Антитело, блокирующее agr2, и его применение

Антитело, блокирующее agr2, и его применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к моноклональному антителу в области генетической иммунологии и молекулярной биотехнологии, в частности, к антителу, блокирующему AGR2, и его применению.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Белок переднего градиента-2 (AGR2) впервые обнаружили посредством дифференциального скрининга клеточной линии рака молочной железы человека с экспрессией рецепторов эстрогена (Kuang, W.W., et al., Nucleic Acids Res, 1998. 26(4): p. 1116-23.), а затем получили его полноразмерный клон кДНК. При сравнении было обнаружено, что он является гомологом связанного с развитием белка жабы XA-2, этот белок был назван hAG-2 (Thompson, D.A. and R.J. Weigel, hAG-2, Biochem Biophys Res Commun, 1998. 251(1): p. 111-6.). AGR2 имеет высокую гомологию с белок-дисульфидизомеразой (PDI) (Persson, S., et al. Mol Phylogenet Evol 2005 36(3): p.734-40.), и обладает активностью PDI (Park, S.W., et al., PNAS, 2009. 106(17): p. 6950-5.). AGR2 содержит активный центр PDI "CXXS", который отличают от нормального сайта PDI "CXXC". В ходе изучения других белков PDI было показано, что активный центр "CXXS" выполняет функцию перестройки дисульфидных связей, но лишен способности создания дисульфидных связей. Это означает, что AGR2 выполняет функцию нарушения нормального роста клеток, но не обладает способностью восстанавливать функции клеток. (Anelli, T., et al., EMBO J, 2002. 21(4): p. 835-44. Anelli, T., et al., EMBO J, 2003. 22(19): p. 5015-22.).

AGR2 представляет собой маркерный белок для первичной и вторичной опухолей, обнаруживается в системе кровообращения пациентов с опухолью и тесно связан с развитием и метастазированием опухолей. AGR2 обладает эффектом стимулирования трансформации и миграции клеток рака молочной железы (Liu D, et al. Cancer Res, 2005, 65(9): 3796-3805.). AGR2 может повышать инвазивные свойства клеток рака поджелудочной железы, тем самым стимулируя метастазирование опухоли (Ramachandran V, et al. Cancer Res, 2008, 68(19): 7811-7818.). AGR2 играет ключевую роль в метастазировании рака предстательной железы (Zhang Y, et al. Cancer Res, 2010,70(1): 240-248.). Только в 2010 году Kathryn et al. показали, что поликлональное антитело к AGR2 может ингибировать рост клеток рака молочной железы (Kathryn E Vanderlaag, et al. Breast cancer, 2010, 12.).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к следующим техническим решениям:

Антитело, специфически связывающееся с белком AGR2, которое связывается с по существу тем же эпитопом белка AGR2, что и мышиное моноклональное антитело 18A4 к белку AGR2 человека.

Антитело по п.1, которое представляет собой мышиное моноклональное антитело 18A4 к AGR2 человека или его гуманизированную или химерную форму.

Антитело по п.1 или 2, где указанный эпитоп содержится в домене с протеин-дисульфидизомеразной активностью белка AGR2.

Антитело по любому из п.п.1-4, где активный домен AGR2, с которым связывается антитело, представляет собой CPHS; предпочтительно антитело связывается с обязательной связывающей областью, показанной в PLMIIHHLDE CPHSQALKKV FA (Seq ID No. 12).

Антитело по любому из приведенных выше пунктов, содержащее, по меньшей мере, одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности CDR1 тяжелой цепи, показанной в Seq ID No. 8, аминокислотной последовательности CDR2 тяжелой цепи, показанной в Seq ID No. 9, аминокислотной последовательности CDR3 тяжелой цепи, показанной в Seq ID No. 10, аминокислотной последовательности CDR1 легкой цепи, показанной в Seq ID No. 11, аминокислотной последовательности CDR2 легкой цепи, показанной в Seq ID No. 12, и аминокислотной последовательности CDR3 легкой цепи, показанной в Seq ID No. 13.

Антитело по п.5, содержащее аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи, показанную в DYNMD (Seq ID No.8), аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи, показанную в DINPNYDTTSYNQKFQG (Seq ID No.9), аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи, показанную в SM MGYGSPMDY (Seq ID No. 10), аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи, показанную в RASKSVSTSGYSYMH (Seq ID No. 11), аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи, показанную в LASNLES (Seq ID No. 12), и аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи, показанную в QHIRELPRT (Seq ID No. 13).

