Конкурентоспособные и эффективные штаммы бактерий

Конкурентоспособные и эффективные штаммы бактерий

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит список последовательностей в считываемой с помощью компьютера форме. Считываемая с помощью компьютера форма включена в настоящее описание в качестве ссылки.

ССЫЛКА НА ДЕПОЗИТ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Настоящая заявка содержит ссылку на депозит биологического материала, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки. Для полной информации см. таблицу 1.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к выделенным штаммам бактерий и к способу выбора штаммов бактерий, имеющих характеристики увеличенной конкурентоспособности и эффективности.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Для поддержания здорового роста растения должны извлекать множество элементов из почвы, в которой они растут. Эти элементы включают азот и так называемые микроэлементы (например, медь, железо и цинк), однако многие почвы имеют дефицит таких элементов или они содержат их только в формах, которые не могут легко быть поглощены растениями (в целом, полагают, что необходимые элементы не могут быть легко поглощены растениями, если они не присутствуют в почве в растворенной форме). Азот является необходимым элементом для большинства растений, поскольку он участвует в синтезе аминокислот, белков, нуклеотидов, нуклеиновых кислот, хлорофилла, коферментов и в росте и здоровье растения в целом. Чтобы устранять такой дефицит, источники дефицитных элементов часто вносят в почву для увеличения скорости роста и выхода, получаемого из сельскохозяйственных растений. Например, часто в почву добавляют нитрат и/или аммоний для устранения дефицита доступного азота.

В области растениеводства хорошо известно, что для многих возделываемых культур требуется, чтобы почва предоставляла относительно большие количества азота растению. Примечательными исключениями из этих растений, требующих азот через почву, являются растения семейства бобовых.

В частности, бобовые растения являются уникальными относительно небобовых растений их способностью фиксировать атмосферный азот в форме аммиака. Способность фиксировать атмосферный азот в форме пригодного источника азота для растения устраняет необходимость получения растением азота из почвы. Однако фиксация азота требует симбиотических взаимоотношений между бобовым растением и нативными бактериями в почве. Одними из наиболее широко исследованных партнеров в этих симбиотических взаимоотношениях являются бактерии, принадлежащие роду Bradyrhizobium или Rhizobium. Gresshoff, P. (1999). Identification of Plant Genes Involved in Plant-Microbe Interactions. Stacey, G. & Keen, T. (Ed.), Plant-Microbe Interactions (4^th ed.) (Ch. 6). St. Paul: APS Press.

Симбиоз обычно достигается путем обмена комплексом двунаправленных сигналов между растением и микроорганизмом, и микроорганизмом и растением. Как правило, растительные факторы, такие как флавоноиды и флавоноид-подобные вещества, индуцируют колонизацию бактерий в корневом клубеньке бобового растения. (Gresshoff, 1999). После колонизации бактериями корневого клубенька, бактерии осуществляют морофологические изменения в растении, а именно, закручивание корневых волосков и развитие нового корневого органа - клубенька (Gresshoff, 1999). Клубенек позволяет установление новых физиологических условий для дифференцировки индуцирующих клубеньки бактерий в азотфиксирующий эндосимбионт, или бактероид, для колонизированного растения. (Gresshoff, 1999).

Хорошо известно, что подвижность и хемотаксис Rhizobial являются важными признаками для конкурентоспособности штаммов. Например, в Althabegoiti, et al., 2008, FEMS Microbiol. Lett. 282: 115-123 обсуждается получение самопроизвольного мутантного штамма из USDA 110, имеющего увеличенную подвижность, который усиливает образование клубеньков по сравнению со штаммом дикого типа. Кроме того, в Maier, et al., 1990, Appl. Environ. Microbiol. 56 (8): 2341-2346 обсуждается роль молибдена в процессе биологической фиксации азота. Более того, в Alves, et al., 2003, Plant and Soil 252: 1-9 обсуждаются инокуляты сои, используемые в Бразилии, и важность конкурентоспособности для эффективной фиксации азота. Наконец, в Bloem, J.F., et al., 2001, Bio Fertil. Soils 33: 181-189 описана важность конкурентоспособности при выборе штаммов. В этом исследовании исследователи используют способы генетической инженерии для помещения репортерного гена (GUS) в их маркерный штамм для определения конкурентоспособности штаммов. (Bloem, et al. 2001). Поскольку проведенное исследование (Bloem, et al. 2001) требовало широкого применения химического окрашивания и технологии микроскопии, описанный способ остается непрактичным подходом для скрининга большой выборки микроорганизмов.

