Способ получения препарата на основе стволовых клеток, выделенных из ткани селезенки свиней, для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных

Способ получения препарата на основе стволовых клеток, выделенных из ткани селезенки свиней, для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области клеточной биотехнологии и фармакологии и касается способа получения препарата на основе стволовых клеток для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных, а также способа выделения культуры стволовых клеток из селезенки свиней. Изобретение может найти применение в ветеринарии для лечения и профилактики широкого спектра заболеваний домашних и сельскохозяйственных животных.

В настоящее время легочные и желудочно-кишечные заболевания сельскохозяйственных животных, имеющие повсеместное распространение и наносящие значительный ущерб, складывающийся из большого отхода и снижения веса молодняка сельскохозяйственных животных, пополнились рядом других серьезных заболеваний животных: дисплазией суставов у собак и кошек, микроспорией, трихофитией и другими грибковыми заболеваниями, маститами, эндометритами сельскохозяйственных и домашних животных, офтальмологическими заболеваниями, патологией сердечно-сосудистой системы и др.

Среди известных в ветеринарной медицине препаратов сложно найти средство, которое одновременно являлось бы лечебным и стимулирующим продуктивность животных.

Известные препараты для лечения респираторных и желудочно-кишечных инфекций сельскохозяйственных животных бактериальной этиологии (патент №2053772, RU; патент №2214821, RU), а также вирусной этиологии (патент РФ №2286171, Кл. A61K 38/43, A61K 31/65, A61K 31/198, A61K 47/34, А61Р 31/12, А61Р 31/04, А61Р 11/00, А61Р 1/00, 2005, прототип), включающий водный раствор полиэтиленгликоля, водный раствор поливинилпирролидона, коммерческий раствор Версена, раствор тетрациклина и коммерческий раствор трипсина при следующем соотношении компонентов, об.%:

15-20%-ный водный раствор полиэтиленгликоля
(ММ 2000-6000). (ПЭГ)	10-15
15-20%-ный водный раствор поливинилпирролидона
(ММ 280000-360000), (ПВП)	10-20
0,01-0,02%-ный коммерческий раствор Версена	10-15
8-10%-ный водный раствор тетрациклина	10-15
0,20-0,25%-ный коммерческий
раствор трипсина (100-128 ЕД)	Остальное

оказались неэффективными для лечения таких заболеваний животных, как дисплазия суставов у собак и кошек, микроспория, трихофития и других грибковых заболеваниями, маститами, эндометритов сельскохозяйственных и домашних животных, офтальмологических заболеваний, патологии сердечно-сосудистой, дыхательной, пищеварительной систем и др. болезней.

Стимуляторы продуктивности сельскохозяйственных животных не имеют широкого распространения по целому ряду причин, в том числе по причине невозможности использования данных фармакологических средств в массовом порядке и при многократном применении.

В настоящее время в современной ветеринарной биомедицине формируется новый раздел - «клеточная терапия», которая позволяет с помощью трансплантации клеток восполнить недостаточную функциональную активность тканей и регенерировать поврежденные органы. Функцию обновления и восстановления тканей in vivo выполняют стволовые клетки, которые представляют собой пул запасных недифференцированных предшественников клеток различных типов. В связи с этим применение стволовых клеток является наиболее перспективным направлением клеточной терапии, и наибольшую актуальность приобретают работы по выделению стволовых клеток из тканей человека и животных.

Выделены различные типы стволовых клеток взрослого организма - гематопоэтические (предшественники клеток крови), нейрональные (предшественники клеток нервной ткани), мезенхимальные (клетки, способные дифференцироваться в клетки тканей мезенхимального происхождения, а также других зародышевых листков) и др.

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) отличаются относительной простотой выделения и культивирования, способностью пролиферировать в течение долгого времени in vitro и широким спектром дифференцировки. В связи с этим особое внимание уделяется способам изоляции МСК из тканей взрослого организма, однако универсального метода их получения до сих пор нет.