Антитело по п.6, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела показана в Seq ID No. 2, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела показана в Seq ID No. 1.

Антитело по п.6, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи показана в Seq ID No. 4, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела показана в Seq ID No. 3.

Антитело по любому из п.п.1-8, которое представляет собой гуманизированное антитело, предпочтительно гуманизированное интактное IgG1 антитело.

Антитело по любому из п.п.1-9, которое представляет собой фрагмент антитела, предпочтительно фрагмент Fab, Fab’, F(ab’)₂, Fv, линейное антитело или одноцепочечное антитело, более предпочтительно фрагмент Fab.

Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из п.п.1-10, и фармацевтически приемлемый носитель.

Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по любому из п.п.1-10.

Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.12.

Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.13.

Способ получения гуманизированного антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по п.14, позволяющей экспрессировать нуклеиновую кислоту и получить антитело.

Способ по п.15, далее включающий получение антитела из культуры клетки-хозяин.

Способ применением антитела по любому из пп.1-10 для лечения заболевания, ассоциированного с патологическим ангиогенезом у млекопитающего, включающий этап введения антитела млекопитающему.

Способ по п.17, где заболевание представляет собой злокачественную опухоль.

Способ по п.18, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака молочной железы, рака яичников, остеосаркомы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, колоректального рака и немелкоклеточного рака легких, злокачественной опухоли почки, рака головы и шеи, меланомы и множественной миеломы.

Способ по п.19, где лечение включает этап одновременного или последовательного введения второго терапевтического средства и антитела.

Способ по п.20, где второе терапевтическое средство выбрано из антиангиогенного средства, химиотерапевтического средства и цитотоксического средства.

Применение антитела по любому из п.п.1-10 для получения лекарственного средства для лечения заболевания, ассоциированного с патологическим ангиогенезом у млекопитающего, где заболевание предпочтительно представляет собой злокачественную опухоль, и более предпочтительно злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака молочной железы, рака яичников, остеосаркомы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, колоректального рака, немелкоклеточного рака легких, злокачественной опухоли почки, рака головы и шеи, меланомы и множественная миелома.

Изобретение дополнительно относится к применению антитела по любому из п.п.1-10 для детектирования экспрессии AGR2 в образце ткани или клеток пациента.

Изобретение дополнительно относится к применению антитела по любому из п.п.1-10 для получения средства, набора или состава для детектирования экспрессии AGR2 в образце ткани или клеток пациента.

Изобретение относится к гибридомной клеточной линии 18A4. Эту гибридомную клеточную линию поместили в коллекцию Китайского центра типовых клеток (CCTCC) 19 января 2009 года с номером CCTCC-C200902 по адресу Wuhan University, Luojiashan, Wuchang, Wuhan, Hubei Province.

Связывание полученного приведенным выше способом по изобретению антитела с AGR2 можно детектировать посредством общепринятого в данной области способа, например, ELISA.

Способ получения включает следующие стадии:

Стадия 1: Получение культуральной жидкости гибридомных клеток.

Стадия 2: Очистка моноклонального антитела.

Антитело, полученное приведенным выше способом по изобретению, можно использовать для блокирования стимуляции роста опухоли и метастазирования белком AGR2, особенно для ингибирования скорости роста клеток рака молочной железы (аномального по сравнению с нормальными тканями) in vitro и ингибирования метастазирования опухолевых клеток in vitro, и кроме того, для ингибирования роста, миграции и инвазивного метастазирования клеток рака молочной железы T47D in vitro; также оно может ингибировать клеточный цикл клеток рака молочной железы T47D in vitro.

Аномальная скорость роста относится к скорости роста, превышающей необходимую для нормального гомеостаза in vivo и превышающую скорость роста нормальных тканей того же происхождения.

Блокирование или ингибирование относятся к уменьшению или устранению активного эффекта.

Ингибирование скорости роста клеток рака молочной железы in vitro относится увеличению или уменьшению числа опухолевых клеток in vitro. Регуляцию роста опухолевых клеток in vitro можно проводить способом, известным в данной области, например, посредством MTT, как показано в примерах.