Задачей настоящего изобретения является предоставление сверхконкурентоспособного изолята(ов) бактерий из рода Bradyrhizobia для колонизации бобовых растений, который превосходит по способности к колонизации коммерчески доступные штаммы, например, коммерческий штамм USDA 532C. Следующей задачей настоящего изобретения является предоставление сверхконкурентоспособного изолята(ов) бактерий из рода Bradyrhizobia для колонизации бобовых растений, способного повышать эффективность стимуляции роста бобового растения по сравнению с коммерчески доступными штаммами, например, коммерческим штаммом USDA 532C.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для улучшения общего здоровья растения и доступности пригодного источника азота для растений существует потребность в штаммах бактерий, которые являются лучшими в отношении колонизации растений и усиления общего роста растений. Выделенные штаммы по настоящему изобретению реализуют эти преимущества.

Настоящее изобретение относится к выделенным штаммам бактерий, имеющим по меньшей мере следующие улучшенные характеристики по сравнению с коммерчески доступными штаммами, например, коммерческим штаммом USDA 532C, где улучшенные характеристики включают, но не ограничиваются ими:

a. увеличенную конкурентоспособность для колонизации растения; и

b. увеличенную эффективность стимуляции роста растения.

Настоящее изобретение относится к биологически чистой культуре(ам) штамма(ов) Bradyrhizobia japonicum

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50592 (также депонированный как NRRL B-59571);

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50593 (также депонированный как NRRL B-59572);

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50586 (также депонированный как NRRL B-59565);

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50588 (также депонированный как NRRL B-59567);

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50587 (также депонированный как NRRL B-59566);

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50589 (также депонированный как NRRL B-59568);

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50591 (также депонированный как NRRL B-59570);

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50590 (также депонированный как NRRL B-59569);

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50594 (также депонированный как NRRL B-50493);

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50726;

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50727;

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50728;

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50729; и

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50730, или комбинация по меньшей мере двух или более из указанных выше депонированных штаммов.

Настоящее изобретение также относится к выделенному штамму(ам) бактерий по настоящему изобретению, который включает штамм(ы), который является близкородственным любому из описанных выше штаммов, исходя из идентичности последовательности 16S рДНК, и который является по меньшей мере на 95% идентичным любому из описанных выше штаммов, исходя из идентичности последовательности 16S рДНК.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу усиления роста растений, включающему применение к растениям, семенам растений или почве, окружающей растения или семена растений, композиции, содержащей по меньшей мере один из штаммов по настоящему изобретению или комбинацию по меньшей мере двух или более из указанных выше депонированных штаммов.

Кроме того, изобретение относится к композициям, содержащим один или несколько штаммов по настоящему изобретению, в том числе с агрономически приемлемым носителем.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1A представлено изображение геля ПЦР, на котором показан уникальный праймер 209, специфичный к USDA 532C.

На фиг.1B представлено изображение геля ПЦР, на котором показана специфичность праймера 209 с использованием USDA 532C и нативных штаммов.

На фиг.2A представлено изображение геля ПЦР, на котором показан штамм Bradyrhizobia japonicum USDA 532C в качестве конкурентно доминирующего штамма для образования клубеньков сои.

На фиг.2B представлено изображение геля ПЦР, на котором показаны штаммы, отличные от штамма Bradyrhizobia japonicum USDA 532C, в качестве конкурентно доминирующего штамма для образования клубеньков сои.

На фиг.3A представлена дендрограмма отпечатков ДНК выделенных штаммов и USDA 532C:

138 - NRRL B-50589 (также депонированный как NRRL B-59568);

13 - NRRL B-50586 (также депонированный как NRRL B-59565);

p140 - USDA 532C;

184 - NRRL B-50594 (также депонированный как NRRL B-50493);

142 - NRRL B-50590 (также депонированный как NRRL B-59569);

130 - NRRL B-50587 (также депонированный как NRRL B-59566);

65 - NRRL B-50588 (также депонированный как NRRL B-59567);

198 - NRRL B-50592 (также депонированный как NRRL B-59571);

135 - NRRL B-50591 (также депонированный как NRRL B-59570); и

48 - NRRL B-50593 (также депонированный как NRRL B-59572).

На фиг.3B представлена дендрограмма отпечатков ДНК выделенных штаммов и USDA 532C:

138 - NRRL B-50589 (также депонированный как NRRL B-59568);

13 - NRRL B-50586 (также депонированный как NRRL B-59565);

140 - USDA 532C;

184 - NRRL B-50594 (также депонированный как NRRL B-50493);

142 - NRRL B-50590 (также депонированный как NRRL B-59569);

130 - NRRL B-50587 (также депонированный как NRRL B-59566);

65 - NRRL B-50588 (также депонированный как NRRL B-59567);

198 - NRRL B-50592 (также депонированный как NRRL B-59571);

135 - NRRL B-50591 (также депонированный как NRRL B-59570);

48 - NRRL B-50593 (также депонированный как NRRL B-59572)

318 - NRRL B-50727,

278 - NRRL B-50726,

727 - NRRL B-50730,

370 - NRRL B-50728; и

518 - NRRL B-50729.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к выделенным штаммам бактерий, имеющим по меньшей мере следующие улучшенные характеристики по сравнению с коммерчески доступными штаммами, например, коммерческим штаммом USDA 532C, где улучшенные характеристики включают, но не ограничиваются ими:

a. увеличенную конкурентоспособность для колонизации растения; и

b. увеличенную эффективность в отношении стимуляции роста растения.

