 A1, A61K 39/395, 27.12.2007). Однако данное лекарственное средство эффективно, в основном, при ожирении, связанном с инсулинорезистентностью.

Изобретение направлено на создание эффективного способа лечения патологического синдрома, включая лечение ожирения и связанных с ним метаболических расстройств, а также лечение зависимости от наркотических и/или психоактивных веществ без побочных эффектов, и соответствующего лекарственного средства центрального и периферического действия на основе антител к известному каннабиноидному рецептору человека (Ken Mackie. Cannabinoid receptors as therapeutic targets. The Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 2006. 46:101-122).

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе лечения патологического синдрома путем введения в организм лекарственного средства центрального и периферического действия на основе активированной-потенцированной формы антител, согласно изобретению, лекарственное средство содержит активированную-потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору человека в виде активированного-потенцированного водного или водно-спиртового раствора, полученного в процессе последовательного многократного разведения матричного раствора в водном или водно-спиртовом растворителе и промежуточного внешнего механического воздействия.

Возможно использование активированной-потенцированной формы антител к цельной молекуле каннабиноидного рецептора I типа человека или полипептидному фрагменту с последовательностью, выбираемой, например, из следующей группы:

Кроме того, дополнительно вводят активированную-потенцированную форму антител к мозгоспецифическому белку S-100 в виде активированного-потенцированного водного или водно-спиртового раствора, полученного в процессе последовательного многократного разведения матричного раствора в водном или водно-спиртовом растворителе и промежуточного внешнего механического воздействия.

Предпочтительно активированную-потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору человека или активированную-потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору человека в сочетании с активированной-потенцированной формой антител к мозгоспецифическому белку S-100 используют для лечения ожирения и сопутствующих метаболических расстройств.

При этом активированную-потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору человека или активированную-потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору человека в сочетании с активированной-потенцированной формой антител к мозгоспецифическому белку S-100 используют для лечения зависимости от наркотических и/или психоактивных веществ.

При этом активированную-потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору человека или активированную-потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору человека в сочетании с активированной-потенцированной формой антител к мозгоспецифическому белку S-100 используют для лечения алкогольной зависимости.

При этом активированную-потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору человека или активированную-потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору человека в сочетании с активированной-потенцированной формой антител к мозгоспецифическому белку S-100 используют для лечения зависимости от табакокурения.

Причем лекарственное средство может быть выполнено в твердой лекарственной форме в виде таблетки, содержащей эффективное количество гранул нейтрального носителя, насыщенного водным или водно-спиртовым раствором активированной-потенцированной формы антител к каннабиноидному рецептору I типа человека или активированную-потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору человека в сочетании с активированной-потенцированной формой антител к мозгоспецифическому белку S-100, и фармацевтически приемлемые добавки.

Предпочтительно лекарственное средство вводят 1÷2 таблетки 2÷6 раз в сутки.

Как вариант активированную-потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору человека или активированную -потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору человека в сочетании с активированной-потенцированной формой антител к мозгоспецифическому белку S-100 используют для лечения зависимости от табакокурения легкой степени по результатам теста Фагерстрома.

Как вариант активированную-потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору человека или активированную-потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору человека в сочетании с активированной-потенцированной формой антител к мозгоспецифическому белку S-100 используют для лечения зависимости от табакокурения тяжелой степени по результатам теста Фагерстрома.

Решение поставленной задачи обеспечивается также тем, что лекарственное средство центрального и периферического действия для лечения патологического синдрома содержит активированную-потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору человека I типа в виде активированного-потенцированного водного или водно-спиртового раствора, полученного в процессе последовательного многократного разведения в водном или водно-спиртовом растворителе и промежуточного внешнего механического воздействия.

Кроме того, лекарственное средство дополнительно может содержать активированную-потенцированную форму антител к мозгоспецифическому белку S-100 в виде активированного-потенцированного водного или водно-спиртового раствора, полученного в процессе последовательного многократного разведения матричного раствора в водном или водно-спиртовом растворителе и промежуточного внешнего механического воздействия.