Ингибирование метастазирования опухолевых клеток in vitro относится к уменьшению миграции и инвазивного метастазирования опухолевых клеток in vitro. Регуляцию метастазирования опухолевых клеток in vitro можно проводить способом, известным в данной области, таким как способы с применением камеры трансвелл.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 представлено детектирование специфичности AGR2 посредством ELISA.

На фиг.2 представлено детектирование специфичности AGR2 посредством иммуноблоттинга. A. 1 - клеточный лизат MCF7; 2 - лизат MB-231, трансфицированных AGR2-pcDNA3; 3 - лизат MB-231, трансфицированных pcDNA3; 4 - лизат 293T, трансфицированных AGR2-pcDNA3, и 5 - 293T, трансфицированные pcDNA3. B. Моноклональное антитело может давать перекрестную реакцию с мышиным AGR2.

На фиг.3 представлено детектирование специфичности AGR2 посредством иммунопреципитации.

На фиг.4 представлено детектирование специфичности AGR2 посредством иммунофлуоресценции.

На фиг.5A и 5B представлено выравнивание аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи (V_L) (фиг.5A) и вариабельной области тяжелой цепи (V_H) (фиг.5B) (SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно) мышиного моноклонального антитела 18A4; домен V_L и V_H гуманизированной версии 18A4Hul (SEQ ID NO: 3 и 4, соответственно) и консенсусная каркасная область человека V_L и V_H (hum κIII, легкая цепь κ подтипа III; humI, тяжелая цепь подтипа I) (SEQ ID NO: 5 и 6, соответственно). Звездочкой отмечена разница между гуманизированным 18A4Hul и мышиным моноклональным антителом 18A4 или между гуманизированным 18A4Hul и консенсусной каркасной областью человека. Для сравнения определяющие комплементарность области (CDR) подчеркнуты.

На фиг.6A и 6B представлено выравнивание аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи (V_L) (фиг.2A) и вариабельной области тяжелой цепи (V_H) (фиг.2B) мышиного моноклонального антитела 18A4 (SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно); домен V_L и V_H гуманизированной версии 18A4Hul (SEQ ID NO: 3 и 4, соответственно) и консенсусная каркасная область V_L и V_H зародышевой линии (hum κIII, легкая цепь κ подтипа III; humI, тяжелая цепь подтипа I) (SEQ ID NO: 5 и 6, соответственно), а также консенсусная последовательность одобренного лекарственного средства, полученного с применением зародышевых линий YL и VH в качестве матриц. "-" обозначает наличие той же аминокислоты, что и в 18A4, и "*" обозначает позицию, содержащую отличающуюся аминокислоту в одобренном лекарственном средстве, что указывает на то, что изменение в этой позиции в значительной степени влияет на аффинность и специфичность антитела.

Фиг.7 представляет собой схему строения плазмиды для экспрессии интактного антитела. На этой фигуре фрагмент 2 содержит компонент IRES, а фрагмент 1 содержит промотор, терминатор, поли(A)-хвост, ген устойчивости и т.д., которые представляют собой компоненты, традиционно содержащиеся в эукариотической экспрессирующей плазмиде.

На фиг.8 представлен электрофорез SDS-PAGE очищенного антитела, где M обозначает маркер размера белков. Полоски 1, 2, 5 и 6 представляют собой образцы, полученные от мыши, а полоски 3, 4, 7 и 8 представляют собой образцы, полученные от человека. Слева показан неденатурирующий гель, а справа показан денатурирующий гель. Гель окрашен Кумасси синим.

На фиг.9 представлены результаты изучения аффинности антитела, полученные посредством конкурентного метода ELISA.

На фиг.10 представлено выравнивание измененных позиций в гуманизированном варианте антитела и изменение числа потенциальных эпитопов T-клетки. Красным цветом обозначена измененная аминокислотная последовательность.

На фиг.11 представлена кривая связывания антигена с гуманизированным вариантом антитела.

На фиг.12 представлена идентификация видоспецифичности гуманизированного антитела Agtuzumab посредством вестерн-блоттинга. Слева показаны результаты окрашивания SDS-PAGE, а справа показаны результаты вестерн-блоттинга с применением HRP-конъюгированного антитела к белку человека в качестве вторичного антитела. Полоски 1, 2 и 3 представляют собой мышиное антитело 18A4, контрольное антитело человека IgG и гуманизированное антитело Agtuzumab, соответственно.

