Штаммы agrobacterium, модифицированные для увеличения частоты трансформации растений

Штаммы agrobacterium, модифицированные для увеличения частоты трансформации растений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США № 61/368965, поданной 29 июля 2010 г. Раскрытие предшествующей заявки рассматривается как часть раскрытия данной заявки.

Известный уровень техники

Трансформация растений обычно охватывает методы, требуемые и используемые для введения в растительные клетки способного экспрессироваться в растениях чужеродного гена, так что могут быть получены способные к оплодотворению потомки растений, которые стабильно поддерживают и экспрессируют чужеродный ген. Были трансформированы многочисленные представители, классифицированные как однодольные и двудольные растения. Трансгенные сельскохозяйственные культуры, а также фрукты и овощи представляют коммерческий интерес. Такие культуры включают, но не ограничиваются этим, маис, рис, сою, канолу, подсолнечник, люцерну, сорго, пшеницу, хлопок, арахис, томаты, картофель и тому подобное. Несмотря на развитие систем трансформации растений для введения в растительные клетки способного экспрессироваться в растениях чужеродного гена, желательны дополнительные усовершенствования, которые позволят повысить эффективность трансформации и обеспечат существенные преимущества для преодоления рабочих недостатков при трансформации растений чужеродными генами.

Известно несколько способов введения чужеродного генетического материала в растительные клетки и получения растений, которые стабильно поддерживают и экспрессируют введенный ген. Такие способы включают доставку генетического материала, нанесенного на микрочастицы, с ускорением прямо в клетки (например, в патенте США № 4945050 и патенте США № 5141131). Другой способ трансформации включает технологию с применением карбида кремния или технологию WHISKERS™. См., например, патент США № 5302523 и патент США № 5464765. Метод электропорации также использовался для трансформации растений. См., например, патент WO 87/06614, патент США № 5472869, патент США № 5384253, патенты WO 92/09696 и патент WO 93/21335. Кроме того, может быть использовано слияние протопластов растений с липосомами, содержащими ДНК, предназначенную для доставки, прямое введение ДНК, а также другие возможные способы.

После интеграции ДНК в растительный геном, она обычно становится относительно стабильной на протяжении последующих поколений. Трансформированные клетки растут внутри растений обычным образом. Они могут образовывать половые клетки и передавать характерную(-ые) особенность(-и) трансформации потомкам растений. Такие растения могут быть выращены нормальным образом и могут скрещиваться с растениями, которые имеют те же самые трансформированные наследуемые факторы или другие наследуемые факторы. Полученные в результате гибридные индивидуумы имеют соответствующие фенотипические свойства, например, способность контролировать питание насекомых-вредителей растений.

Для введения ДНК в растительные клетки-хозяева может быть также использован ряд альтернативных методов. Эти методы включают, но не ограничиваются этим, трансформацию с помощью Т-ДНК, доставляемой Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes в качестве агентов трансформации. Растения могут быть трансформированы с использованием метода с применением Agrobacterium, как описано, например, в патенте США № 5177010, патенте США № 5104310, европейской патентной заявке № 0131624 B1, европейской патентной заявке № 120516, европейской патентной заявке № 159418 B1, европейской патентной заявке № 176112, патенте США № 5149645, патенте США № 5469976, патенте США № 5464763, патенте США № 4940838, патенте США № 4693976, европейской патентной заявке № 116718, европейской патентной заявке № 290799, европейской патентной заявке № 320500, европейской патентной заявке № 604662, европейской патентной заявке № 627752, европейской патентной заявке № 0267159, европейской патентной заявке № 0292435, патенте США № 5231019, патенте США № 5463174, патенте США № 4762785, патенте США № 5004863 и патенте США № 5159135. Использование содержащих Т-ДНК векторов для трансформации растительных клеток интенсивно исследовалось и адекватно описано в европейской патентной заявке 120516; An et al., (1985, EMBO J. 4:277-284), Fraley et al., (1986, Crit. Rev. Plant Sci. 4:1-46) и Lee and Gelvin (2008, Plant Physiol. 146: 325-332), и хорошо обосновано в данной области техники.