“Штамм(ы) бактерий”, как используют в рамках изобретения, означает штаммы бактерий, которые являются диазотрофами. Это означает бактерии, которые являются симбиотическими азотфиксирующими бактерии. Неограничивающие примеры штаммов бактерий, как используют в рамках изобретения, включают, но не ограничиваются ими бактерии рода Rhizobium spp. (например, R. cellulosilyticum, R. daejeonense, R. etli, R. galegae, R. gallicum, R. giardinii, R. hainanense, R. huautlense, R. indigoferae, R. leguminosarum, R. loessense, R. lupini, R. lusitanum, R. mongolense, R. miluonense, R. sullae, R. tropici, R. undicola и/или R. yanglingense), Bradyrhizobium spp. (например, B. bete, B. canariense, B. elkanii, B. iriomotense, B. japonicum, B. jicamae, B. liaoningense, B. pachyrhizi и/или B. yuanmingense), Azorhizobium spp. (например, A. caulinodans и/или A. doebereinerae), Sinorhizobium spp. (например, S. abri, S. adhaerens, S. americanum, S. aboris, S. fredii, S. indiaense, S. kostiense, S. kummerowiae, S. medicae, S. meliloti, S. mexicanus, S. morelense, S. saheli, S. terangae и/или S. xinjiangense), Mesorhizobium spp (M. albiziae, M. amorphae, M. chacoense, M. ciceri, M. huakuii, M. loti, M. mediterraneum, M. pluifarium, M. septentrionale, M. temperatum, M. tianshanense). В одном конкретном варианте осуществления штамм(ы) бактерий по изобретению дополнительно включают штаммы Bradyrhizobium japonicum, имеющие номера доступа депозитов NRRL B-50592 (также депонированный как NRRL B-59571), NRRL B-50593 (также депонированный как NRRL B-59572), NRRL B-50586 (также депонированный как NRRL B-59565), NRRL B-50588 (также депонированный как NRRL B-59567), NRRL B-50587 (также депонированный как NRRL B-59566), NRRL B-50589 (также депонированный как NRRL B-59568), NRRL B-50591 (также депонированный как NRRL B-59570); NRRL B-50590 (также депонированный как NRRL B-59569); NRRL B-50594 (также депонированный как NRRL B-50493); NRRL B-50726; NRRL B-50727; NRRL B-50728; NRRL B-50729; NRRL B-50730, или комбинацию по меньшей мере двух или более из указанных выше депонированных штаммов, включая два из указанных выше штаммов, по меньшей мере три из указанных выше штаммов, по меньшей мере четыре из указанных выше штаммов, по меньшей мере пять из указанных выше штаммов, по меньшей мере шесть из указанных выше штаммов, по меньшей мере семь из указанных выше штаммов, по меньшей мере восемь из указанных выше штаммов, по меньшей мере девять из указанных выше штаммов, по меньшей мере десять из указанных выше штаммов, по меньшей мере одиннадцать из указанных выше штаммов, по меньшей мере двенадцать из указанных выше штаммов, по меньшей мере тринадцать из указанных выше штаммов, вплоть до и включая все из указанных выше штаммов.

Термин “коммерчески доступный штамм(ы)” означает коммерчески доступные штаммы бактерий, например, USDA 532C, USDA 110, USDA 123, USDA 127, USDA 129, и т.д. Cregan, P.B., et al., 1989, Appl. and Enviro. Microbiol. 55 (10): 2532-2536.

Как используют в рамках изобретения, “увеличенная конкурентоспособность” и/или “увеличенное образование клубеньков” означают штамм(ы), обладающие доминирующей процентной заполненностью клубеньков, например, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, вплоть до 100% заполненности клубеньков. “Увеличеную конкурентоспособность” определяли согласно детальному анализу(ам), описанному ниже (см. Материалы и способы: “Протокол первичного скрининга” и “Протокол испытания конкуренции”).