На фиг.13 представлено детектирование специфичности связывания антигена с гуманизированным антителом Agtuzumab посредством вестерн-блоттинга. Слева показаны результаты окрашивания SDS-PAGE, а справа показано применение следующих первичных антител, слева направо, супернатанта трансфекции пустой плазмидой, супернатанта экспрессии Agtuzumab, супернатанта антитела к GST, применяемого в качестве отрицательного контроля, супернатанта мышиного антитела 18A4, супернатанта антитела к MBP, супернатанта антитела к MBP, супернатанта трансфекции контрольной пустой плазмидой, супернатанта экспрессии Agtuzumab и супернатанта антитела к GST, применяемого в качестве отрицательного контроля, соответственно.

На фиг.14 представлено детектирование специфичности связывания гуманизированного антитела Agtuzumab с антигенами в клеточном лизате посредством вестерн-блоттинга. Слева показаны результаты окрашивания SDS-PAGE, а образцы в полосках 1, 2, 3 и 4 справа представляют собой 293 T-клетки, трансфицированные плазмидой AGR2, 293 T-клетки, не трансфицированные плазмидой AGR2, клеточный лизат MCF-7 (с природной экспрессией AGR2) и очищенные AGR2-MBP, соответственно, где первичное антитело представляет собой гуманизированное антитело Agtuzumab. Полоска в 26 КДа представляет собой β-актин для отображения относительного количества белков в лизате.

На фиг.15 представлено детектирование способности гуманизированного антитела Agtuzumab к связыванию с природным AGR в клетках MCF7 посредством иммунопреципитации (IP). Полоски 1, 2 и 3 представляет собой клеточный лизат MCF7, белки, иммунопреципитированные белком G, конъюгированным с IgG человека, и белки, иммунопреципитированные белком G, конъюгированным с гуманизированным антителом Agtuzumab. Первичное антитело представляет собой кроличье моноклональное антитело к AGR2, а вторичное антитело представляет собой HRP-конъюгированное кроличье поликлональное антитело.

На фиг.16 представлены мутанты AGR2-MBP, полученные с применением мутаций согласно результатам анализа потенциальных эпитопов AGR2. Красные GGG обозначают, что данная позиция мутировала с получением трех глицинов.

На фиг.17 представлено связывание мышиного 18A4 и гуманизированного антитела Agtuzumab с мутантами AGR2-MBP. Полоски 1 до 12 представляют собой мутанты AGR2-MBP, AGR2-MBP 1~10 и MBP, соответственно.

На фиг.18 представлено детектирование способности антител к ингибированию инвазивного метастазирования клеток рака печени HepG2 in vitro посредством способа с применением камеры системы трансвелл.

На фиг.19 представлено детектирование способности антител к ингибированию роста и миграции клеток рака молочной железы T47D и MCF 7 in vitro посредством MTT.

На фиг.20 представлено детектирование способности антител к ингибированию миграции клеток рака молочной железы T47D in vitro посредством анализа заживления ран.

На фиг.21 представлено детектирование способности антитела к ингибированию инвазивного метастазирования клеток рака печени HepG2 in vitro посредством способа с применением камеры системы трансвелл.

На фиг.22 представлено детектирование способности антител к ингибированию клеточного цикла клеток рака молочной железы MCF-7 и T47D in vitro посредством цитометрии. Фиг.22A: после обработки антителом по изобретению в течение 48 часов наблюдается ингибирование клеточного цикла клеток рака молочной железы T47D. G1/G0 фаза в клетках T47D увеличивается на 8,56% по сравнению с контролем, в то время как S фаза и G2/M понижается на 8,56%, соответственно. Фиг.22B: после обработки антителом по изобретению в течение 48 часов наблюдается ингибирование клеточного цикла клеток рака молочной железы MCF-7. G1/G0 фаза клеток MCF-7 увеличивается на 5,37% по сравнению с контролем, в то время как S фаза и G2/M понижается на 5,37%, соответственно.

На фиг.23, 24 и 25 представлено подтверждение связывания антител с доменом активного центра AGR2 посредством вестерн-блоттинга.