Известна биология переноса Т-ДНК из Agrobacterium в растительные клетки. См., например, Gelvin (2003) Microbiol. Molec. Biol. Rev. 67:16-37; и Gelvin (2009) Plant Physiol. 150:1665-1676. Как минимум, по меньшей мере, правый пограничный повтор Т-ДНК, но часто как правый пограничный повтор, так и левый пограничный повтор плазмиды Ti или Ri должны быть соединены в виде фланкирующей области генов, которые желательно ввести в растительную клетку. Левый и правый пограничные повторы Т-ДНК являются ключевыми цис-действующими последовательностями, требуемыми для переноса Т-ДНК. В полном геноме Agrobacterium закодированы различные транс-действующие компоненты. Главными среди них являются белки, кодируемые генами vir, которые обычно выявляются в виде серий оперонов в плазмидах Ti или Ri. Различные плазмиды Ti и Ri в некоторой степени отличаются по набору генов vir, например, virF присутствует не всегда. Белки, кодируемые генами vir, выполняют много различных функций, включая, в виде упоминания некоторых характеристик, узнавание и сигнализацию при взаимодействии растительная клетка/бактерии, индукцию транскрипции гена vir, образование секреторного канала типа IV, узнавание пограничных повторов Т-ДНК, образование T-цепей, перенос T-цепей в растительную клетку, импорт T-цепей в ядро растительной клетки и интеграцию T-цепей в хромосоме клеточного ядра растения. См., например, Tzfira and Citovsky (2006) Curr. Opin. Biotechnol. 17:147-154.

Если для трансформации используют штаммы Agrobacterium, ДНК, предназначенную для введения в растительную клетку, можно клонировать в специальных плазмидах, например, либо в промежуточном (челночном) векторе, либо в бинарном векторе. Промежуточные векторы не способны к независимой репликации в клетках Agrobacterium, но манипуляции с ними и их репликацию можно проводить в распространенных штаммах Escherichia coli для молекулярного клонирования. Такие промежуточные векторы включают последовательности, обычно ограниченные рамками областей пограничных правых и левых повторов Т-ДНК, они могут включать маркерный ген селекции для отбора трансформированных растительных клеток, клонирующий линкер, клонирующий полилинкер или другую последовательность, которая может функционировать в качестве сайта для введения генов, предназначенных для трансформации растительной клетки. Клонирование и управление генами, которые желательно перенести в растения, таким образом, может быть легко осуществлено с помощью стандартных методов в E. coli с использованием в качестве клонирующего вектора челночного вектора. После окончания манипуляций челночный вектор может быть впоследствии введен в штаммы Agrobacterium, предназначенные для трансформации растений, для последующей работы. Промежуточный челночный вектор может быть перенесен в Agrobacterium с помощью вспомогательной плазмиды (путем конъюгации бактерий), путем электропорации, с помощью опосредованной химически прямой трансформации ДНК или с помощью других известных методов. Челночные векторы могут быть интегрированы в плазмиду Ti или Ri или в их производные с помощью гомологичной рекомбинации, благодаря последовательностям, которые гомологичны у плазмиды Ti или Ri или их производных и у промежуточной плазмиды. Это событие гомологичной рекомбинации (т.е. интеграции плазмиды) тем самым является средством стабильного поддержания измененного челночного вектора в Agrobacterium с точкой начала репликации и другими функциями поддержания плазмиды, обеспечиваемыми частью плазмиды Ti или Ri в коинтегративной плазмиде. Плазмида Ti или Ri также включает области vir, включающие гены vir, необходимые для переноса Т-ДНК. Плазмида, несущая область vir, обычно представляет собой мутировавшую Ti или Ri плазмиду (вспомогательную плазмиду), из которой удалена область Т-ДНК, включая правые и левые пограничные повторы Т-ДНК. Такие плазмиды, происходящие от pTi, имеющие функционирующие гены vir и лишенные всего или по существу всего из T-области и сопровождающих элементов, при описании в настоящем документе обозначаются как вспомогательные плазмиды.

Супербинарная система является специализированным примером челночного вектора/системы гомологичной рекомбинации (рассмотрено в обзорах Komari et al., (2006) в: Methods in Molecular Biology (K. Wang, ed.) No.343: Agrobacterium Protocols (2^nd Edition, Vol. 1) HUMANA PRESS Inc., Totowa, NJ, pp.15-41; и Komori et al., (2007) Plant Physiol. 145:1155-1160). Штамм хозяина Agrobacterium tumefaciens, применяемый с супербинарной системой, представляет собой LBA4404(pSB1). Штамм LBA4404(pSB1) несет две независимо реплицирующиеся плазмиды pAL4404 и pSB1. pAL4404 представляет собой вспомогательную плазмиду, происходящую от Ti плазмиды, содержащую интактный набор генов vir (от Ti плазмиды pTiACH5), но которая не имеет области Т-ДНК (и, следовательно, не имеет последовательностей левых и правых пограничных повторов). Плазмида pSB1 снабжает дополнительным частичным набором генов vir, происходящих из pTiBo542; этот частичный набор генов vir включает оперон virB и оперон virC, а также гены virG и virD1. Одним примером челночного вектора, используемого в супербинарной системе, является pSB11, который содержит клонирующий полилинкер, служащий в качестве сайта введения генов, предназначенных для трансформации растительной клетки, к которому примыкают области правых и левых пограничных повторов Т-ДНК. Челночный вектор pSB11 не способен к независимой репликации в Agrobacterium, но стабильно поддерживается в виде коинтегративной плазмиды при интеграции в pSB1 с помощью гомологичной рекомбинации между общими последовательностями, присутствующими в pSB1 и pSB11. Таким образом, полностью модифицированная область Т-ДНК, введенная в LBA4404(pSB1) в модифицированном векторе pSB11, продуктивно действует в нем и переносится в растительные клетки с помощью белков Vir, происходящих от двух различных источников плазмид Ti Agrobacterium (pTiACH5 и pTiBo542). Супербинарная система, как доказано, является особенно пригодной для трансформации видов однодольных растений. См. Hiei et al., (1994) Plant J. (6:271-282 и Ishida et al., (1996) Nat. Biotechnol. 14:745-750.