При этом водно-спиртовой раствор активированной-потенцированной формы антител получен путем многократного последовательного разведения и промежуточного внешнего воздействия из матричного раствора соответствующих аффинно очищенных антител с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл.

Лекарственное средство может быть выполнено в твердой лекарственной форме и содержать эффективное количество гранул нейтрального носителя, насыщенного водным или водно-спиртовым раствором активированной-потенцированной формы соответствующих антител, и фармацевтически приемлемые добавки.

При этом фармацевтически приемлемые добавки включают лактозу, целлюлозу микрокристаллическую и магния стеарат.

Предпочтительно нейтральный носитель и фармацевтически приемлемые добавки формируют в виде таблетки, пропитанной 6 мл водного или водно-спиртового раствора активированной потенцированной формы антител, массой 300 мг.

Заявленный технический результат может быть обусловлен тем, что известные каннабиноидные рецепторы 1 типа и эндоканнабиноиды представляют собой единую систему в гипоталамусе, которая, воздействуя, преимущественно, на специфические участки мезолимбической области головного мозга, влияет на чувство насыщения и регулирует аппетит и, как результат, потребление пищи, а активированная-потенцированная форма антител к каннабиноидному рецептору человека, в том числе и в сочетании с активированной-потенцированной формой антител к мозгоспецифическому белку S-100, обеспечивает как нормализацию углеводного и липидного обмена, так и существенное уменьшение зависимости от наркотических и/или психоактивных веществ.

При этом предложенное лекарственное средство на основе активированной-потенцированной формы антител к каннабиноидному рецептору человека, в том числе и в сочетании с активированной-потенцированной формой антител к мозгоспецифическому белку S-100 (т.е. форм антител к каннабиноидному рецептору I типа человека и к мозгоспецифическому белку S-100, приготовленных по гомеопатической технологии потенцирования путем многократного последовательного разведения в сочетании с внешним воздействием-вертикальным встряхиванием каждого разведения (см., например, В.Швабе "Гомеопатические лекарственные средства", М., 1967 г., с.14-29), которые обладают активностью в фармакологических моделях и/или клинических методах как нормализации углеводного и липидного обмена, приводящей к снижению массы тела без побочных явлений, так и лечения зависимости от наркотических и/или психоактивных веществ, преимущественно, алкоголизма и табакокурения) обеспечивает получение неожиданного синергетического терапевтического эффекта, подтвержденного на адекватных (валидных) экспериментальных моделях и клинических исследованиях. При этом заявленное лекарственное средство, являясь препаратом центрального и периферического действия, не только нормализует углеводный и липидный обмен, но и модулирует систему позитивного эмоционального подкрепления, уменьшая тем самым выраженность влечения к психоактивным веществам, в том числе при алкоголизме и никотинизме, нормализует баланс нейромедиаторов в центральной нервной системе, улучшает нейропротекторную активность, повышает устойчивость мозга к токсическим воздействиям, улучшает интегративную деятельность, способствует устранению когнитивных нарушений, повышает умственную работоспособность, нормализует соматовегетативные проявления при абстинентных состояниях. В результате этого устраняется раздражительность, повышается настроение, устраняется внутренний дискомфорт, устраняются мысли о никотине или алкоголе, повышается работоспособность, устраняется потливость, тахикардия и общая слабость, а также другие аффективные, идеаторные и астеновегетативные нарушения; повышается качество жизни. При этом заявленное нейротропное лекарственное средство не оказывает седативного, миорелаксантного действия, не вызывает привыкания, лекарственной зависимости, не обладает наркогенным потенциалом и другими побочными явлениями и обладает расширенным терапевтическим диапазоном, обеспечивающим лечение различных заболеваний, включая ожирение, и зависимости от наркотических и/или психоактивных веществ.

Кроме того, полученное в соответствии с изобретением техническое решение расширяет арсенал лекарственных средств центрального и периферического действия, предназначенных для эффективного лечения различных заболеваний, в том числе и в составе комплексной терапии.

Лекарственное средство приготовляют, например, следующим образом.

Для приготовления гомеопатически активированной-потенцированной формы антител используют моноклональные или, преимущественно, поликлональные антитела, которые могут быть получены по известным технологиям-методикам, описанным, например, в книге: Иммунологические методы, под ред. Г.Фримеля, М., «Медицина», 1987, с.9-33; или, например, в статье Laffly E., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol.14. - N 1-2. P.33-55.