Как используют в рамках изобретения, термин “клубенек” включает, но не ограничивается ими, детерминантные клубеньки, индетерминантные клубеньки или их комбинацию. Примеры детерминантных клубеньков и индетерминантных клубеньков хорошо известны в данной области и описаны в Denison, R. F., 2000, The Amer. Naturalist. 156 (6): 567-576. Детерминантные клубеньки встречаются в видах Glycine, Lotus или Phaseolus и имеют округлую или сферическую форму. (Denison, 2000). Детерминантные клубеньки растут только в течение ограниченного периода времени, как правило, несколько недель. (Denison, 2000). В противоположность детерминантным клубенькам, индетерминантные клубеньки встречаются в видах Medicago, Trifolium и Pisium, имеют вытянутую форму и растут постоянно. (Denison, 2000).

“Заполненность клубеньков” представляет собой термин, известный в данной области. McDermott T.R. & Graham, P.H., Appl. and Environ. Microbiol. 55(10): 2493-2498. Как используют в рамках изобретения, “заполненность клубеньков” означает процент клубеньков, занятых штаммом(ами) бактерий, отличным от коммерчески доступного штамма Bradyrhizobium, например USDA 532C, и/или количество клубеньков, содержащих конкретный штамм(ы) бактерий, отличный от коммерчески доступного штамма Bradyrhizobium, например USDA 532C, деленное на общее количество клубеньков, содержащих все штаммы бактерий. “Заполненность клубеньков” определяли в соответствии с детальным анализом(ами), описанным ниже (см. Материалы и способы: “Протокол первичного скрининга” и “Протокол испытания конкуренции”), и ее можно определить из анализа клубеньков растений, полученных из образцов либо из теплицы, либо с поля. В качестве примера, процентная заполненность клубеньков = A/(A+B) где A представляет собой количество клубеньков, содержащих конкретный штамм(ы) бактерий, отличный от коммерчески доступного штамма Bradyrhizobium, например, USDA 532C, и B представляет собой количество клубеньков, содержащих коммерчески доступный штамм Bradyrhizobium, например, USDA 532C. В данной области хорошо известно, что, за редким исключением, один клубенек содержит только один штамм бактерий. Johnston, A.W.B., et al., 1974, J. Gen. Microbiol 87: 343-350; Dunham, D. H. & Baldwin, I.L., 1931, Soil Science 32: 235-249; Johnson, H.W., et al., 1963, Agrono. J. 55: 269-271; Dudman, W.F. & Brockwell, J., 1968, J. Agricul. Res. 19: 739-747; Nicol, H. & Thorton, H.G., 1941, Proc. Roy. Soc. B 130, 32-59; Hughes, D.Q., & Vincent, J.M., 1942, Proc. of the Linnenan Soc. of New South Wales 67: 142-152; и Vincent, J.M. & Waters, L.M., 1953, J. Gen. Microbiol. 9: 357-370.

Как используют в рамках изобретения, “увеличенная эффективность стимуляции роста” включает по меньшей мере одно из увеличенного выхода растений, измеряемого в значениях бушель/акр, увеличенного количества плодов, увеличенного количества корней, увеличенной длины корней, увеличенной массы корней, увеличенного объема корней, увеличенной площади листьев, увеличенной густоты стояния растений, увеличенной мощности растений и/или увеличенной способности фиксировать азот (N₂). “Увеличенную эффективность стимуляции роста” определяли в соответствии с детальным анализом(ами), описанным ниже (см. Материалы и способы: “Протокол первичного скрининга” и “Протокол испытания эффективности”) и ее можно определять из анализа растений, полученных из образцов либо из теплицы, либо с поля.

Как используют в рамках изобретения “увеличенное количество плодов” означает увеличенное общее количество соевых бобов на соевом растении и/или увеличенную общую сухую массу соевых бобов на соевом растении.

Как используют в рамках изобретения “общая масса сухого вещества” означает массу растительного материала (например, плоды растений, стручки растений, корни растений, клубеньки растений, цельные растения, части растений, и т.д.) после инкубации при 80°C в течение определенного периода времени, например, по меньшей мере 4 часов, по меньшей мере 8 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 24 часов, по меньшей мере 48 часов и т.д., или любого периода времени, необходимого для высушивания растительного материала. Следует понимать, что время высушивания для определения “общей массы сухого вещества” зависит от многих факторов. Неограничивающие факторы, которые могут повлиять на время высушивания, включают материал, подлежащий высушиванию, массу материала, подлежащего высушиванию, количество материала, подлежащего высушиванию, и/или их комбинации. Инкубацию можно проводить в любом устройстве с контролируемой температурой, используемом в данной области. Для целей настоящего изобретения “общую массу сухого вещества определяли с помощью инкубатора Eppendorf Innova^® 42R.