Кроме генов vir, которые несут плазмиды Ti Agrobacterium, другие, происходящие из хромосом гены, контролирующие вирулентность (обозначаемые как гены chv), известны как контролирующие определенные аспекты взаимодействий клеток Agrobacterium и растительных клеток и таким образом влияющие на суммарную частоту трансформации растений (Pan et al., (1995) Molec. Microbiol. 17:259-269). Некоторые из происходящих из хромосом генов, необходимых для вирулентности и присоединения, сгруппированы вместе в хромосомном локусе на отрезке в 29 тысяч оснований (Matthysse et al., (2000) Biochim. Biophys. Acta 1490:208-212).

Независимо от конкретной применяемой плазмидной системы, клетки Agrobacterium, трансформированные таким образом, используются для трансформации растительных клеток. Растительные экспланты (например, части листа, сегменты стебля, корней, а также протопласты или культивируемые в суспензии клетки) могут быть успешно прокультивированы с Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes для переноса ДНК в растительную клетку. Затем может быть осуществлена регенерация целых растений из инфицированного растительного материала с последующим помещением в подходящие условия роста и культуральную среду, которая может содержать антибиотики или гербициды для селекции трансформированных растительных клеток. Полученные таким образом растения можно затем тестировать на присутствие вставленной ДНК.

Эти методы введения чужеродного генетического материала в растения могут быть использованы для введения благоприятных признаков в растения. Например, миллиарды долларов расходуются каждый год для контролирования насекомых-вредителей и еще миллиарды теряются из-за причиненного ими ущерба. Синтетические инсектициды на основе органической химии являются главными средствами, используемыми для контролирования насекомых-вредителей, но в некоторых областях важную роль играют биологические инсектициды, такие как инсектицидные белки, происходящие от Bacillus thuringiensis (Bt). Способность создавать устойчивые к насекомым растения путем введения генов инсектицидных белков Bt играет революционную роль в современном сельском хозяйстве и повышает ценность инсектицидных белков и их генов.

Для создания устойчивых к насекомым трансгенных растений использовано несколько белков Bt, которые успешно разработаны и во многих случаях зарегистрированы и внедрены в промышленность. Они включают Cry1Ab, Cry1Ca, Cry1Fa и Cry3Bb в кукурузе, Cry1Ac и Cry2Ab в хлопке и Cry3A в картофеле.

Коммерческие продукты, экспрессирующие белки Bt, экспрессируют один белок за исключением случаев, когда желателен объединенный спектр из 2 белков (например, объединение Cry1Ab и Cry3Bb в кукурузе для придания устойчивости к чешуекрылым бабочкам вредителям и длинноусым блошкам, соответственно) или когда независимое действие белков делает их полезными в качестве средства для задержки развития устойчивости у восприимчивых популяций насекомых (например, объединение Cry1Ac и Cry2Ab в хлопке для обеспечения управления устойчивостью к гусенице листовертки-почкоеда табака).

Это значит, что некоторые из качеств трансгенных растений, устойчивых к насекомым, которые привели к быстрому и широкому использованию этой технологии, в результате также приводят к тому, что популяции вредителей будут вырабатывать устойчивость к инсектицидным белкам, продуцируемым этими растениями. Предложено несколько стратегий для сохранения пригодности признаков устойчивости к насекомым, созданных на основе Bt, которые включают развертывание белков при высокой дозе в сочетании с укрытием и чередование с различными токсинами или их совместное развертывание (McGaughey et al. 1998, Nature Biotechnol. 16:144-146).

Если проводят селекцию белков Bt для использования в сочетании, необходимо, чтобы они проявляли свой инсектицидный эффект независимо так, чтобы устойчивость, развившаяся к одному белку, не придавала устойчивости ко второму белку (т.е. чтобы не наблюдалось перекрестной устойчивости к белкам). Оценка надежности перекрестной устойчивости обычно осуществляется с использованием популяций видов вредителей, обычно чувствительных к инсектицидному белку, которые были отобраны по устойчивости к инсектицидным белкам. Если, например, популяция вредителей, отобранная по устойчивости к "белку A", чувствительна к "белку B", то можно заключить, что не существует перекрестной устойчивости, и что сочетание белка A и белка B должно быть эффективным в отношении сдерживания устойчивости к белку A в отдельности.