Моноклональные антитела получают, например, с помощью гибридомной технологии. Причем начальная стадия процесса включает иммунизацию, основанную на принципах, уже разработанных при приготовлении поликлональных антисывороток. Дальнейшие этапы работы предусматривают получение гибридных клеток, продуцирующих клоны одинаковых по специфичности антител. Их выделение в индивидуальном виде проводится теми же методами, что и в случае поликлональных антисывороток.

Поликлональные антитела антител к каннабиноидному рецептору человека могут быть получены активной иммунизацией животных. Для этого по специально разработанной схеме животным делают серию инъекций требуемым в соответствии с изобретением веществом-антигеном: каннабиноидным рецептором I типа человека. В результате проведения такой процедуры получают моноспецифическую антисыворотку с высоким содержанием антител, которую и используют для получения активированной-потенцированной формы. При необходимости проводят очистку антител, присутствующих в антисыворотке, например, методом аффинной хроматографии, путем применения фракционирования солевым осаждением или ионообменной хроматографии.

Для иммунизации кроликов можно использовать в качестве иммуногена (антигена) адъювант и цельную молекулу каннабиноидного рецептора I типа человека следующей последовательности:

или, преимущественно, полипептидный фрагмент каннабиноидного рецептора I типа человека с последовательностью, выбираемой, например, из следующей группы:

Перед отбором крови за 7-9 дней проводят 1-3 внутривенных инъекций для повышения уровня антител. В процессе иммунизации у кроликов отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства растворимых антигенов достигается через 40-60 дней после первой инъекции. После окончания первого цикла иммунизации кроликов в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию, включающую 1-3 внутривенные инъекции. Для получения антисыворотки из иммунизированных кроликов собирают кровь в центрифужную пробирку объемом 50 мл. С помощью деревянного шпателя удаляют со стенок пробирки образовавшиеся сгустки и помещают палочку в сгусток, образовавшийся в центре пробирки. Кровь помещают в холодильник (температура 4°С) на ночь. На следующий день удаляют сгусток, прикрепившийся к шпателю, и центрифугируют оставшуюся жидкость при 13000 g в течение 10 мин. Супернатант (надосадочная жидкость) является антисывороткой. Полученную антисыворотку, которая должна быть желтого цвета, хранят до использования в замороженном состоянии при температуре -70°С. Для выделения из антисыворотки антител к каннабиноидному рецептору I типа человека производят абсорбцию на твердой фазе в следующей последовательности:

1. 10 мл антисыворотки кролика разбавляют в 2 раза 0,15 М NaCl добавляют 6,26 г Na₂SO₄, перемешивают и инкубируют 12-16 ч при 4°С;

2. выпавший осадок удаляют центрифугированием, растворяют в 10 мл фосфатного буфера и затем диализуют против того же буфера в течение ночи при комнатной температуре;

3. после удаления осадка центрифугированием раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером;

4. фракцию антител определяют, измеряя оптическую плотность элюата при 280 нм.

Затем производят очистку антител методом аффинной хроматографии путем прикрепления полученных антител к каннабиноидному рецептору I типа человека, который находится на нерастворимом матриксе с последующим элюированием концентрированными растворами соли.

Полученный, таким образом, буферный раствор поликлональных кроличьих антител к каннабиноидному рецептору I типа человека, очищенных на антигене, с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, предпочтительно 2,0÷2,5 мг/мл, используют в качестве матричного (первичного) раствора для последующего приготовления активированной-потенцированной формы.