Термин “увеличенная способность фиксации азота (N₂)”, как используют в рамках изобретения, означает, что выделенные бактерии могут увеличивать фиксацию азота (N₂). В соответствии с “Протоколом испытания эффективности”, предоставленным ниже (Материалы и способы), относительную способность фиксации азота (N₂) бактериями можно количественно определять путем измерения общего содержания азота в растении с использованием стандартных способов количественного определения азота, известных специалисту в данной области (например, способ Kjeldahl и т.д.). См. Takahashi, M., et al., 2007. Uptake, Assimilation, and Novel Metabolism of Nitrogen Dioxide in Plants, p. 109-118. N. Willey (ed.), Phytoremediation: Methods and Reviews, vol. 23. Humana Press, New York; Bremner, J. M. 1965. Total nitrogen, p. 1149-1178. C.A. Black (ed.), Methods of soil analysis, vol. 2. American Society for Agronomy, Madison; Schank, S.C., et al., 1981, App. and Enviro. Microbiol., 41 (2): 342-345.

В другом аспекте настоящего изобретения выделенный штамм(ы) бактерий имеет увеличенную температурную устойчивость. “Увеличенная температурная устойчивость” означает диапазон температур, при котором выделенный бактериальный штамм(ы) способен расти, например, максимальные и минимальные температуры, при которых выделенный штамм(ы) Bradyrhizobium может расти. В одном аспекте “увеличенную температурную устойчивость” определяли в соответствии с “Протоколом профиля температур”, рассмотренным ниже (Материалы и способы).

В другом аспекте настоящего изобретения выделенный штамм(ы) бактерий естественным образом устойчив к глифосату. В одном аспекте “увеличенную температурную устойчивость” определяли в соответствии с “Протоколом профиля устойчивости к глифосату”, рассмотренным ниже (Материалы и способы).

В другом аспекте выделенный штамм(ы) бактерий по настоящему изобретению включает штамм(ы), который является близкородственным любому из описанных выше штаммов, исходя из идентичности последовательности 16S рДНК. См. Stackebrandt E, et al., “Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of the species definition in bacteriology,” Int J Syst Evol Microbiol. 52(3):1043-7 (2002) в отношении использования идентичности последовательностей 16S рДНК для определения родства в бактериях. В одном варианте осуществления по меньшей мере один штамм по меньшей мере на 95% идентичен любому из описанных выше штаммов, исходя из идентичности последовательностей 16S рДНК, по меньшей мере на 96% идентичен любому из описанных выше штаммов, исходя из идентичности последовательностей 16S рДНК, по меньшей мере на 97% идентичен любому из описанных выше штаммов, исходя из идентичности последовательностей 16S рДНК, по меньшей мере на 98% идентичен любому из описанных выше штаммов, исходя из идентичности последовательностей 16S рДНК, по меньшей мере на 98,5% идентичен любому из описанных выше штаммов, исходя из идентичности последовательностей 16S рДНК, по меньшей мере на 99% идентичен любому из описанных выше штаммов, исходя из идентичности последовательностей 16S рДНК или по меньшей мере на 99,5% идентичен любому из описанных выше штаммов, исходя из идентичности последовательностей 16S рДНК.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу выделения штамма(ов) бактерий, имеющих увеличенную конкурентоспособность для занятия клубеньков бобового растения и увеличенную эффективность стимуляции роста бобового растения. Как используют в рамках изобретения, термин “изолят, изоляты, выделение и/или выделенный, и т.д.” означает, что указанный материал извлечен из окружающей среды, в которой он обычно находится. Способ включает, среди прочего,

a. получение штамма(ов) бактерий из образца почвы;

b. воздействие штаммом(ами) бактерий и коммерчески доступным штаммом на бобовое растение;

с. выбор штамма(ов) бактерий, которые являются более конкурентоспособными, чем коммерчески доступный штамм, в отношении занятия клубеньков бобового растения;

d. анализ выбранного штамма(ов) бактерий, который является более конкурентоспособным в отношении занятия клубеньков бобового растения, чем коммерчески доступный штамм, на тот бактериальный штамм(ы), который имеет увеличенную эффективность стимуляции роста бобового растения; и

e. выделение штамма(ов) бактерий, имеющего увеличенную эффективность стимуляции роста бобового растения.

В одном аспекте выделенный штамм(ы) бактерий представляет собой штаммы рода Bradyrhizobium. В другом аспекте способ дополнительно включает стадию скрининга штамма(ов) Bradyrhizobium с использованием специфического праймера, уникального для коммерчески доступного штамма Bradyrhizobia, например, коммерческого штамма USDA 532C.

