Способы борьбы с сорняками с использованием растений aad-1 и предпосевного и/или довсходового внесения гербицидов

Способы борьбы с сорняками с использованием растений aad-1 и предпосевного и/или довсходового внесения гербицидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ген aad-1 (первоначально известный из Sphingobium herbicidovorans) кодирует белок арилоксиалканоатдиоксигеназы (AAD-1). Этот признак придает устойчивость к гербицидам 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоте и арилоксифеноксипропионату (обычно называемым «фоп»-гербицидами, таким как квизалофоп) и может быть использован в качестве селектируемого маркера при трансформации растений и в селекционных питомниках. Ген aad-1, как таковой, в связи с устойчивостью растений к гербицидам впервые раскрыт в WO 2005/107437 (также см. US 2009-0093366).

На экспрессию гетерологичных или чужеродных генов у растений влияет то, в каком месте хромосомы встроен чужеродный ген. Это может быть следствием, например, структуры хроматина (например, гетерохроматина) или близости элементов регуляции транскрипции (например, энхансеров) к участку интеграции (Weising с соавторами, Ann. Rev. Genet. 22: 421-477, 1988). Один и тот же ген в одном и том же типе трансгенного растения (или другого организма) может проявлять широкую изменчивость уровня экспрессии при разных событиях. Также могут существовать различия в пространственных или временных картинах экспрессии. Например, различия в относительной экспрессии трансгена в разных растительных тканях могут не соответствовать картинам, ожидаемым, исходя из элементов регуляции транскрипции, присутствующих во введенной генной конструкции.

Таким образом, часто создают и подвергают скринингу большое количество событий, чтобы идентифицировать событие, которое приводит к экспрессии введенного представляющего интерес гена на уровне, достаточном для данной цели. В коммерческих целях обычно осуществляют от нескольких сотен до нескольких тысяч разных событий и осуществляют скрининг таких событий в отношении одного события, которое дает требуемые уровни и картины экспрессии трансгена. Событие, которое дает требуемые уровни и/или картины экспрессии трансгена, применимо для интрогрессии трансгена в другое генетическое окружение в результате полового ауткроссинга с использованием обычных способов селекции. У потомства от таких скрещиваний сохраняются характеристики экспрессии трансгена исходного трансформанта. Такую методику используют для того, чтобы обеспечить надежную экспрессию гена у некоторых сортов, которые хорошо адаптированы к местным условиям роста.

Заявки на выдачу патента США 20020120964 A1 и 20040009504 A1 относятся к генетическому событию PV-GHGT07(1445) в растениях хлопчатника и композициям и способам его выявления. WO 02/100163 относится к событию MONI5985 в растениях хлопчатника и композициям и способам его выявления. WO 2004/011601 относится к событию MON863 в растениях кукурузы и композициям и способам его выявления. WO 2004/072235 относится к событию MON88913 в растениях хлопчатника и композициям и способам его выявления.

WO 2006/098952 относится к событию 3272 у кукурузы. WO 2007/142840 относится к событию MIR162 у кукурузы.

Патент США № 7179965 относится к хлопчатнику, в котором произошло событие cry1F и событие cry1Ac. Кукуруза AAD-1, в которой произошло конкретное событие, раскрытое в настоящем описании, ранее не была описана.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к предпосевному и/или довсходовому внесению гербицида на площади или поле, которое засеяно семенами, в которых имеет место событие AAD-1. В некоторых предпочтительных вариантах в семени имеет место событие DAS-40278-9 кукурузы. В некоторых предпочтительных вариантах гербицид может представлять собой состав, содержащий активный ингредиент 2,4-D. Такие гербициды и составы также можно применять для предпосевного внесения. Дополнительные гербициды, такие как глифосат, можно использовать в комбинации, включая и предпосевное применение.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1 показана карта плазмиды pDAS1740.

На фигуре 2 показаны компоненты вставки для DAS-40278-9 (pDAS1740).

На фигуре 3 показана карта рестрикции и компоненты вставки для DAS-40278-9 (pDAS1740).

На фигуре 4 показаны ампликоны, праймеры и методика клонирования в случае ДНК-вставки и границы DAS-40278-9.

Фигура 5 иллюстрирует положения праймеров по отношению к вставке и границам DAS-40278-9.