Фиг.26A, B: Рост опухоли животного. C, D: Сравнение размера опухоли между экспериментальной и контрольной группами. E: Сравнение носителей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

I. Определение

Термины "AGR2" и "белок переднего градиента человека 2" можно использовать взаимозаменяемо в настоящем документе, обозначая молекулярное семейство, содержащее полноразмерную природную аминокислотную последовательность любого AGR2 человека, как указано выше, и суперсемейство PDI, к которому относится AGR2, включая потенциальные формы и предшественники, а также ассоциированные и неассоциированные комплексы зрелого AGR2 ("потенциальный AGR2"). AGR2, имеющие отношение к изобретению, следует понимать как любые белки типа AGR2, идентифицированные ранее или подлежащие идентификации в будущем, включая полипептиды, полученные из любой последовательности AGR2 и, по меньшей мере, приблизительно на 75%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 90%, и даже более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 95% гомологичные этой последовательности. Термин "AGR2" относится к гену, кодирующему AGR2 человека. Предпочтительно AGR представляет собой природную последовательность AGR2 человека.

Термин "антитело" в настоящем документе применяют в самом широком смысле, в частности, он охватывает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела, полученные из, по меньшей мере, двух интактных антител (такие как антитела с двойной специфичностью), и фрагменты антител, при условии, что они демонстрируют желаемые виды биологической активности.

Антитело, которое "связывается с" нужным антигеном, таким как антиген AGR2, относится к антителу, способному связываться с антигеном с достаточной аффинностью, что позволяет использовать антитело в качестве терапевтического средства для воздействия на клетки, экспрессирующие указанный антиген. Если антитело представляет собой антитело, связывающееся с AGR2, то оно, как правило, предпочтительно связывается с AGR2, а не с другими членами семейства AGR2, и представляет собой антитело, которое не демонстрирует значительной перекрестной реакции с другими белками этого семейства, например, BMP, белком-активатором и т.д. Антитело, обладающее "биологическими свойствами" данного антитела, такое как моноклональное антитело, обозначенное как 18A4, относится к антителу, обладающему одним или несколькими биологическими свойствами указанного антитела и отличающемуся от других антител тем, что оно связывается с тем же антигеном (таким как AGR2). Например, антитело, обладающее биологическими свойствами 18A4, может блокировать активацию AGR2 и/или связывается с тем же эпитопом внеклеточного домена AGR2, что и 18A4.

Термин "моноклональное антитело", применяемый в настоящем документе, относится к антителам, полученным из по существу гомогенной популяции антител, т.е. такой, в которой составляющие ее антитела являются одинаковыми, за исключением возможных природных мутантов, которые, как правило, представлены в очень небольшом количестве. Моноклональное антитело является высокоспецифичным, т.е. связывается с одним эпитопом на антигене. Кроме того, в отличие от составов поликлональных антител, содержащих различные антитела к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело связывается с одним детерминантом антигена.

В дополнение к специфичности, преимущество моноклональных антител заключается в том, что их можно получать, избегая контаминации другими антителами. Определение "моноклональный" указывает на свойство антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не подразумевает, что для получения такого антитела необходим какой-либо специальный способ.

Если не указано иначе, "моноклональное антитело 18A4" относится к антителу, содержащему связывающиеся с антигеном остатки мышиного антитела 18A4 по следующим примерам, или антителу, полученному от мышиного антитела 18A4 по следующим примерам. Например, моноклональное антитело 18A4 может представлять собой мышиное моноклональное антитело 18A4 или его вариант, такой как гуманизированное антитело 18A4, содержащее связывающиеся с антигеном аминокислотные остатки мышиного моноклонального антитела 18A4. Примеры гуманизированного антитела 18A4 приведены в примере 2.

"Эпитоп 18A4" представляет собой регион внеклеточного домена AGR2, с которым связывается моноклональное антитело 18A4. Для поиска антител, связывающихся с эпитопом 18A4, можно применять традиционный эпитоп-перекрестный конкурентный анализ, описанный в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988).

Моноклональное антитело в настоящем документе включает "химерное" антитело, в котором участок тяжелой цепи и/или легкой цепи идентичен или гомологичен соответствующей последовательности, полученной из другого специфичного вида или принадлежащей к специфичному типу или подтипу антитела, а остальная часть цепи идентична или гомологична соответствующей последовательности, полученной из другого специфичного вида или принадлежащей к специфичному типу или подтипу антитела, а также фрагменты таких антител, при условии, что они демонстрируют желаемую биологическую активность.

"Интактное" антитело представляет собой антитело, содержащее связывающуюся с антигеном вариабельную область, а также константную область легкой цепи (C_L) и константные области тяжелой цепи C_H1, C_H2 и C_H3. Константная область может представлять собой константную область с природной последовательностью (такую как константная область с природной последовательностью человека) или варианты этой аминокислотной последовательности. Предпочтительно, интактное антитело имеет одну или несколько эффекторных функций.