При отсутствии популяций устойчивых насекомых оценки могут быть сделаны на основе других характеристик, предположительно относящихся к механизму действия и потенциалу перекрестной устойчивости. Предположено использование связывания, опосредованного рецепторами, для идентификации инсектицидных белков, вероятно, не проявляющих перекрестной устойчивости (патент США № 6855873). Ключевым моментом предсказания отсутствия суммарной перекрестной устойчивости в этом подходе является то, что инсектицидные белки не конкурируют за рецепторы у чувствительных видов насекомых.

В том случае, когда два токсина Cry из Bt конкурируют за один и тот же рецептор, то затем, если этот рецептор мутирует у этого насекомого так, что один из токсинов не будет больше связываться с этим рецептором и таким образом не будет больше инсектицидным в отношении этого насекомого, это также должно быть аргументом в пользу того, что насекомое будет также устойчивым ко второму токсину (который конкурентно связывается с тем же рецептором). Однако если два токсина связываются с двумя различными рецепторами, это может служить указанием на то, что насекомое не должно быть устойчиво одновременно к этим двум токсинам.

Cry1Fa является пригодным для контроля многих видов чешуекрылых вредителей, включая европейского кукурузного мотылька (ECB; Ostrinia nubilalis (Hubner)) и травяную совку (FAW; Spodoptera frugiperda), и активен против огневки сахарного тростника (SCB; Diatraea saccharalis).

Белок Cry1Fa при продукции в зерновых растениях с индуцированным событием TC1507 является ответственным за лидирующий в отрасли признак устойчивости для контроля FAW. Cry1Fa дополнительно используют в продуктах HERCULEX®, SMARTSTAX™ и WIDESTRIKE™.

Возможность проведения исследований (конкурентного или гомологичного) связывания с рецептором с использованием белка Cry1Fa ограничена, так как наиболее общепринятый метод, доступный для мечения белков в методах определения связывания с рецептором, ведет к инактивации инсектицидной активности белка Cry1Fa.

Cry1Ab и Cry1Fa представляют собой инсектицидные белки, в настоящее время используемые (по отдельности) в трансгенной кукурузе для защиты растений от различных насекомых-вредителей. Главным вредителем кукурузы, против которого эти белки предоставляют защиту, является европейский кукурузный мотылек (ECB). Патентная заявка США № 2008/0311096 частично относится к использованию Cry1Ab для контролирования устойчивой к Cry1F популяции ECB.

В данной заявке описываются штаммы Agrobacterium tumefaciens, которые модифицированы для повышения частоты трансформации растений. При использовании этих штаммов предоставляются новые системы трансформации растений для введения в растительные клетки чужеродных генов, способных экспрессироваться в растениях. Кроме того, эти штаммы обеспечивают дополнительными усовершенствованиями, которые позволяют повысить эффективность трансформации и предоставляют существенные преимущества в преодолении рабочих недостатков при трансформации растений чужеродными генами.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем документе описываются штаммы Agrobacterium, которые несут гены, усиливающие трансформацию, в плазмиде, способной реплицироваться независимо от хромосомы Agrobacterium, плазмиде Ti, и бинарные векторы трансформации растений, а также способы их применения. Штаммы Agrobacterium являются дефектными в отношении функций рекомбинации ДНК; что ведет к нестабильности или реорганизации бинарных векторов трансформации растений, и они несут гены, усиливающие трансформацию, в плазмиде, способной реплицироваться независимо от хромосомы Agrobacterium, плазмиде Ti, и бинарные векторы трансформации растений. Описываются также дополнительные штаммы Agrobacterium, которые несут гены, усиливающие трансформацию, интегрированные в хромосому Agrobacterium, в локусе, который не препятствует или каким-либо другим образом не нарушает нормальный рост и способность клеток Agrobacterium к трансформации растений, и их применение.

В одном варианте осуществления описанных в настоящем документе способов растение трансформируется в результате контактирования клетки растения со штаммом Agrobacterium, имеющим, по меньшей мере, одну вспомогательную плазмиду pTi, включающую 14,8 KpnI фрагмент pSB1, и плазмиду pTi, имеющую, по меньшей мере, одну обезоруженную область Т-ДНК, причем область Т-ДНК включает, по меньшей мере, правую границу Т-ДНК и экзогенную ДНК, прилегающую к границе, где плазмиды имеют различные точки начала репликации относительно друг друга.