Фигура 6 иллюстрирует области соединения и инсерцию DAS-40278-9.

Фигура 7 представляет собой диаграмму скрещивания, описанного в примере 7.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Последовательности SEQ ID NO: 1-28 являются праймерами, которые описаны в настоящей публикации.

SEQ ID NO: 29 представляет вставку и фланкирующие последовательности для рассматриваемого события DAS-40278-9.

Последовательности SEQ ID NO: 30-33 являются праймерами для фланкирующих маркеров, которые описаны в примере 4.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение включает предпосевное и/или довсходовое внесение гербицида на площадь или поле, которое затем засевают семенами, в которых имеет место событие AAD-1. В некоторых предпочтительных вариантах в семени имеет место событие DAS-40278-9 кукурузы. В некоторых предпочтительных вариантах гербицид может представлять собой состав, содержащий активный ингредиент 2,4-D. Такие гербициды и составы также можно применять для предпосевного внесения. Дополнительные гербициды, такие как глифосат, можно использовать в комбинации, включая и предпосевное применение. Настоящее изобретение не ограничено кукурузой, а может включать, например, применение хлопчатника и/или сои, содержащих ген aad-1.

Примеры, включенные в настоящее описание, отчасти относятся к предпосевному и/или довсходовому внесению гербицидов. Такие применения не ограничены событием «278». Кроме того, применимость устойчивости, обеспечиваемой генами AAD-1, может быть объяснима с учетом укороченного промежутка времени от применения до нового посева. Это обеспечивает растениеводам намного большую гибкость в составлении графика проводимых ими посевов относительно момента полного уничтожения сорняков («выжигания»). Без использования настоящего изобретения ожидание в течение 7-30 дней или около того после уничтожения сорняков до посева может быть причиной значительной потери урожая. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает преимущества в этом отношении. См., например, пример 13. Любые интервалы между посевами/внесением гербицидов и любые диапазоны концентраций/нормы расхода гербицида(ов), приведенные в качестве примеров или предлагаемые в настоящем описании, можно использовать согласно настоящему изобретению.

Таким образом, настоящее изобретение относится к новым способам применения гербицидов. Такие применения могут включать баковые смеси более чем одного гербицида. Некоторые предпочтительные гербициды для применения согласно настоящему изобретению включают феноксиауксиновый гербицид, такой как 2,4-D; 2,4-DB; MCPA; MCPB. Такие применения можно сочетать с одним или несколькими дополнительными генами устойчивости к гербицидам и соответствующим гербицидом (например, глифосатом и/или глюфосинатом). Один, два, три или больше гербицидов можно использовать в преимущественных комбинациях, которые могут быть очевидны для специалиста в данной области, обладающих эффектом настоящего изобретения. Один или несколько предлагаемых гербицидов можно вносить на поле/площадь перед засеванием семенами согласно настоящему изобретению. Такое внесение можно осуществлять, например, в пределах 14 дней до посева. Один или несколько предлагаемых гербицидов также можно вносить при посеве и/или после посева, но до всходов. Один или несколько предлагаемых гербицидов также можно вносить на почву (для борьбы с сорняками) или поверх сорняков и/или трансгенных растений согласно настоящему изобретению. Три рассматриваемых гербицида можно чередовать или применять в комбинации, например, для борьбы или предотвращения появления сорняков, которые могут быть устойчивы к одному гербициду, но не к другому. Можно использовать разное время внесения трех рассматриваемых типов гербицидов различными путями, которые могут быть известны в данной области.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к предпосевному внесению гербицида на площади или поле, которое затем засевают семенами, в которых имеет место событие AAD-1. В некоторых предпочтительных вариантах в семени имеет место событие DAS-40278-9 кукурузы. В некоторых предпочтительных вариантах гербицид может представлять собой состав, содержащий активный ингредиент 2,4-D. Такие гербициды и составы можно применять для предпосевного внесения. Дополнительные гербициды, такие как глифосат, можно использовать в комбинации при предпосевном внесении. В любом из таких вариантов можно использовать, например, кукурузу, хлопчатник и сою.