"Фрагмент антитела" содержит участок интактного антитела, предпочтительно содержит его связывающую антиген область или вариабельную область. Примеры фрагмента антитела включают фрагменты Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, линейное антитело и одноцепочечное антитело.

Фрагмент "Fv" представляет собой фрагмент антитела, содержащий интактные участки распознавания антигена и связывания. Этот регион состоит из тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, тесно связанных друг с другом, где связь может быть ковалентной (такой как в scFV). При такой конформации три CDR в каждой вариабельной области взаимодействуют друг с другом, формируя антигенсвязывающий участок на поверхности димера V_II-V_I.

Фрагмент "Fab" содержит вариабельную область и константную область легкой цепи и вариабельную область и первую константную область (CH1) тяжелой цепи. Фрагмент F(ab’)₂ антитела содержит пару фрагментов Fab, которые, как правило, ковалентно связаны вблизи карбоксильных концов через цистеины, расположенные между ними.

"Одноцепочечный Fv" или "scFv" фрагмент антитела содержит домены VH и VL антитела, которые представлены одной полипептидной цепью. Как правило, полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет scFv формировать структуру, идеально подходящую для связывания антигена.

Термин "линейное антитело" обозначает парные тандемные сегменты Fd (V_H-C_H1-V_H-C_H1), которые формируют парные антигенсвязывающие области вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи. Линейное антитело может обладать двойной специфичностью или одиночной специфичностью.

Термин "вариабельная область антитела", применяемый в настоящем документе, относится к участкам легкой цепи и тяжелой цепи молекулы антитела, которые содержат аминокислотные последовательности определяющей комплементарность области (CDR, т.е., CDR1, CDR2 и CDR3) и каркасные области (FR). V_H относится к вариабельной области тяжелой цепи. V_L относится к вариабельной области легкой цепи. Согласно способу, применяемому в изобретении, соответствующие аминокислотные позиции CDR и FR можно определять по Kabat et al. (номенклатура описана в Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).

Термин "определяющая комплементарность область" (CDR: т.е. CDR1, CDR2 и CDR3), применяемый в настоящем документе, относится к аминокислотным остаткам в вариабельных областях антитела, наличие которых необходимо для связывания антигена. Каждая вариабельная область, как правило, содержит три CDR, которые обозначают как CDR1, CDR2 и CDR3. Каждая определяющая комплементарность область может содержать аминокислотные остатки "определяющей комплементарность области", определенные по Кабату (т.е. приблизительно остатки (Ll), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельной области легкой цепи и 31-35(Hl), 50-65(H2) и 95-102(H3) в вариабельной области тяжелой цепи.

"Каркасная область" (далее в настоящем документе FR) представляет собой те остатки в вариабельной области, которые не относятся к остаткам CDR. Каждая вариабельная область, как правило, содержит 4 FR, которые обозначают как FR1, FR2, FR3 и FR4. Если CDR определяют по Кабату, то остатки FR легкой цепи находятся приблизительно в области остатков 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88(LCFR3) и 98-107(LCFR4), а остатки FR тяжелой цепи приблизительно в области остатков 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) и 103-113 (HCFR4) тяжелой цепи. Если CDR содержит аминокислотные остатки из гипервариабельной петли, остатки FR легкой цепи находятся приблизительно в области остатков 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) и 97-107 (LCFR4) легкой цепи, а остатки FR тяжелой цепи находятся приблизительно в области остатков 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) и 102-113 (HCFR4) тяжелой цепи. В некоторых случаях, когда CDR содержит аминокислоты CDR, определенные по Кабату как гипервариабельная петля, остатки FR определяют соответствующим образом. Например, если CDRH1 содержит аминокислоты H26-H35, остатки FR1 тяжелой цепи находятся в позициях 1-25, а остатки FR2 находятся в позициях 36-49.

Термин "эпитоп T-клетки", применяемый в настоящем документе, относится к потенциальному пептидному удлинению моноклонального антитела, которое может связываться и представляться молекулой MHC и распознаваться рецептором антигенов T-клетки, когда само моноклональное антитело выступает в качестве антигена. Эти пептидные удлинения, входящие в состав моноклонального терапевтического антитела, могут усиливать иммунный ответ пациента на терапевтическое антитело. Чем сильнее степень удлинения пептидов, тем выше вероятность того развития иммунного ответа.