В дополнительном варианте осуществления описанных в настоящем документе способов растение трансформируется в результате контактирования клетки растения с бактерией рода Agrobacterium, имеющей 14,8 KpnI фрагмент VirBCDG и плазмиду pTi, имеющую, по меньшей мере, одну обезоруженную область Т-ДНК, где 14,8 KpnI фрагмент VirBCDG интегрирован в нейтральный сайт интеграции хромосомы бактерии.

В дополнительном варианте осуществления описанных в настоящем документе способов штамм Agrobacterium включает, по меньшей мере, одну вспомогательную плазмиду pTi, включающую 14,8 KpnI фрагмент pSB1, и плазмиду pTi, имеющую, по меньшей мере, одну обезоруженную область Т-ДНК, где плазмиды имеют различные точки начала репликации относительно друг друга.

В дополнительном варианте осуществления штамм Agrobacterium с усиливающими трансформацию свойствами включает 14,8 KpnI фрагмент VirBCDG, выделенный из pSB1, и плазмиду pTi, имеющую, по меньшей мере, одну обезоруженную область Т-ДНК.

В другом варианте осуществления геномный локус nilA Agrobacterium tumefaciens включает полинуклеотидную последовательность, которая интегрирована в геномный локус nilA.

В дополнительном варианте осуществления штамм LB4404 Agrobacterium включает 14,8 KpnI фрагмент VirBCDG pSB1 во вспомогательной плазмиде pTi и плазмиду pTi, имеющую, по меньшей мере, одну обезоруженную область Т-ДНК и имеющую экзогенную ДНК, прилегающую, по меньшей мере, к одной границе Т-ДНК Agrobacterium, где плазмиды имеют различные точки начала репликации относительно друг друга.

В дополнительном варианте осуществления штамм LB4404 Agrobacterium включает, по меньшей мере, один ген vir из 14,8 KpnI фрагмента VirBCDG, выделенного из pSB1, интегрированный в нейтральный сайт интеграции хромосомы Agrobacterium.

В дополнительных вариантах осуществления предлагаются растения, которые созданы в соответствии с описанными в настоящем документе способами трансформации.

В еще одном варианте осуществления фертильное трансгенное зерновое растение или его потомок экспрессирует инсектицидные количества белка Cry1Ca, инсектицидного белка Cry1F, инсектицидного белка Cry1Ab1 и толерантные к гербицидам количества белка AAD-1, где белки Cry1Ca, Cry1F, Cry1Ab1 и AAD1 совместно экспрессируются с одного локуса рекомбинантной ДНК, стабильно включенной в геном растения.

Описание фигур

Фиг.1. Показана схема клонирования для конструкции плазмиды pDAB9292.

Фиг.2. Показана карта плазмиды pDOW3719.

Фиг.3. Показана схема клонирования для конструкции плазмиды pDAB9698.

Фиг.4. Показаны карты бинарных векторных плазмид pDAB101513 и pDAB101514.

Фиг.5. Показана карта бинарной векторной плазмиды pDAB101556.

Подробное описание изобретения

Штаммы Agrobacterium отличаются от других по своей способности трансформировать растительные клетки. Онкогенные штаммы Agrobacterium дикого типа известны своей способностью индуцировать галлы (опухолевый избыточный рост) у многих растений-хозяев, особенно у видов двудольных. Эта трансформация нормально растущих растительных клеток в опухолевые клетки с отсутствием их саморегуляции возникает как результат переноса специальных последовательностей ДНК (Т-ДНК), которые кодируют гены, экспрессируемые в растениях, которые кодируют растительные гормоны, из индуцирующей опухоль (Ti) плазмиды в растительные клетки, где они стабильно интегрируются в хромосомы растения. Плазмида Ti из штамма Bo542 (т.е. pTiBo542) примечательна тем, что при размещении в хромосомных средах Agrobacterium она стимулирует индукцию особенно больших интенсивно растущих опухолей у некоторых растений (Hood et al., (1986) J. Bacteriol. 168:1291-1301). Гены, ответственные за этот фенотип "супервирулентности", находятся в pTiBo542 вне областей Т-ДНК. При дальнейшем исследовании было обнаружено, что плазмида, содержащая "15,8" тысяч пар оснований (т.п.о.) фрагмента KpnI, происходящего из pTiBo542, которая содержала полные опероны virG, virB и virC, стимулировала усиленное образование опухоли штаммом A281 по сравнению со штаммами, не имеющими плазмиду (Jin et al., (1987) J. Bacteriol. 169:4417-4425). Ген virG плазмиды pTiBo542, как считается, является ответственным за супервирулентный фенотип штамма Agrobacterium A281. virG из pTiBo542 вызывает повышение экспрессии virB в 1,7 раз по сравнению с virG из pTiA6 из-за различий между двумя генами в промоторных областях, кодирующих последовательностях и 3'-нетранслируемых областях (Chen et al., (1991) Molec. Gen. Genet. 230:302-309). Таким образом, ген virG из pTiBo542 может быть выгодно использован для стимуляции более высокой эффективности переноса Т-ДНК, и в результате этого, более высокой частоты трансформации растений, особенно, когда он присутствует в большом фрагменте KpnI плазмиды pTiBo542, которая несет также опероны virB и virC плазмиды pTiBo542.