Ген aad-1 можно комбинировать, например, с признаками, кодирующими резистентность к глифосату (например, резистентными растительными или бактериальными EPSPS, GOX, GAT), резистентность к глюфосинату (например, Pat, bar), резистентность к гербициду, ингибирующему ацетолактатсинтазу (ALS) (например, имидазолинонам [таким как имазетапир], сульфонилмочевине, триазолопиримидинсульфонанилиду, пиримидинилтиобензоатам и другим химическим составам [Csr1, SurA и другим]), резистентность к бромоксинилу (например, Bxn), резистентность к ингибиторам фермента HPPD (4-гидроксифенилпируватдиоксигеназы), резистентность к ингибиторам фитоиндесатуразы (PDS), резистентность к гербицидам, ингибирующим фотосистему II (например, psbA), резистентность к гербицидам, ингибирующим фотосистему I, резистентность к гербицидам, ингибирующим протопорфининогеноксидазу IX (PPO) (например, PPO-1), резистентность к гербицидам на основе фенилмочевины (например, CYP76B1), ферменты, разрушающие дикамбу (см., например, US 20030135879), и другие, которые можно подвергать стэкингу по отдельности или во множестве разных комбинаций для обеспечения возможности эффективно бороться с сорняками или предотвращать смену сорняков и/или резистентность к любому гербициду указанных выше классов.

Что касается дополнительных гербицидов, то некоторые дополнительные предпочтительные ингибиторы ALS (также известной как AHAS) включают триазолопиримидинсульфонанилиды (такие как клорансулам-метил, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам и пенокссулам), пиримидинилтиобензоаты (такие как биспирибак и пиритиобак) и флукарбазон. Некоторые предпочтительные ингибиторы HPPD включают мезотрион, изоксафлутол и сулкотрион. Некоторые предпочтительные ингибиторы PPO включают флумиклорак, флумиоксазин, флуфенпир, пирафлуфен, флутиацет, бутафенацил, карфентразон, сульфентразон и дифениловые эфиры (такие как ацифлуорфен, фомесафен, лактофен и оксифлуорфен).

Гены AAD-1 для применения согласно настоящему изобретению также могут обеспечивать резистентность к соединениям, которые превращаются в феноксиацетатауксиновые гербициды (например, 2,4-DB, MCPB и т.д.). Остаток масляной кислоты, присутствующий в гербициде 2,4-DB, превращается в результате β-окисления в фитотоксичную 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту. Подобным образом, MCPB превращается в результате β-окисления в фитотоксичный MCPA. Гербициды на основе масляной кислоты сами по себе не являются гербицидными. Они превращаются в соответствующую им кислоту в результате β-окисления в чувствительных растениях, и такая уксуснокислая форма гербицида является фитотоксичной. Растения, неспособные к быстрому β-окислению, не получают вреда от гербицидов на основе масляной кислоты. Однако растения, которые способны к быстрому β-окислению и могут превращать гербицид на основе масляной кислоты в уксуснокислую форму, в дальнейшем оказываются защищены присутствующим AAD-1.

Настоящее изобретение охватывает событие AAD-1 у кукурузы, обозначаемое DAS-40278-9, имеющей семена, депонированные в Американской коллекции типов культур (ATCC) с номером доступа PTA-10244, и полученное из них потомство. Другие аспекты включают растения-потомки, семена и зерно или регенерируемые части растений и семена и потомство кукурузы в случае события DAS-40278-9, а также полученные из них корма и пищевые продукты. Настоящее изобретение также охватывает части растений кукурузы, где имеет место событие DAS-40278-9, которые включают без ограничения пыльцу, семязачаток, цветки, побеги, корни и листья и ядра вегетативных клеток, клеток пыльцы и яйцеклеток. Кроме того, раскрыты растения кукурузы, обладающие устойчивостью к феноксиауксиновым и/или арилоксиалканоатным гербицидам, к новым генетическим составам в случае события DAS-40278-9 у кукурузы и аспектам агрономической эффективности растений кукурузы, имеющих событие DAS-40278-9 кукурузы.

Настоящее изобретение охватывает способы селекции растений и устойчивые к гербицидам растения, включая событие трансформации aad-1 в растениях кукурузы, содержащих полинуклеотидную последовательность, которая описана в настоящей публикации, встроенную в конкретный участок генома клетки кукурузы.

В некоторых вариантах указанное событие/полинуклеотидная последовательность могут быть «подвергнуты стэкингу» с другими признаками, включая, например, другой ген (гены) устойчивости к гербицидам и/или подавляющие насекомых белки. Также в настоящей публикации описаны растения, имеющие единичное событие.