Для получения поликлональных антител к мозгоспецифическому белку S-100 используют мозгоспецифический белок S-100, физико-химические свойства которого описаны в статье М.В.Старостина, С.М.Свиридов, Нейроспецифический белок S-100, Успехи современной биологии, 1977 г., т.5, с.170-178; книге М.Б.Штарк, Мозгоспецифические белки /антигены/ и функции нейрона, М., "Медицина", 1985 г.; с.12-14, выделенный из ткани головного мозга быка по следующей методике:

- замороженную в жидком азоте ткань растирают в порошок на специальной мельнице;

- экстракцию белков проводят в соотношении 1:3 (вес/объем) в экстрагирующем буфере при гомогенизации;

- гомогенат прогревают в течение 10 мин при 60°С и охлаждают до 4°С на ледяной бане;

- термолабильные белки удаляют центрифугированием;

- проводят ступенчатое фракционирование сульфатом аммония с последующим удалением выпадающих в осадок примесных белков;

- содержащую белок S-100 фракцию осаждают 100% насыщенным сульфатом аммония при снижении рН до 4,0 и собирают центрифугированием;

- осадок растворяют в минимальном объеме буфера, содержащего ЭДТА и меркаптоэтанол, диализируют против деионизованной воды и лиофильно высушивают;

- фракционирование кислых белков продолжают хроматографией на ионообменных носителях - ДЭАЭ целлюлозе ДЕ-52 и затем ДЭАЭ-сефадексе А-50;

- собранные и отдиализованные фракции, содержащие белок S-100, разделяют по молекулярному весу гель-фильтрацией на сефадексе G-100;

- очищенный белок S-100 диализируют и лиофильно высушивают.

Молекулярный вес очищенного мозгоспецифического белка S-100 составляет - 21000 д.

Благодаря высокому содержанию аспарагиновой и глутаминовой кислот мозгоспецифический белок S-100 является сильнокислым и занимает крайнее анодное положение при электрофорезе в прерывистой буферной системе в полиакриламидном геле, что облегчает его идентификацию.

Для получения мозгоспецифической антисыворотки к выделенному мозгоспецифическому белку S-100 готовят смесь очищенного белка S-100 (антигена) в комплексе с метилированным бычьим сывороточным альбумином в качестве носителя с полным адъювантом Фрейнда, которую вводят подкожно лабораторному животному-кролику в область спины в количестве 1-2 мл. На 8-й, 15-й день проводят повторную иммунизацию. Забор крови производят (например, из вены уха) на 26-й и 28-й день.

Полученная антисыворотка имеет титр 1:500-1:1000, образует единственную полосу преципитации с экстрактом из нервной ткани, но не реагирует с экстрактами гетерологичных органов и формирует единственный пик преципитации как с чистым белком S-100, так и с экстрактом нервной ткани, что свидетельствует о моноспецифичности полученной антисыворотки.

Полученный, таким образом, буферный раствор поликлональных кроличьих антител к мозгоспецифическому белку S-100, очищенных на антигене, с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, предпочтительно 2,0÷2,5 мг/мл, используют в качестве матричного (первичного) раствора для последующего приготовления активированной-потенцированной формы.

Активированную-потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору I типа человека (или к мозгоспецифическому белку S-100) в сверхмалой дозе готовят путем равномерного уменьшения концентрации в результате последовательного разведения 1 части упомянутого матричного раствора в 9 частях (для десятичного разведения) или в 99 частях (для сотенного разведения С) или в 999 частях (для тысячного разведения М) нейтрального водного или водно-спиртового растворителя с многократным вертикальным встряхиванием-потенцированием (или "динамизацией") каждого полученного разведения и использованием отдельных емкостей для каждого последующего разведения до получения требуемой потенции-кратности разведения по гомеопатическому методу (см., например, В.Швабе "Гомеопатические лекарственные средства", М., 1967 г., с.14-29).

Например, для приготовления 12-го сотенного разведения С12 одну часть упомянутого матричного раствора антител к каннабиноидному рецептору I типа человека с концентрацией 2,5 мг/мл разводят в 99 частях нейтрального водного или водно-спиртового растворителя и многократно (10 и более раз) вертикально встряхивают-потенцируют полученное 1-е сотенное С1 разведение. Из 1-го сотенного С1 разведения приготовляют 2-ое сотенное разведение С2. Данную операцию повторяют 11 раз, получая 12-е сотенное разведение С12. Таким образом, 12-е сотенное разведение С12 представляет собой раствор, полученный разбавлением последовательно в разных емкостях 12 раз 1-ой части исходного матричного раствора антител к каннабиноидному рецептору I типа человека с концентрацией 2,5 мг/мл в 99-ти частях нейтрального растворителя, т.е. раствор, полученный сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹² раз. Аналогичные операции с соответствующей кратностью разведения проводят для получения разведении С30 и С200.