В другом аспекте, способ включает выделение культуры Bradyrhizobia japonicum, выбранной из группы, состоящей из:

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50592 (также депонированный как NRRL B-59571);

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50593 (также депонированный как NRRL B-59572);

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50586 (также депонированный как NRRL B-59565);

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50588 (также депонированный как NRRL B-59567);

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50587 (также депонированный как NRRL B-59566);

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50589 (также депонированный как NRRL B-59568);

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50591 (также депонированный как NRRL B-59570);

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50590 (также депонированный как NRRL B-59569);

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50594 (также депонированный как NRRL B-50493);

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50726;

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50727;

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50728;

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50729; и

штамм, имеющий номер доступа депозита NRRL B-50730, или комбинация по меньшей мере двух или более из указанных выше депонированных штаммов, включая более двух, как например, по меньшей мере три из описанных выше штаммов, по меньшей мере четыре из описанных выше штаммов, по меньшей мере пять из описанных выше штаммов, по меньшей мере шесть из описанных выше штаммов, по меньшей мере семь из описанных выше штаммов, по меньшей мере восемь из описанных выше штаммов, по меньшей мере девять из описанных выше штаммов, по меньшей мере десять из описанных выше штаммов, по меньшей мере одиннадцать из описанных выше штаммов, по меньшей мере двенадцать из описанных выше штаммов, по меньшей мере тринадцать из описанных выше штаммов, в том числе, вплоть до всех из описанных выше штаммов.

В другом аспекте способ включает выделение штамма(ов) бактерий, имеющего увеличенную температурную устойчивость. См. Материалы и способы: “Протокол профиля температур”.

Более того, способ включает выделение штамма(ов) бактерий, имеющего природную устойчивость к глифосату. См. Материалы и способы: “Протокол профиля устойчивости к глифосату”.

В другом предпочтительном аспекте способ включает выделение штамма(ов) бактерий, выбранного из рода, состоящего из Rhizobium и Bradyrhizobium, способного усиливать образование клубеньков бобового растения.

Композиция

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей по меньшей мере один выделенный бактериальный штамм(ы) по настоящему изобретению или комбинацию по меньшей мере двух или более из указанных выше депонированных штаммов, в том числе более двух, как например, по меньшей мере три из описанных выше штаммов, по меньшей мере пять из описанных выше штаммов, по меньшей мере шесть из описанных выше штаммов, по меньшей мере семь из описанных выше штаммов, по меньшей мере восемь из описанных выше штаммов, по меньшей мере девять из описанных выше штаммов, по меньшей мере десять из описанных выше штаммов, по меньшей мере одиннадцать из описанных выше штаммов, по меньшей мере двенадцать из описанных выше штаммов, по меньшей мере тринадцать из описанных штаммов, в том числе вплоть до всех из описанных выше штаммов, и агрономически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления композиция может представлять собой композицию инокулята. Как используют в рамках изобретения и в данной области, термин “композиция инокулята” относится, главным образом, к композициям или материалам, которые вносят совместимые бактериальные штаммы либо на внешнюю поверхность семян, либо в борозду для семян.

Композиция может содержать один или несколько агрономически приемлемых носителей. В случаях, когда используют несколько агрономически приемлемых носителей, агрономически приемлемые носители могут быть одинаковыми или могут отличаться. Как используют в рамках изобретения применительно к термину "носитель", термин “агрономически приемлемый” относится к любому материалу, который можно использовать для доставки активных веществ в семена, почву или растение, и предпочтительно этот носитель можно добавлять (к семенам, в почву или в растение) без неблагоприятного эффекта на рост растения, структуру почвы, осушение почвы и т.п. Пригодные носители включают, но не ограничиваются ими, чешуи пшеницы, отруби, измельченную пшеничную солому, торфяные порошки или гранулы, гранулы на основе гипса и глины (например, каолин, бентонит, монтмориллонит). Составы в качестве жидкости, торфа или смачиваемого порошка пригодны для покрытия семян. При использовании для покрытия семян, материал можно смешивать с водой, наносить на семена и позволять ему высохнуть. Примеры других носителей включают влажные отруби, высушенные, просеянные и нанесенные на семена перед покрытием адгезивным веществом, например, гуммиарабиком. В вариантах осуществления, которые охватывают состав активных веществ, агрономически приемлемый носитель может быть водным. Если используют жидкий носитель, жидкий (например, вода) носитель, как правило, включает среду для культивирования штаммов бактерий. Неограничивающие примеры подходящих сред для роста штаммов бактерий включают дрожжевой экстракт с маннитом, дрожжевой экстракт с глицерином, или любую среду, о которой специалистам в данной области известно, что она совместима и/или обеспечивает питательные вещества для роста штаммов бактерий.

Также композиции по настоящему изобретению охватывают композиции, включающие одну или несколько сигнальных молекул. Неограничивающие примеры сигнальных молекул растений включают факторы nod (т.е. липохитоолигосахариды), хитоолигосахариды, хитиновые соединения, флавоноиды, жасмоновую кислоту или ее производные, линолеиновую кислоту или ее производные, линоленовую кислоту или ее производные, каррикины или их комбинации.