Дополнительные признаки могут быть подвергнуты стэкингу в геноме растения путем скрещивания растений, повторной трансформации трансгенного растения, имеющего событие DAS-40278-9 кукурузы, или добавления новых признаков в результате целенаправленной интеграции посредством гомологичной рекомбинации.

Другие варианты включают эксцизию полинуклеотидных последовательностей, в которых произошло событие DAS-40278-9 кукурузы, включая, например, кассету экспрессию гена pat. После эксцизии полинуклеотидной последовательности модифицированное событие может быть перенаправлено в конкретный участок хромосомы, где дополнительные полинуклеотидные последовательности подвергают стэкингу с событием DAS-40278-9 кукурузы.

В одном варианте изобретение относится к сайту-мишени в хромосоме кукурузы, локализованному в хромосоме 2 в положении примерно 20 сМ между SSR-маркерами UMC 1265 (см. SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 31) и MMC0111 (см. SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33), примерно 20 сМ на карте сцепления кукурузы 2008 DAS, при этом сайт-мишень содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту. В другом варианте изобретение относится к сайту-мишени в хромосоме кукурузы, содержащему положение, определяемое в последовательности или последовательностью SEQ ID NO: 29, и его остаткам, которые описаны в настоящей публикации, как будет понятно специалисту в данной области.

В одном варианте изобретение относится к способу получения трансгенного растения кукурузы, содержащего вставку гетерологичной нуклеиновой кислоты в хромосоме 2 в положении примерно 20 сМ между SSR-маркерами UMC1265 (см. SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 31) и MMC0111 (см. SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33) в положении примерно 20 сМ на карте сцепления кукурузы 2008 DAS. В еще одном варианте встроенная гетерологичная нуклеиновая кислота фланкирована с 5’-стороны всей или частью 5’-фланкирующей последовательности, которая определена в настоящем описании со ссылкой на последовательность SEQ ID NO: 29, и фланкирована с 3’-стороны всей или частью 3’-фланкирующей последовательности, которая определена в настоящем описании со ссылкой на последовательность SEQ ID NO: 29.

Кроме того, в настоящем описании раскрыты анализы для выявления присутствия данного события в образце (например, зерне кукурузы). Анализы могут быть основаны на последовательности ДНК рекомбинантной конструкции, встроенной в геном кукурузы, и на геномных последовательностях, фланкирующих сайт инсерции. Также предлагаются наборы и условия, применимые для проведения анализов.

Также в настоящем описании раскрыто клонирование и анализ последовательностей ДНК полной вставки AAD-1 и ее пограничных областей (в трансгенных линиях кукурузы). Такие последовательности являются уникальными. На основании таких последовательностей вставки и границ создавали специфичные для события праймеры. ПЦР-анализ показал, что такие события можно идентифицировать посредством анализа ПЦР-ампликонов, образуемых с использованием таких специфичных для события наборов праймеров. Таким образом, указанные и другие родственные способы можно применять для того, чтобы однозначно идентифицировать линии кукурузы, в которых имеет место такое событие.

Настоящее изобретение включает применение скрещивания растений и устойчивых к гербицидам растений. Настоящее изобретение включает новые применения событий трансформации растений кукурузы, содержащих рассматриваемые полинуклеотидные последовательности aad-1, которые описаны в настоящей публикации, встроенные в конкретный участок в геноме клетки кукурузы. В некоторых вариантах указанная полинуклеотидная последовательность может быть «подвергнута стэкингу» с другими признаками (такими как другой ген (гены) устойчивости к гербицидам, который кодируют, например, белки, подавляющие насекомых. В некоторых вариантах указанные полинуклеотидные последовательности могут быть вырезаны и затем снова направлены к мишени с дополнительными полинуклеотидными последовательностями. Однако настоящее изобретение включает растения, в которых имеет место единичное событие, которое описано в настоящей публикации.

Кроме того, настоящее изобретение относится к анализам для выявления наличия данного события в образце. Аспекты включают способы конструирования и/или получения любых диагностических молекул нуклеиновой кислоты, приведенных в качестве примера или предлагаемых в настоящем описании, в частности, молекул, полностью или частично основанных на рассматриваемых фланкирующих последовательностях.