Известен способ получения биотрансплантанта для лечения остепороза (патент РФ №2265442, кл. А61К 35/28, 2004), состоящего из клеток МСК. В процессе получения МСК осуществляют ферментативную дезагрегацию, фильтрацию через мелкоячеистое сито, центрифугирование в солевом растворе Хенкса, ресуспендирование в ростовой среде ДМЕМ/F12, содержащий 15% эмбриональной телячьей сыворотки и глутамин Посев осуществляют на пластиковые чашки Петри при удалении через 1 сутки неприкрепившихся клеток. Инкубирование проводят при 37°C в атмосфере 5% СО₂ с последующей трипсинизацией и пересевом культуры. В результате нескольких пересевов получают культуру клеток МСК с преимущественной способностью к остеогенной дифференцировке, но эта культура является гетерогенной клеточной популяцией, не охарактеризованной фенотипированием.

Известен способ выделения мезенхимальных стволовых клеток (патент РФ №2252252, кл. C12N 5/08, 2004) из ткани человека, и может быть использован для лечения широкого круга заболеваний. Мезенхимальные стволовые клетки человека выделяют из жировой ткани, децидуальной или амниотической оболочки плаценты, или хориональной стромы плаценты. Ткани человека измельчают и обрабатывают раствором коллагеназы в среде Игла в модификации Дюльбекко, при этом жировую ткань, децидуальную или амниотическую оболочку плаценты обрабатывают коллагеназой типа I, а хориальную строму плаценты - коллагеназой типа IV. Затем полученную суспензию очищают от эритроцитов с помощью лизирующего раствора с последующей последовательной фильтрацией через фильтры с размером пор 100 и 10 мкм.

Известен способ выделения мезенхимальных стволовых клеток из тканей человека (патент РФ №2280462, кл. А61К 35/55, 2004), включающий измельчение и ферментативную обработку тканей раствором коллагеназы в среде Игла в модификации Дюльбекко, очистку от эритроцитов с помощью лизирующего раствора с последующей фильтрацией полученной суспензии. В качестве тканей человека используют тимус, для ферментативной обработки используют коллагеназу типа II, а фильтрацию проводят последовательно через фильтры с размером пор 100 и 10 мкм.

Известен способ получения МСК для имплантации с целью направленной остеорегенерации (патент РФ №2210352, кл. А61К 6/00, C12N 5/08, 2001), включающий выделение МСК путем дезагрегации ткани-источника МСК с последующим ресуспендированием суспензии и культивированием на ростовой среде.

Стволовые клетки и их использование в лечении многих заболеваний у человека на сегодняшний день является неоспоримым фактом. Уникальные свойства стволовых клеток дают возможность применять их при самых разных патологических процессах, на разных стадиях и лечить трудноизлечимые болезни. Путем трансплантации стволовых клеток лечат остеопороз (Патент РФ №2265442, RU), аллергические заболевания (Патент №2250773, RU), паркинсонизм (Патент №2259836, RU), травму головного мозга (Патент РФ №2216336, RU), онкологические заболевания (Патент №2257219, RU) и иные болезни.

В настоящее время ряд серьезных ветеринарных клиник мира с успехом используют подобные технологии в лечении заболеваний у животных. Наиболее распространенными проблемами являются артрозы у собак, травматические и дегенеративные заболевания спинного мозга, которые вызывают параличи у собак и кошек.

Задача, решаемая данным изобретением, заключается в создании препарата на основе стволовых клеток для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных с расширенным спектром его применения в лечении, а также в реализации потенциальных возможностей препарата для восстановления структуры утраченных органов и тканей домашних и сельскохозяйственных животных, стимулирование их продуктивности.

Технический результат заключается в расширении группы препаратов на основе стволовых клеток для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных, а также в значительном стимулировании молочной продуктивности крупного рогатого скота, появлении возможностей и способов для реконструктивной клеточной терапии при патологии органов и тканей животных, возникших в результате инфекционных и других заболеваний.

Поставленная в изобретении задача решена тем, что в способе получения препарата на основе стволовых клеток, выделенных из ткани селезенки свиней, для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных, в состав которого входят водный раствор полиэтиленгликоля, водный раствор поливинилпирролидона, коммерческий раствор Версена, раствор тетрациклина и коммерческий раствор трипсина при следующем соотношении компонентов, об.%:

15-20%-ный водный раствор полиэтиленгликоля
(ММ 2000-6000). (ПЭГ)	10-15
15-20%-ный водный раствор поливинилпирролидона
(ММ 280000-360000), (ПВП)	10-20
0,01-0,02%-ный коммерческий раствор Версена	10-15
8-10%-ный водный раствор тетрациклина	10-15
0,20-0,25%-ный коммерческий
раствор трипсина (100-128 ЕД)	Остальное