"Гуманизированная" форма антитела животного, отличного от человека (такого как грызун), относится к химерному антителу, которое, по меньшей мере, содержит последовательность, полученную от иммуноглобулина животного, отличного от человека. В более широком смысле гуманизированное антитело относится к иммуноглобулину, в котором остатки гипервариабельной области в иммуноглобулине человека (реципиентное антитело) заменены остатками гипервариабельной области иммуноглобулина животного, отличного от человека, такого как мышь, крыса, кролик или не являющийся человеком примат, и имеет желаемую специфичность, аффинность и свойства (донорное антитело). В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменены на соответствующие остатки, принадлежащие животному, отличному от человека. Кроме того, гуманизированное антитело может содержать остаток, отсутствующий в реципиентном антителе или донорном антителе. Эти модификации проводят для дальнейшего улучшения свойств антитела, где, как правило, гуманизированное антитело содержит из по существу не менее чем, по меньшей мере, одной, как правило, двух вариабельных областей, в которых все или по существу все гипервариабельные петли относятся к гипервариабельным петлям иммуноглобулина животного, отличного от человека, и все или по существу все FR представляют собой FR последовательности иммуноглобулина человека. Необязательно, гуманизированное антитело дополнительно содержит, по меньшей мере, участок константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, константную область иммуноглобулина человека.

"Антиангиогенное средство" или "ингибитор ангиогенеза" относится к низкомолекулярному соединению, полинуклеотиду, полипептиду, изолированному белку, рекомбинантному белку, антителу или их конъюгату или слитому белку, который прямо или косвенно ингибирует ангиогенез, образование сосудов или нежелательную проницаемость сосудов. Следует понимать, что антиангиогенные средства включают средства, которые связываются и блокируют ангиогенную активность ангиогенного фактора или его рецептора. В таблице 2 в Oncogene, 22:6549-6556 (2003) приведены известные антиангиогенные факторы. В таблице 1 в Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) првиедены антиангиогенные факторы, проходившие клинические испытания.

Термин "аномальный ангиогенез" относится к избыточному, неправильному или бесконтрольному ангиогенезу, вызывающему заболевание или его ухудшение, где заболевание представляет собой, например, злокачественную опухоль, особенно солидную опухоль или метастазирующую опухоль, ассоциированную с ангиогенезом.

Термин "цитотоксическое средство", применяемое в настоящем документе, относится к средству, которое ингибирует или блокирует клеточные функции и/или вызывает разрушение клетки. Этот термин включает радиоактивные изотопы, химиотерапевтические средства и токсины.

"Химиотерапевтическое средство" представляет собой химическое соединение, применяемое для лечения злокачественной опухоли, и также называется противоопухолевым лекарственным средством. Противоопухолевые лекарственные средство, как правило, на основе различий в химической структуре и происхождения лекарственного средства классифицируют на алкилирующие средства, антиметаболические лекарственные средства, противоопухолевые антибиотики, антрациклиновые антибиотики, противоопухолевые растительные лекарственные средства и гормоны. В зависимости от специфичности к фазе или циклу химиотерапевтические средства против опухолей можно классифицировать на (1) не специфичные к клеточному циклу средства (CCNSA), такие как алкилирующие средства, противоопухолвые антибиотики, координационный комплекс платины и т.д., и (2) специфичные к клеточному циклу средства (CCSA), такие как антиметаболические лекарственные средства, алкалоиды барвинка и т.д.

II. Получение гуманизированного антитела к AGR2

Способ гуманизации антитела, полученного от животного, отличного от человека, известен в данной области. Предпочтительно гуманизированное антитело содержит один или несколько аминокислотных остатков, полученных от животного, отличного от человека. Эти не принадлежащие человеку аминокислотные остатки часто называют "входящими" остатками, которые, как правило, получают из "входящей" вариабельной области. Гуманизацию можно проводить способом, предложенным Winter с коллегами (Jones et al, Nature. 321: 522-525(1986); Riechmann et al., Nature. 332: 323-327(1988); и Verhoeyen et al, Science. 239: 1534-1536 (1988)), посредством замены последовательности гипервариабельной области антитела человека на соответствующие последовательности. Таким образом, такое "гуманизированное антитело" представляет собой химерное антитело (патент США № 4816567), в котором участок, по существу более короткий, чем полная вариабельная область человека, заменяют на соответствующие последовательности, полученные от видов, отличных от человека. На практике гуманизированное антитело, как правило, представляет собой антитело человека, в котором некоторые гипервариабельные остатки и иногда некоторые остатки FR заменены на остатки антитела грызуна, находящиеся в тех же позициях.