Более конкретно, настоящее изобретение отчасти относится к трансгенному событию DAS-40278-9 у кукурузы (также известному как pDAS 1740-278), к применению линий растений, в которых имеют место такие события, и клонированию и анализу последовательностей ДНК такой вставки и/или ее пограничных областей. Линии растений для применения согласно настоящему изобретению можно выявить с использованием последовательностей, раскрытых и предлагаемых в настоящем описании. В некоторых вариантах настоящее изобретение относится к устойчивым к гербицидам линиям кукурузы и к их идентификации. Настоящее изобретение отчасти относится к выявлению наличия данного события, чтобы определить, имеет ли потомство от полового скрещивания представляющее интерес событие. Кроме того, включен способ выявления события, и такой способ применим, например, для того, чтобы обеспечить соблюдение регламента, требующего предпродажного разрешения и нанесения метки на продукты, полученные, например, из рекомбинантных культурных растений. Можно выявлять наличие данного события любым хорошо известным способом выявления нуклеиновой кислоты, таким как полимеразная цепная реакция (ПЦР) или ДНК-гибридизация с использованием зондов нуклеиновых кислот. Специфичный для определенного события ПЦР-анализ обсуждается, например, Windels с соавторами (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b: 459462, 1999). Обсуждение относится к идентификации устойчивого к глифосату события 40-3-2 у сои посредством ПЦР с использованием набора праймеров, охватывающих соединение между вставкой и фланкирующей ДНК. Более конкретно, один праймер содержал последовательность из вставки, а второй праймер содержал последовательность из фланкирующей ДНК.

Кукурузу модифицировали с использованием инсерции гена aad-1 из Sphingobium herbicidovorans, который кодирует белок арилоксиалканоатдиоксигеназы (AAD-1). Признак придает устойчивость к гербицидам 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоте и арилоксифеноксипропионату (обычно называемым «фоп»-гербицидами, таким как квизалофоп) и может быть использован в качестве селектируемого маркера при трансформации растений и в селекционных питомниках. Трансформацию кукурузы фрагментом ДНК из плазмиды pDAS1740 переносили, используя скрещивание, получая событие DAS-40278-9.

Образцы геномной ДНК, экстрагированной из двадцати отдельных растений кукурузы, полученных из пяти поколений, по четыре растения на поколение события DAS-40278-9, отбирали для молекулярной характеристики события DAS-40278-9 для AAD-1-кукурузы. Экспрессию белка AAD-1 тестировали, используя набор полосок для быстрого специфичного для AAD-1 теста. Для последующей молекулярной характеристики отбирали только растения, которые тестировали как позитивные в отношении экспрессии белка AAD-1. Саузерн-гибридизация подтвердила, что ген aad-1 присутствует в растениях кукурузы, которые в тесте выявляли как позитивные в отношении экспрессии белка AAD-1, и ген aad-1 был встроен в виде одной интактной копии в такие растения в том случае, когда происходила гибридизация с зондом гена aad-1.

Также в настоящей публикации описана молекулярная характеристика встроенной ДНК в случае события DAS-40278-9 для AAD-1-кукурузы. Событие было получено посредством прокалывания клеток путем встряхивания их в суспензии микроигл (Whiskers) с использованием Fsp I-фрагмента плазмиды pDAS1740. Саузерн-блот-анализ использовали для установления картины интеграции встроенного фрагмента ДНК и определения количества вставок/копий гена aad-1 в событии DAS-40278-9. Были получены данные для демонстрации интеграции и целостности трансгена aad-1, встроенного в геном кукурузы. Осуществляли характеристику интеграции некодирующих областей (предназначенных для регуляции кодирующих областей), таких как промоторы и терминаторы, участки прикрепления к матриксу RB7 Mar v3 и RB7 Mar v4, а также оценивали стабильность вставки трансгена в поколениях. Стабильность встроенной ДНК показана на протяжении пяти отдельных поколений растений. Кроме того, показано отсутствие последовательности остова трансформирующей плазмиды, включая область гена устойчивости к ампициллину (Ap^r), с использованием зондов, охватывающих почти всю область остова, фланкирующую сайты рестрикции (Fsp I) плазмиды pDAS1740. Подробная физическая карта инсерции получена на основе таких Саузерн-блот-анализов события DAS-40278-9.