При использовании в качестве биологически активного жидкого компонента смеси различных гомеопатических, преимущественно сотенных, разведении, действующего вещества каждый компонент состава (например, С12, С30, С200) приготовляют раздельно по описанной выше технологии до их предпоследнего разведения (соответственно, до получения С11, С29, С199) и затем вносят в соответствии с составом смеси в одну емкость по одной части каждого компонента и смешивают с требуемым количеством растворителя (соответственно, с 97 частями для сотенного разведения). При этом получают активированную-потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору I типа человека в сверхмалой дозе, полученной сверхразведеним исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз, что эквивалентной смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С200.

Возможно использование смеси других различных гомеопатических разведении, например, десятичных и/или сотенных (D20, С30, С100 или С12, С30, С50 и т.д.), эффективность которых определяют экспериментально.

При потенцировании вместо встряхивания (вертикального или горизонтального) в процессе уменьшения концентрации также можно осуществлять внешнее воздействие ультразвуком, электромагнитным или иным физическим воздействием.

Заявленное лекарственное средство может быть приготовлено в виде фармацевтической композиции, при этом водные или водно-спиртовые растворы действующих компонентов (активированную-потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору I типа человека и к мозгоспецифическому белку S-100) смешивают, преимущественно, в объемном соотношении 1:1 и используют в жидкой лекарственной форме.

Заявленное лекарственное средство может быть использовано в твердой лекарственной форме, которая содержит эффективное количество гранул нейтрального носителя - лактозы, насыщенного путем пропитывания до насыщения водным или водно-спиртовым раствором активированной-потенцированной формы антител к каннабиноидному рецептору человека или активированной-потенцированной формы антител к каннабиноидному рецептору человека в сочетании с активированной-потенцированной формой антител к мозгоспецифическому белку S-100, и фармацевтически приемлемые добавки, включающие, преимущественно, лактозу, целлюлозу микрокристаллическую и магния стеарат.

Твердую лекарственную форму приготовляют таблетированием из таблеточной массы, которая содержит 8÷10 масс. частей гранул лактозы, орошенных в псевдоожиженном-кипящем слое водным или водно-спиртовым раствором активированной-потенцированной формы антител к каннабиноидному рецептору I типа человека, 2÷7 масс. частей увлажненной 70% спиртом лактозы, пропитанных до насыщения водным или водно-спиртовым раствором активированной-потенцированной формы антител к каннабиноидному рецептору I типа человека, и фармацевтически приемлемые добавки, включающие 75÷95 масс. частей чистой лактозы, 8÷15 масс. частей микрокристаллической целлюлозы и 0,8÷1,2 масс. частей стеарата магния. Масса таблетки может составлять 150÷500 мг. Предпочтительно использовать таблетки массой 250÷300 мг, которые включают 3,0÷6,0 мг/табл активированной-потенцированной формы водно-спиртовых разведении субстанции - действующего вещества поликлональных кроличьих антител к каннабиноидному рецептору I типа человека или активированной-потенцированной формы антител к каннабиноидному рецептору человека в сочетании с активированной-потенцированной формой антител к мозгоспецифическому белку S-100, очищенных на антигене, в сверхмалой дозе, полученной сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹²,100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентной смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С200.

Предпочтительно для эффективного лечения применять заявленное лекарственное средство по 1÷2 таблетке (держать во рту до полного растворения) 2÷6 раз в день.

Для проведения экспериментальных исследований были использованы поликлональные антитела, приготовленные по заказу специализированной фармацевтической фирмой.

Пример 1.

Для лечения ожирения неоднократно проводились попытки использовать психоактивные вещества (антидепрессанты, ноотропы, различные эндорфины, энкефалины, эндоканнабиноиды), воздействующие на систему позитивного эмоционального подкрепления и, прежде всего, функциональную активность «центров удовольствия» в латеральном гипоталамусе. Однако из-за выраженных побочных действий, развития привыкания (пристрастия) эффективное и одновременно безопасное лекарственное средство центрального действия до сих пор не создано.