Соединения липохитоолигосахаридов (LCO), также известные в данной области как симбиотические сигналы Nod или факторы Nod, состоят из олигосахаридной основной цепи из β-1,4-связанных остатков N-ацетил-D-глюкозамина ("GlcNAc") с N-связанной жирной ацильной цепью, конденсированной на невосстанавливающем конце. LCO отличается количеством остатков GlcNAc в основной цепи, длиной и степенью насыщенности жирной ацильной цепи, и замещениями восстанавливающих и невосстанавливающих остатков сахаров. Пример LCO представлен ниже в качестве формулы I:

на которой:

G представляет собой гексозамин, который может быть замещен, например, ацетильной группой на азоте, сульфатной группой, ацетильной группой и/или простой эфирной группой на кислороде,

R₁, R₂, R₃, R₅, R₆ и R₇, которые могут быть идентичными или могут отличаться, обозначают H, CH₃ CO-, C_xH_yCO-, где x представляет собой целое число от 0 до 17, и y представляет собой целое число от 1 до 35, или любую ацильную группу, например, такую как карбамил,

R₄ обозначает моно-, ди- или триненасыщенную алифатическую цепь, содержащую по меньшей мере 12 атомов углерода, и n представляет собой целое число от 1 до 4.

LCO можно получать (выделять и/или очищать) из бактерий, таких как Rhizobia, например, Rhizobium spp., Bradyrhizobium spp., Sinorhizobium spp. и Azorhizobium spp. Структура LCO является характерной для каждого из вида бактерий, и каждый штамм может продуцировать множество LCO с различными структурами. Например, конкретные LCO из S. meliloti также описаны в патенте США 5549718, имеющие формулу II:

в которой R обозначает H или CH₃CO- и n равно 2 или 3.

Более конкретные LCO включают NodRM, NodRM-1, NodRM-3. Когда они являются ацетилированными (R=CH₃CO-), они становятся AcNodRM-1 и AcNodRM-3, соответственно (патент США 5545718).

LCO из Bradyrhizobium japonicum описаны в патентах США 5175149 и 5321011. В общем, они представляют собой пентасахаридные фитогормоны, содержащие метилфукозу. Описан ряд этих происходящих из B. japonicum LCO: BjNod-V (C_18:1); BjNod-V (A_C, C_18:1), BjNod-V (C_16:1); и BjNod-V (A_C, C_16:0), где "V" указывает на присутствие пяти N-ацетилглюкозаминов; "Ac" обозначает ацетилирование; число после "C" указывает на количество атомов углерода в боковой цепи жирной кислоты; и число после ":" обозначает количество двойных связей.

LCO, используемые в композициях по изобретению, можно получать (т.е. выделять и/или очищать) из штаммов бактерий, которые продуцируют LCO, таких как штаммы Azorhizobium, Bradyrhizobium (включая B. japonicum), Mesorhizobium, Rhizobium (включая R. leguminosarum), Sinorhizobium (включая S. meliloti), и штаммы бактерий, модифицированные способами генетической инженерии так, чтобы они продуцировали LCO.

Также настоящее изобретение охватывает композиции, в которых используются LCO, полученные (т.е. выделенные и/или очищенные) из микоризного гриба, такого как грибы группы Glomerocycota, например, Glomus intraradicus. Структуры репрезентативных LCO, получаемых из этих грибов, описаны в WO 2010/049751 и WO 2010/049751 (LCO, описанные в них, также называют "факторами Myc").

Кроме того, композиции по настоящему изобретению охватывают применение синтетических соединений LCO, таких как соединения, описанные в WO 2005/063784, и рекомбинантных LCO, полученных способами генетической инженерии. Основная встречающаяся в природе структура LCO может содержать модификации или замены, встречающиеся во встречающихся в природе LCO, такие как модификации и замены, описанные в Spaink, Crit. Rev. Plant Sci. 54:257-288 (2000) и D'Haeze, et al., Glycobiology 12:79R-105R (2002). Олигосахаридные молекулы-предшественники (CO, которые, как описано ниже, также пригодны в качестве сигнальных молекул растений согласно настоящему изобретению) для конструирования LCO также могут синтезироваться модифицированными способами генетической инженерии организмами, например, как описано в Samain, et al., Carb. Res. 302:35-42 (1997); Samain, et al., J. Biotechnol. 72:33-47 (1999).

LCO можно использовать в различных формах в отношении чистоты и их можно использовать отдельно или в форме культуры продуцирующих LCO бактерий или грибов. Способы предоставления по существу чистых LCO включают простое удаление клеток микроорганизмов из смеси LCO и микроорганизмов, или с последующим выделением или очисткой молекул LCO посредством разделения фаз растворителей LCO с последующей хроматографией ВЭЖХ, как описано, например, в патенте США 5549718. Очистку можно улучшать путем повторения ВЭЖХ, и очищенные молекулы LCO можно сушить сублимационной сушкой для длительного хранения.