Определяли уровни белка AAD-1 в тканях кукурузы. Кроме того, осуществляли анализ состава кукурузного фуража и зерна, чтобы исследовать эквивалентность между изогенной нетрансформированной линией кукурузы и трансгенной линией кукурузы DAS-40278-9 (неопрыскиваемой, опрыскиваемой 2,4-D, опрыскиваемой квизалофопом и опрыскиваемой и 2,4-D и квизалофопом). Агрономические характеристики изогенной нетрансформированной линии кукурузы также сравнивали с кукурузой DAS-40278-9.

Экспрессию в полевых условиях, состав питательных веществ и агрономические испытания нетрансгенного контроля и гибридной линии кукурузы, содержащей арилоксиалканоатдиоксигеназу-1 (AAD-1), проводили в один и тот же год в шести местоположениях в Айове, Иллинойсе (2 местоположения), Индиане, Небраске и Онтарио в Канаде. Уровни экспрессии суммированы в настоящем описании для белка AAD-1 в листьях, пыльце, корне, фураже, целом растении и зерне, представлены результаты агрономических определений и анализа состава образцов фуража и зерна в контроле и растениях кукурузы AAD-1 DAS-40278-9.

Растворимый экстрагируемый белок AAD-1 измеряли, используя способ количественного твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), в листьях, пыльце, корне, фураже, целом растении и зерне кукурузы. Хорошие средние значения экспрессии наблюдали в тканях корня и пыльцы, как более подробно обсуждается в настоящем описании. Значения экспрессии были сходными при всех обработках опрыскиванием, а также в случае делянок, опрыскиваемых и неопрыскиваемых гербицидами 2,4-D и квизалофопом.

Анализ состава, включая пищевые составляющие, минералы, аминокислоты, жирные кислоты, витамины, антипитательные вещества и вторичные метаболиты, проводили для того, чтобы исследовать эквивалентность кукурузы AAD-1 DAS-40278-9 (с обработкой или без обработки гербицидами) контролю. Все результаты анализа состава образцов AAD-1 DAS-40278-9 были такими же хорошими или лучше (биологически и агрономически), чем результаты, полученные на основе контрольных линий и/или обычной кукурузы, как и в случае агрономических данных, собранных с контрольных делянок и делянок с кукурузой AAD-1 DAS-40278-9.

Как упоминается выше в разделе «Уровень техники», введение и интеграция трансгена в геном растений включают некоторые случайные события (поэтому название «событие» используют для данной инсерции, которая экспрессируется). То есть в случае многих методик трансформации, таких как трансформация с помощью Agrobacterium, «генная пушка» и WHISKERS, невозможно предсказать, в каком месте генома будет встроен трансген. Таким образом, идентифицикация фланкирующей геномной ДНК растения с обеих сторон вставки может быть важна для идентификации растения, в котором произошло такое событие инсерции. Например, могут быть сконструированы ПЦР-праймеры, которые создают ПЦР-ампликон, охватывающий область соединения вставки и генома хозяина. Такой ПЦР-ампликон можно использовать для идентификации уникального или отличающегося типа инсерционного события.

Так как «события» исходно являются случайными событиями, то в качестве части настоящего раскрытия, по меньшей мере 2500 семян линии кукурузы, в которой имеет место событие, были депонированы и сделаны доступными для общественности без ограничения (но на которые распространяется патентное право) в Американской коллекции типов культур (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. Депозит получил депозитарный номер ATCC PTA-10244 (гибридные семена желтой зубовидной кукурузы (Zea Mays L.): DAS-40278-9; депонированы от имени Dow AgroSciences LLC; Дата получения семян/линии(ий) в ATTC: 10 июля 2009; жизнеспособность подтверждена 17 августа 2009). Указанный депозит был сделан и будет поддерживаться в соответствии и по условиям Будапештского договора в отношении депонирования семян для целей патентной процедуры. Депозит будет поддерживаться без ограничения в депозитарии ATCC, который является общедоступным депозитарием, в течение периода времени, составляющего 30 лет, или пять лет после самого последнего запроса, или в течение срока эффективного действия патента, какой угодно продолжительности, и будет заменен, если он станет нежизнеспособным в течение данного периода.