Полная, аннотированная последовательность pTiBo542 была послана в GENBANK с номером поступления DQ058764 12 мая 2005 г. Анализ карты рестрикции фрагмента KpnI и аннотации генов показывают, что полный оперон virB (который включает гены virB1, virB2, virB3, virB4, virB5, virB6, virB7, virB8, virB9, virB10 и virB11), ген virG, оперон virC (который включает гены virC1 и virC2) и часть оперона virD, включающую ген virD1, возможно выделить из фрагмента KpnI, включающего 14815 пар оснований (п.о.). Предполагается, что размер "15,8 т.п.о." фрагмента KpnI, на который ссылаются в статье Jin et al. (выше), был определен по подвижности фрагмента в агарозном геле, и что реальный размер указанного фрагмента составляет в действительности 14,8 т.п.о. Специалист в области молекулярной биологии должен понимать, что определение размера таких больших фрагментов ДНК с помощью определения подвижности при электрофорезе в агарозном геле может отличаться от реального размера фрагмента, определенного анализом последовательности ДНК на 1 т.п.о. или более. Для облегчения описания этот фрагмент, происходящий из pTiBo542, в настоящем документе будет обозначаться как фрагмент 14,8 KpnI VirBCDG.

Вариант осуществления способов, описанных в настоящем документе, включает использование для трансформации растения усиливающих трансформацию свойств, кодируемых во фрагменте 14,8 KpnI VirBCDG, выделенном из pSB1, в штаммах Agrobacterium, несущих, по меньшей мере, одну обезоруженную вспомогательную плазмиду Ti, где фрагмент 14,8 KpnI VirBCDG несется плазмидой, имеющей точку начала репликации группы несовместимости, отличной от IncP. Дополнительный вариант осуществления включает штамм Agrobacterium, как описано, для использования в этом способе. Область Т-ДНК, предназначенную для введения в растение с использованием штамма Agrobacterium, может переносить плазмида, имеющая область Т-ДНК, примыкающую, по меньшей мере, к одной границе Т-ДНК Agrobacterium, причем плазмида имеет точку начала репликации группы несовместимости IncP или группы несовместимости, которая совместима с группой несовместимости фрагмента 14,8 KpnI VirBCDG, который переносится плазмидой, имеющей точку начала репликации группы несовместимости, отличной от IncP. Область Т-ДНК этой плазмиды может прилегать к правой и левой границам Т-ДНК Agrobacterium.

Плазмиды приписывают к группам несовместимости (генотипическое обозначение: inc; обозначение группы Inc) на основе последовательностей, содержащихся в плазмиде. Детерминанта inc обычно служит в качестве препятствия для сосуществования у одного и того же хозяина других плазмид той же или родственной группы несовместимости и помогает поддерживать определенное количество копий плазмиды в клетке. См., например, Fernandez-Lopez, et al., (2006) FEMS Microbiol. Rev. 30:942-66; и Adamczyk and Jagura-Burdzy (2003) Acta Biochim. Pol. 50:425-53. Две плазмиды несовместимы, если одна из них в присутствии другой менее стабильна, чем сама по себе. Когда две плазмиды одной и той же группы несовместимости находятся в одной и той же клетке, может происходить конкуренция за клеточные ресурсы. Та плазмида, которая способна реплицироваться быстрее или предоставляет какое-либо другое преимущество, будет представлена среди копий в непропорциональной степени, что допускается системой несовместимости. Неожиданно оказалось, что плазмиды могут быть также несовместимыми, когда обе они обладают одними и теми же функциями своего распределения в дочерних клетках.