Заявленное лекарственное средство по направленности действия - рецептор каннабиноидный 1 типа - является центральным, но в связи использованием особой технологии потенцирования оказывает воздействие на рецептор, приводящее к его сенситизации и вследствие этого - повышению чувствительности к эндогенным каннабиноидам.

Данный эффект подтверждается следующим экспериментом: проведено изучение влияния препарата на основе активированной-потенцированной формы поликлональных кроличьих антител к каннабиноидному рецептору I типа человека, очищенных на антигене, в сверхмалой дозе, полученной сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентной смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С200 (сверхмалые дозы - СМД анти-КР) на функциональное состояние каннабиноидного рецептора 1 типа {in vitro) в 2 режимах: в режиме агониста и в режиме антагониста.

Режим агониста:

Перед внесением в лунки микропланшета (96-луночный планшет, объем лунки 250μl) клетки суспендировали в буфере HBSS (Invitrogen), содержащем 20 мМ HEPES (рН=7.4). Клетки проинкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре вместе с добавлением 20 мкл препарата СМД анти-КР. После преинкубации в лунки добавляли активатор аденилатциклазы NKH477. Клетки инкубировали в течение 10 минут 37°С и лизировали. В лунки вносили флуоресцентный акцептор (цАМФ, меченный D2) и флуоресцентный донор (антитела к цАМФ, меченные криптатом европия).

В качестве базального контроля вместо препарата СМД анти-КР суспензию клеток проинкубировали в присутствии HBSS буфера (20 мкл). В качестве стимулированного контроля вместо СМД анти-КР суспензию клеток преинкубировали в присутствии референсного агониста СР 55940 (20 мкл).

Функциональную активность (по концентрации цАМФ) оценивали методом гомогенной флуоресценции с временным разрешением (HTRF). Интенсивность флуоресценции в базальном контроле принимается за фоновую и ее значение вычитается из интенсивностей флуоресценции в опыте (СМД анти-КР) и контроле (СР 55940):

Измеренный специфический ответ клетки на введение СМД анти-КР вычисляется по формуле: интенсивность флуоресценции в опыте (СМД анти-КР) - интенсивность флуоресценции в базальном контроле.

Измеренный специфический ответ клетки на введение референсного агониста (СР 55940) вычисляется по формуле: интенсивность флуоресценции в контроле (СР 55940) - интенсивность флуоресценции в базальном контроле.

Результаты выражаются в процентах от специфического ответа клетки на введение референсного агониста в стимулированном контроле:

% ответа референсного агониста = ((измеренный специфический ответ / специфический ответ в контроле на введение референсного агониста) × 100%).

Режим антагониста:

Перед внесением в лунки микропланшета (96-луночный планшет, объем лунки 250μl) клетки суспендировали в буфере HBSS (Invitrogen), содержащем 20 мМ HEPES (рН=7.4). Клетки проинкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре вместе с добавлением 20 мкл препарата СМД анти-КР. После добавления в лунки референсного агониста СР 55940 клетки инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Далее в лунки добавляли активатор аденилатциклазы NKH477. Клетки инкубировали в течение 10 минут 37°С и лизировали. В лунки вносили флуоресцентный акцептор (цАМФ, меченный D2) и флуоресцентный донор (антитела к цАМФ, меченные криптатом европия).

В качестве базального контроля вместо СМД анти-КР суспензию клеток преинкубировали в присутствии референсного антагониста AM 281 (20 мкл). В лунки с базальным контролем не добавляли референсный агонист СР 55940. В качестве стимулированного контроля суспензию клеток преинкубировали в присутствии HBSS буфера, содержащего 20 мМ HEPES (рН=7.4), и референсного агониста СР 55940 (20 мкл).

Функциональную активность (по концентрации цАМФ) оценивали методом гомогенной флуоресценции с временным разрешением (HTRF). Интенсивность флуоресценции в базальном контроле принимается за фоновую и ее значение вычитается из интенсивностей флуоресценции в опыте (СМД анти-КР) и контроле (СР 55940):

Измеренный специфический ответ клетки на введение СМД анти-КР вычисляется по формуле: интенсивность флуоресценции в опыте (СМД анти-КР) - интенсивность флуоресценции в базальном контроле.