Выбор вариабельной области человека для получения гуманизированного антитела, включая легкую цепь и тяжелую цепь, очень важен для снижения антигенности. На основе так называемого способа "наилучшего приближения" было проведено сравнение целой библиотеки известных последовательностей вариабельных областей человека и последовательностей антитела грызуна. Затем последовательность человека, наиболее похожую на соответствующую ей последовательность грызуна, выбирали в качестве каркасной области (FR) гуманизированного антитела человека (Sims et al, J. Immunol., 151: 2296(1993); Chothia et al, J. Mol. Biol. 196: 901(1987)). В другом способе применяют специфичную каркасную область, полученную из консенсусной последовательности всех антител человека в пределах субпопуляций легкой цепи или тяжелой цепи. Тот же каркас можно использовать для нескольких других различных гуманизированных антител (Carter et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 4285 (1992); Presta et al, J. Immunol. 151: 2623(1993)).

При получении гуманизированного антитела важно, чтобы антитело было способно сохранять высокую аффинность к антигену и другие необходимые биологические свойства после гуманизации. Примеры, приведенные ниже, описывают получение иллюстративного гуманизированного антитела к AGR2, которое связывается с AGR2.

Гуманизированное антитело в настоящем документе содержит остатки гипервариабельной области животного, отличного от человека, остатки, встроенные в вариабельную область тяжелой цепи человека, а каркасная область (FR) содержит замены в позициях, выбранных из 57, 58, 60, 65, 67, 68 и/или 70, где обозначения вариабельной области описана согласно номенклатуре Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). В одном из вариантов осуществления гуманизированное антитело содержит замены FR в двух или более позициях, выбранных из позиций 57, 58, 60, 65, 67, 68 и 70, в то время как в дополнительном варианте осуществления гуманизированное антитело содержит замены FR в трех или четырех позициях, выбранных из позиций 57, 58, 60, 65, 67, 68 и 70. В предпочтительном варианте осуществления гуманизированное антитело содержит замены FR в позициях 65, 67, 68 и 70 или в позициях 67, 68 и 70 или в позициях 68 и 70. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления гуманизированное антитело содержит замены FR в позициях 57, 58 и 60 или в позициях 57 и 60. Предпочтительно, чтобы гуманизированное антитело по изобретению имело скорее мало, чем много замен в каркасном регионе, чтобы минимизировать антигенность, однако эффективность также является очень важным фактором. Аминокислоты, подлежащие замене, предпочтительно представляют собой консервативные аминокислоты, замена которых не изменяет иммуногенность или эффективность. Аспарагин (N) в позиции 57 предпочтительно заменяют на серин (S), лейцин (L) в позиции 58 предпочтительно заменяют на аргинин (R), серин (S) в позиции 60 предпочтительно заменяют на треонин (T), лизин (K) в позиции 65 предпочтительно заменяют на глутамин (Q), лизин (K) в позиции 67 предпочтительно заменяют на аргинин (R), аланин (A) в позиции 68 предпочтительно заменяют на валин (V), а лейцин (L) в позиции 70 предпочтительно заменяют на метионин (M).

Иллюстративные гуманизированные антитела, описанные в изоберетении, содержат определяющие комплементарность остатки DYNMD (SEQ ID NO: 8); DINPNYDTTS YNQKFKG или DINPNYDTTS YNQKFQG (SEQ ID NO: 9); и/или SMMGYGSPMD Y (SEQ ID NO: 10) вариабельной области тяжелой цепи, необязательно содержат аминокислотные модификации этих остатков CDR, например, где эти модификации по существу сохраняют или улучшают аффинность этих антител. Например, указанные варианты антитела могут содержать замены приблизительно от 1 до 5 аминокислот, приблизительно от 1 до 4 аминокислот, приблизительно от 1 до 3 аминокислот и приблизительно от 1 до 2 аминокислоты в указанной вариабельной области последовательности CDR. Такие варианты антител можно получать, например, посредством созревания аффинности. Предпочтительно, вариабельная области тяжелой цепи гуманизированного ант