Депонированные семена являются частью раскрытого изобретения. Ясно, что растения кукурузы могут быть выращены из таких семян, и такие растения являются частью настоящего изобретения. Настоящее изобретение также относится к последовательностям ДНК, находящимся в таких растениях кукурузы, которые применимы для выявления таких растений и их потомства. Способы выявления и наборы согласно настоящему изобретению могут быть направлены на идентификацию любого одного, двух или даже всех трех указанных событий, в зависимости от конечной цели такого теста.

Определения и примеры приведены в настоящем описании, чтобы помочь описать настоящее изобретение и проинструктировать специалистов в данной области в отношении осуществления изобретения на практике. Если не указано иное, термины следует понимать в соответствии с их обычным использованием специалистами в соответствующей области. Использована номенклатура оснований для ДНК, которая указана в 37 CFR § 1.822.

В используемом в настоящем описании смысле термин «потомство» означает потомство любого поколения, полученного от исходного растения, в котором имеет место событие DAS-40278-9 AAD-1 кукурузы.

Трансгенное «событие» получают в результате трансформации растительных клеток гетерологичной ДНК, т.е. конструкцией нуклеиновой кислоты, которая включает представляющий интерес трансген, регенерации популяции растений, полученных в результате инсерции трансгена в геном растения и отбора конкретного растения, характеризуемого инсерцией в конкретное положение в геноме. Термин «событие» относится к исходному трансформанту и потомству трансформанта, которые содержат гетерологичную ДНК. Термин «событие» также относится к потомству, полученному в результате полового ауткроссинга между трансформантом и другим сортом, который содержит геномную/трансгенную ДНК. Даже после повторного возвратного скрещивания с родительской формой встроенная ДНК трансгена и фланкирующая геномная ДНК (геномная/трансгенная ДНК) из трансформированного родителя присутствует в потомстве от скрещивания в том же самом положении в хромосоме. Термин «событие» также относится к ДНК из исходного трансформанта и его потомства, содержащих встроенную ДНК и фланкирующую геномную последовательность непосредственно вблизи со встроенной ДНК, которая, как можно ожидать, может быть передана потомству, которое получает встроенную ДНК, включая представляющий интерес трансген, в результате полового скрещивания одной родительской линии, которая содержит встроенную ДНК (например, исходный трансформант и потомство, полученное в результате самоопыления), и родительской линии, которая не содержит встроенной ДНК.

«Последовательность соединения» охватывает точку, в которой ДНК, встроенная в геном, связана с ДНК из нативного генома кукурузы, фланкирующей точку инсерции, при этом идентификация или выявление одной из таких последовательностей соединения в генетическом материале растения является достаточной для того, чтобы диагностировать событие. Также включены последовательности ДНК, которые охватывают инсерции в описанных в настоящей публикации событиях и сходные длины фланкирующей ДНК. Конкретные примеры таких диагностических последовательностей приведены в настоящем описании; однако другие последовательности, которые перекрывают соединения инсерций или соединения инсерций и геномной последовательности, также являются диагностическими и могут быть использованы согласно настоящему изобретению.

Настоящее раскрытие включает идентификацию таких фланкирующих последовательностей, последовательностей соединения и вставки. Включены соответствующие ПЦР-праймеры и ампликоны. Способы ПЦР-анализа с использованием ампликонов, которые перекрывают встроенную ДНК и ее границы, можно применять для выявления или идентификации запущенных в коммерческое производство трансгенных сортов или линий кукурузы, полученных из данных патентуемых трансгенных линий кукурузы.

Полные последовательности каждой из таких вставок вместе с частями соответствующих фланкирующих последовательностей представлены в настоящем описании в виде SEQ ID NO: 29. Координаты вставки и фланкирующих последовательностей для данного события по отношению к последовательности SEQ ID NO: 29 (всего 8557 пар оснований) помещены ниже. Более подробное обсуждение приведено, например, в примере 3.8. Предпосевные варианты осуществления настоящего изобретения включают применение белка AAD-1, кодируемого остатками 1874-6689 последовательности SEQ ID NO: 29.

	5’ Фланкирующая	Вставка	3’ Фланкирующая
Номера остатков (Seq:29)	1-1873	1874-6689	6690-8557
Длина (п.н.)	1873 п.н.	4816 п.н.	1868 п.н.