Плазмиды обычно попадают только в одну из многих существующих групп несовместимости. Насчитывается более 30 известных групп несовместимости. Плазмиды, принадлежащие к группе несовместимости IncP, всесторонне исследованы, и сконструировано большое количество плазмид, которые происходят из этой группы IncP (Schmidhauser et al., (1988) Biotechnology 10:287-332). Примеры плазмид, содержащих группу несовместимости IncP, включают: pMP90RK, pRK2013, pRK290, pRK404 и pRK415. Эти плазмиды могут поддерживаться в многочисленных бактериальных штаммах, включая E. coli и Agrobacterium tumefaciens. Примеры других групп несовместимости включают, но не ограничиваются этим: IncN, IncW, IncL/M, IncT, IncU, IncW, IncY, IncB/O, IncFII, IncII, IncK, IncCom9, IncFI, IncFII, IncFIII, IncHIl, IncHI2, IncX, IncA/C, IncD, IncFIV, IncFV/FO, IncFVI, IncHl 3, IncHII, Incl2, IncI, IncJ, IncV, IncQ и тому подобное, включая их варианты, например, имеющие существенное сходство последовательности или функциональное отношение. В таблице 1 перечислено несколько общеизвестных групп несовместимости и представлены примеры плазмид, которые представляют эти группы несовместимости (это перечисление групп несовместимости и плазмид предлагается только в качестве примера и не предназначено для ограничения групп несовместимости и плазмид, используемых в штаммах Agrobacterium и описанных в настоящем документе способах).

Другой вариант осуществления описанных в настоящем документе способов включает использование усиливающих трансформацию свойств, кодируемых фрагментом 14,8 KpnI VirBCDG, выделенным из pSB1, в штаммах Agrobacterium, имеющих недостаточность функции RecA и несущих, по меньшей мере, одну обезоруженную вспомогательную плазмиду pTi, где фрагмент 14,8 KpnI VirBCDG несется плазмидой, имеющей точку начала репликации группы несовместимости, отличной от IncP. Дополнительный вариант осуществления включает штамм Agrobacterium, как описано в настоящем документе, для использования в этом способе. Область Т-ДНК, предназначенная для введения в растение с использованием этого штамма Agrobacterium, может переноситься плазмидой, имеющей область Т-ДНК, примыкающую, по меньшей мере, к одной границе Т-ДНК Agrobacterium, причем плазмида имеет точку начала репликации группы несовместимости IncP или группы несовместимости, которая совместима с группой несовместимости фрагмента 14,8 KpnI VirBCDG, переносимого плазмидой, имеющей точку начала репликации группы несовместимости, отличной от IncP.

Еще один вариант осуществления описанных в настоящем документе способов включает использование усиливающих трансформацию свойств, кодируемых фрагментом 14,8 KpnI VirBCDG, выделенным из pSB1, и вставленным, по меньшей мере, в одну обезоруженную вспомогательную плазмиду pTi, где фрагмент 14,8 KpnI VirBCDG интегрирован в нейтральный сайт интеграции, локализованный на хромосоме штамма Agrobacterium, отличного от штамма C58. Дополнительный вариант осуществления включает штамм Agrobacterium, как описано, для использования в этом методе. Область Т-ДНК, предназначенная для введения в растение с использованием этого штамма Agrobacterium, дополнительно включает плазмиду, имеющую область Т-ДНК, примыкающую, по меньшей мере, к одной границе Т-ДНК Agrobacterium.

Хотя известны супербинарные системы, например, см. патенты WO 94/00977 A1, WO 95/06722 A1 и WO 95/16031 Al, и они дополнительно описаны Komari et al., (выше) и Komori et al., (выше), эти системы обладают рядом недостатков. Рабочий недостаток супербинарной системы, который преодолевается штаммами Agrobacterium и описанными в настоящем документе способами, заключается в необходимости создания коинтегративной плазмиды из pSB1 и pSB11 (и их производными), в качестве средства, с помощью которого измененная Т-ДНК, переносимая на производных pSB11, стабильно поддерживается в Agrobacterium. Это событие коинтеграции создает пару больших (приблизительно 2,3 т.п.о.) прямо повторяющихся последовательностей из-за рекомбинации между гомологичными областями pSB1 и pSB11. Как хорошо известно специалистам в области молекулярной биологии, большие повторяющиеся последовательности, такие как эти, являются предпочтительными мишенями для внутримолекулярной рекомбинации, что в конечном итоге приводит к делециям ДНК и другим перестройкам, особенно, когда повторы являются частью структуры плазмиды. В супербинарной системе Agrobacterium такие перестройки могут приводить к частичной перестройке или полной потере области Т-ДНК, введенной производными pSB11, приводя в конечном итоге к незначительному переносу или к отсутствию переноса желаемых чужеродных генов в клетки растения-хозяина.