Измеренный специфический ответ клетки на введение референсного агониста (СР 55940) вычисляется по формуле: интенсивность флуоресценции в контроле (СР 55940) - интенсивность флуоресценции в базальном контроле.

Результаты выражаются в процентах ингибирования специфического ответа клетки на введение референсного агониста (СР 55940) в контроле:

% ингибирования ответа референсного агониста = 100% - ((измеренный специфический ответ / специфический ответ в контроле на введение референсного агониста) × 100%)

В результате исследований показано (см. таблицу 1), что СМД анти-КР изменяет функциональную активность каннабиноидного рецептора 1 типа, оцененную по концентрации внутриклеточной цАМФ.

Образец (сверхмалые дозы антител к каннабиноидному рецептору I типа (смесь гомеопатических разведении С12+С30+С200)) проявляет свойства агониста каннабиноидному рецептору I типа, выраженность модифицирующего эффекта которого составляет 21% от эффекта стандартного агониста СР 55940 (эффект стандартного агониста принимается за 100%).

Таблица 1.
Рецептор	Препарат	Содержание СМД анти-КР в лунке (% по объему) (общий объем всех соединений в лунке равен 200 мкл)	Режим агониста	Режим агониста	Пояснения к результатам
% ответа на СМД анти-КР	Стандартный агонист	% ингибирования ответа агониста	Стандартный антагонист
СВ1-Рецептор каннабиноидный 1 типа	СМД анти-КР	10%	21	CP 55940	0	AM 281	СМД анти-КР обладают эффектом агониета, выраженность которого составляет 21% от эффекта стандартного агониста (принимается за 100%)

Пример 2.

Для исследования свойств заявленного лекарственного средства был использован водный раствор активированной-потенцированной формы поликлональных кроличьих антител к каннабиноидному рецептору I типа человека, очищенных на антигене, в сверхмалой дозе, полученной сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз эквивалентной смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С200 (сверхмалые дозы - СМД анти-КР).

В исследовании использованы 40 мышей-самцов линии С57В1 (вес на начало исследования 13,5-15,5 г). 10 мышей получали обычный стандартный корм (стандартная диета), 30 мышей - стандартный корм с высококалорийными добавками (высококалорийная диета) и одновременно либо дистиллированную воду (контроль, 0,4 мл/кг), либо сибутрамин¹ (¹Меридиа 10 мг капсулы,Abbott GMBH, Германия) (10 мг/кг), либо СМД анти-КР (0,4 мл/кг). Все препараты вводили внутрижелудочно 1 раз в день в течение 5 месяцев. До начала введения препаратов (исходно), а также каждую неделю после начала их введения измеряли потребление мышами корма. Потребление корма оценивали как среднее количество пищи (г), потребленного мышью за 1 и 2 месяца исследования, и как среднее количестве корма на 10 г массы тела мыши.

Мыши в группе низкокалорийной диеты потребляли в среднем за весь период наблюдения на 15% меньше корма, чем мыши на высококалорийной диете (табл.2). И сибутрамин и СМД анти-КР снижали потребление корма, причем эффект сибутрамина был выражен несколько выше: препарат снижал потребление корма в неделю на 19,3% (р<0,05), в то время как СМД анти-КР - только на 9,3% относительно контроля (р>0,05). На Таблице 2 представлены результаты влияния СМД анти-КР и сибутрамина на потребление пищи мышами С57В1 (средние значения за 5 месяцев наблюдения), М±m.

Таблица 2.
Препарат	Потребление корма (г/мышь) в день	Потребление корма (г на 10 г массы тела) в день
Стандартная диета	2,95±1,42	1,35±0,05
Высококалорийная диета + дистиллированная вода	3,41±1,64#	1,54±0,05#
Высококалорийная диета + сибутрамин	2,75±1,36**	1,28±0,05**
Высококалорийная диета + диетра	3,10±2,02	1,44±0,08
Примечание: ** - отличия от контроля достоверны, р<0,01;# - отличия от стандартной диеты достоверны, р<0,05

Однако при анализе динамики потребления корма были выявлены следующие особенности. На двадцатой неделе эксперимента мыши на высокожировой диете, получавшие СМД анти-КР, потребляли больше корма по сравнению с первой неделей эксперимента, что пока