Такое событие инсерции и его дополнительные компоненты показаны далее на фигурах 1 и 2. Такие последовательности (в частности, фланкирующие последовательности) являются уникальными. На основании таких последовательностей вставки и границ создавали специфичные для события праймеры. ПЦР-анализ показал, что такие линии кукурузы могут быть идентифицированы в разных генотипах кукурузы с использованием анализа ПЦР-апликонов, создаваемых с использованием таких специфичных для события наборов праймеров. Таким образом, указанные и другие родственные способы можно использовать для однозначной идентификации таких линий кукурузы. Последовательности, указанные в настоящем описании, являются уникальными. Например, поиски с помощью BLAST в базах данных GENBANK не выявили какой-либо значимой гомологии между клонированными последовательностями границ и последовательностями в базе данных.

Способы выявления особенно применимы вместе с селекцией растений для определения того, какие растения в потомстве имеют данное событие после того, как родительское растение, имеющее представляющее интерес событие, скрещивают с растением другой линии, чтобы попытаться придать один или несколько дополнительных признаков потомству. Такие способы ПЦР-анализа полезны для осуществления программ селекции кукурузы, а также для контроля качества, особенно в случае коммерческого производства трансгенного кукурузного зерна. Также могут быть получены и использованы наборы для ПЦР-детекции таких трансгенных линий кукурузы. Способы также могут быть полезны для регистрации продукта и управления производством продукта.

Кроме того, фланкирующие кукурузные/геномные последовательности можно использовать для специфичной идентификации положения каждой вставки в геноме. Такая информация может быть использована для получения молекулярных маркерных систем, специфичных для каждого события. Такие системы можно применять для систем ускоренной селекции и установления данных о сцеплении.

Кроме того, информацию о фланкирующих последовательностях можно использовать для исследования и характеристики процесса интеграции трансгена, характеристики сайта интеграции в геноме, сортировки событий, стабильности трансгенов и фланкирующих его последовательностей и экспрессии гена (особенно в отношении сайленсинга гена, картин метилирования гена, эффектов положения и потенциально связанных с экспрессией элементов, таких как MAR [участки прикрепления к матриксу] и тому подобного).

Настоящее изобретение включает семена, доступные из ATCC с номером депозита PTA-10244. Настоящее изобретение также относится к применению резистентного к гербицидам растения кукурузы, выращенного из семени, депонированного в ATCC под номером доступа PTA-10244. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению частей указанного растения, таких как листья, образцы тканей, семена, полученные от указанного растения, пыльца и тому подобное.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению растений, родственных по нисходящей линии, и/или потомков растения, выращенного из депонированного семени, предпочтительно устойчивого к гербицидам растения кукурузы, при этом указанное растение имеет геном, содержащий регистрируемую последовательность соединения геномной ДНК дикого типа/ДНК вставки, которая описана в настоящей публикации. В используемом в настоящем описании смысле термин «кукуруза» означает кукурузу Zea mays и включает все ее сорта, которые можно скрещивать.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам осуществления скрещиваний с использованием растения согласно настоящему изобретению в качестве по меньшей мере одного из родителей. Например, настоящее изобретение относится к применению гибридного растения F₁, имеющего в качестве одного или обоих родителей любое из растений, приведенных в настоящем описании в качестве примера. Также в объем настоящего изобретения входит применение семени, полученного от таких гибридов F₁ согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способу получения гибридного семени F1 в результате скрещивания приведенного в качестве примера растения с другим растением (например, инбредным родителем) и сбора полученного в результате гибридных семян. Настоящее изобретение относится к применению приведенного в качестве примера растения, которое является либо родителем женского пола, либо родителем мужского пола. Характеристики полученных в результате растений могут быть улучшены за счет тщательного подбора родительских растений.

Селекцию устойчивого к гербицидам растения кукурузы можно осуществлять, используя первое половое скрещивание первого родительского растения кукурузы, представляющего собой растение кукурузы, выращенное из семени любой из линий, указанных в настоящем описании, и второго родительского растения кукурузы, с получением при этом множества растений-потомков первого поколения; и затем используя отбор растения-потомка первого поколения, которое является резистентным к гербициду (или растения, в котором имеет место по меньшей мере одно из событий согласно настоящему изобретению); и самоопыление растения-потомка первого поколения с получением при этом множества растений-потомков второго поколения; и затем используя отбор из ра