Дополнительный недостаток описанной выше супербинарной системы, который также преодолевается штаммами Agrobacterium и описанными в настоящем документе способами, заключается в том, что создание коинтегративной плазмиды из производных pSB1 и pSB11 генерирует большую плазмиду (минимум более 43 т.п.о.), имеющую две различных точки начала репликации (ori) ColE1-типа (группа несовместимости pMB1/ColE1), а также третий ori, происходящий от плазмиды RK2 (группа несовместимости IncP). Хотя в нормальных условиях ColE1 ori является нефункционирующим в Agrobacterium, известны геномные мутации, которые позволяют стабильно поддерживать плазмиды, имеющие ColE1 ori, в Agrobacterium (Ruslyakova et al., (1999) Russian J. Genet. 35:327-331). В клетках, имеющих такие мутации, плазмида, такая как коинтегративная плазмида производных pSB1::pSB1l, имеющая 3 функционирующих точки начала репликации, как можно ожидать, будет крайне нестабильной. Таким образом, супербинарная система имеет дефекты, на которые выгодно направлены элементы штаммов Agrobacterium и способы трансформации растений, описанные в настоящем документе.

Структура ДНК чужеродного гена или генов, предназначенных для введения и экспрессии в трансгенных растительных клетках с помощью трансформации, опосредованной Agrobacterium, может иметь сильное влияние на стабильность бинарной векторной плазмиды или челночной векторной плазмиды, несущих эти гены в клетках Escherichia coli и Agrobacterium. Нестабильность частично проявляется, когда чужеродные гены включают компоненты генов, которые применяются множество раз в генных конструктах. Например, не является необычным, что конкретный промотор, способный к экспрессии в растениях, может быть использован для стимуляции экспрессии кодирующих областей различных белков в трансгенном растении. Другие компоненты гена, такие как 3'-нетранслируемые области (3'UTR) (т.е. последовательности терминации транскрипции и последовательности, определяющие добавление полиаденилирования) и даже очень сходные кодирующие области белков могут дуплицироваться или присутствовать во множественных копиях в пределах одной области Т-ДНК. Как указывалось выше, эти элементы повторяющихся последовательностей, которые могут существовать либо в инвертированной, либо в прямой ориентации, являются мишенями для внутримолекулярных рекомбинаций, что может приводить к делециям ДНК и другим перестройкам, особенно когда повторы являются частью структуры плазмиды.

Разработано множество специализированных штаммов E. coli, служащих в качестве хозяев для молекулярного клонирования, что помогает преодолеть такие трудности как нестабильность (например, штаммы STBL2™, STBL3™ и STBL4™, предлагаемые INVITROGEN; Carlsbad, CA). Общей характеристикой всех таких клонирующих штаммов E. coli является присутствие геномной мутации в гене recA. Белок RecA представляет собой многофункциональный фермент, который играет роль в гомологичной рекомбинации, репарации ДНК и индукции бактериального ответа SOS. В процессе гомологичной рекомбинации белок функционирует в качестве ДНК-зависимой АТФазы, стимулируя конъюгацию хромосом, образование гетеродуплекса и обмен цепями между гомологичными ДНК. Таким образом, клетка с недостаточностью функции RecA более предрасположена к сохранению устойчивости гомологичных последовательностей ДНК без перестройки или делеции.

Штаммы Agrobacterium с недостаточностью RecA разработаны с целью содействия в решении проблем нестабильности, наблюдаемых при клонировании больших фрагментов ДНК, содержащих повторяющиеся последовательности (Klapwicj et al., (1979) Molec. Gen. Genet. 173:171-175; Farrand et al., (1989) J. Bacteriol. 171:5314-5321; Lazo et al., (1991) Bio/Technology 9:963-967). Эти штаммы, как доказано, пригодны для содействия стабилизации трансформирующих конструктов высокой молекулярной массы в некоторых случаях (Frary and Hamilton, (2001) Transgenic Res. 10:121-132), но не во всех случаях (Song et al., (2003) Theor. Appl. Genet.107:958-964). Таким образом, могут быть выгодно использованы хромосомные среды Agrobacterium, являющиеся дефектными в отношении recA в разрабатываемых штаммах, которые высокоэффективны в поддержании плазмиды и способности трансформировать растение. В дополнение к использованию хромосомных сред Agrobacterium с недостаточностью recA в разрабатываемых штаммах для применения в способах, описанных в настоящем документе, функционирование recA может быть отключено у существующего или полученного штамма с целью сделать штамм, пригодным для способов, описанных в настоящем документе. См., например, Farrand et al. (выше). Например, может быть создан штамм с функционирующим RecA и любыми желаемыми хромосомными добавками, например, добавлением генов vir, затем функция RecA может быть блокирована.

Могут быть использованы векторы BIBAC, сконструированные для возможности эффективной трансформации большими фрагментами ДНК растительных и нерастительных клеток-хозяев. См., например, патент США № 5733744, патент США № 5977439 и патентную заявку США № 2002/0123100 A1. Одним штаммом Agrobacterium, который может быть использован с векторами BIBAC, является штамм UIA143 с недостаточностью RecA, разработанный Farrand et al., (выше). При усовершенствованиях системы BIBAC для повышения способности созданных штаммов Agrobacterium к трансформации растен