Хитоолигосахариды (CO) известны в данной области как связанные β-1-4-связями структуры N-ацетилглюкозамина, идентифицированные в качестве хитиновых олигомеров, а также в качестве N-ацетилхитоолигосахаридов. CO имеют уникальные и отличающиеся конструкции боковых цепей, которые делают их отличающимися от молекул хитина [(C₈H₁₃NO₅)n, CAS № 1398-61-4], и молекул хитозана [(C₅H₁₁NO₄)n, CAS № 9012-76-4]. Репрезентативные источники литературы, в которых описана структура и получение CO, являются следующими: Van der Holst, et al., Current Opinion in Structural Biology, 11:608-616 (2001); Robina, et al., Tetrahedron 58:521-530 (2002); Hanel, et al., Planta 232:787-806 (2010); Rouge, et al. Chapter 27, "The Molecular Immunology of Complex Carbohydrates", Advances in Experimental Medicine and Biology, Springer Science; Wan, et al., Plant Cell 21:1053-69 (2009); PCT/F100/00803 (9/21/2000); и Demont-Caulet, et al., Plant Physiol. 120(1):83-92 (1999). CO могут быть синтетическими или рекомбинантными. Способы получения рекомбинантных CO известны в данной области. См., например, Samain, et al. (выше); Cottaz, et al., Meth. Eng. 7(4):311-7 (2005) и Samain, et al., J. Biotechnol. 72:33-47 (1999).

Композиции по настоящему изобретению также могут включать хитиновые соединения (отличные от CO), флавоноиды, жасмоновую кислоту, линолеиновую кислоту и линоленовую кислоту и их производные и каррикины.

Хитины и хитозаны, которые являются главными компонентами клеточных стенок грибов и экзоскелетов насекомых и ракообразных, также состоят из остатков GlcNAc. Хитиновые соединения включают хитин, (IUPAC: N-[5-[[3-ацетиламино-4,5-дигидрокси-6-(гидроксиметил)оксан-2-ил]метоксиметил]-2-[[5-ацетиламино-4,6-дигидрокси-2-(гидроксиметил)оксан-3-ил]метоксиметил]-4-гидрокси-6-(гидроксиметил)оксан-3-ил]этанамид) и хитозан (IUPAC: 5-амино-6-[5-амино-6-[5-амино-4,6-дигидрокси-2(гидроксиметил)оксан-3-ил]окси-4-гидрокси-2-(гидроксиметил)оксан-3-ил]окси-2-(гидроксиметил)оксан-3,4-диол). Эти соединения можно получать из коммерческих источников, например, от Sigma-Aldrich, или получать из насекомых, панциря ракообразных или клеточных стенок грибов. Способы получения хитина и хитозана известны в данной области и описаны, например, в патенте США 4536207 (получение из панцирей ракообразных), Pochanavanich, et al., Lett. Appl. Microbiol. 35:17-21 (2002) (получение из клеточных стенок грибов) и патенте США 5965545 (получение из панцирей крабов и гидролиз коммерческого хитозана). Можно получать деацетилированные хитины и хитозаны, которые имеют диапазон ацетилирования от менее чем 35% до более чем 90%, и охватывают широкий спектр молекулярных масс, например, низкомолекулярные олигомеры хитозана массой менее 15 кДа и олигомеры хитина массой от 0,5 до 2 кДа; хитозан "практической категории" с молекулярной массой приблизительно 15 кДа; и высокомолекулярный хитозан массой вплоть до 70 кДа. Также являются коммерчески доступными композиции хитина и хитозана, составленные для обработки семян. Коммерческие продукты включают, например, ELEXA® (Plant Defense Boosters, Inc.) и BEYOND^TM (Agrihouse, Inc.).

Флавоноиды представляют собой фенольные соединения, имеющие общую структуру из двух ароматических колец, связанных мостиком из трех атомов углерода. Флавоноиды продуцируются растениями и имеют множество функций, например, в качестве полезных сигнальных молекул, и в качестве защиты от насекомых, животных, грибов и бактерий. Классы флавоноидов включают халконы, антоцианидины, кумарины, флавоны, флаванолы, флавонолы, флаваноны и изофлавоны. См. Jain, et al., J. Plant Biochem. & Biotechnol. 11:1-10 (2002); Shaw, et al., Environmental Microbiol. 11:1867-80 (2006).

Репрезентативные флавоноиды, которые могут быть пригодными в композициях по настоящему изобретению, включают генистеин, даидз