известный состав вводят в клеточно-культуральную среду, полученную из ткани селезенки свиней. Измельченную ткань селезенки подвергают антисептической обработке 0,5%-ным раствором метронидазола и последующей обработке 0,05%-ным раствором хлоргексина с последующими дезагрегацией ткани селезенки 0,25%-ным раствором трипсина и культивированием клеточного материала с конечной концентрацией клеток 1,5⋅10⁶-2,0⋅10⁶ на 1 мл на ростовой среде Игла-МЕМ с добавлением 10-15% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота в присутствии стимулятора роста клеточных культур Пинексида, состоящего из 9 частей питуитрина и 1 части диметилсульфоксида. Соотношение компонентов: известный препарат и клеточно-культуральная среда 5-5,5:1.

В ходе разработки способа получения препарата на основе стволовых клеток для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных были проведены исследования по выбору:

1) источника стволовых клеток, который играет определенную роль в последующем использовании клеток при лечении больных («Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток», А.Г. Румянцев, А.А. Масчан. - Медицинское информационное агентство. М. - 2003 г. - 912 с.). Различные источники МСК подразумевают и разную обработку исходного биоматериала. Условия выделения МСК для дальнейшего культивирования и условия наработки нужной клеточной массы зависят от состава культуральной среды, условий посева и культивирования, посуды и др. Наилучшим материалом для наработки трансплантантных МСК является фетальный материал, т.к. клетки обладают выраженной способностью к дифференцировке, более активны функционально, обладают большим потенциалом пролиферации и роста, продуцируют факторы регенерации и роста; при пересадке они стимулируют ангиогенез. Остальные клетки лучше переносят гипоксию. Однако использование фетальных клеток связано с этическими проблемами и с труднодоступностью исходного материала.

В настоящем изобретении в качестве ткани-источника выбрана селезенка свиней, так как обладает большей клеточной массой для получения стволовых клеток и является убойным материалом в свиноводстве;

2) учитывая, что в работе с МСК используют традиционные методики работы с клетками (Культура животных клеток. Методы. Под ред. Р. Фрешни. М.: Мир. 1989 г.), в каждом случае подбирая индивидуальную последовательность действий, условия выделения и наработки клеточной массы, в настоящем изобретении разработан способ выделения стволовых клеток из селезенки свиней, который включает следующие операции:

- механическое измельчение ткани - источника стволовых клеток, в качестве которой используют селезенку свиньи, путем нарезания на мелкие фрагменты объемом 0,2-0,5 мм³,

- антисептическую обработку измельченной ткани селезенки путем промывки на Шуттель-аппарате в течение 2-4 часов при комнатной температуре в 0,5%-ном растворе метронидазола в соотношении, масс. 1:3 соответственно, с последующим удалением отработанного материала и промывкой на Шуттель-аппарате в течение 6-8 часов при комнатной температуре в 0,05%-ном растворе хлоргексина в соотношении, масс. 1:3 соответственно, с последующим удалением отработанного материала;

- дезагрегацию измельченной ткани селезенки путем обработки ферментами - 0,25%-ным раствором трипсина 37°C в соотношении, масс. 1:3, на магнитной мешалке в условиях термостата при температуре 37°C в течение 15-20 мин с последующим отделением надосадочной жидкости путем слива ее в стерильную емкость; данную операцию повторяют трижды, каждый раз сливая надосадочную жидкость в ту же стерильную емкость; по окончании обработки измельченной ткани селезенки ферментами, отработанный материал удаляют в отход, а клеточный материал с концентрацией клеток 1,5⋅10⁶-2,0⋅10⁶/мл помещают в стерильный культуральный сосуд;

- культивирование клеток из клеточного материала с концентрацией клеток 1,5⋅10⁶-2,0⋅10⁶/мл среды для роста стволовых клеток Игла-MEM с добавлением 10-15% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота в присутствии стимулятора роста клеточных культур Пинексида, состоящего из 9 частей питуитрина и 1 части диметилсульфоксида, в соотношении компонентов, масс. 1:3:0,45 соответственно; культивирование стволовых клеток осуществляют при температуре 37°C в течение 48-72 часов в стерильном культуральном сосуде, помещенном в термостат.

Через 48-72 часа клеточно-культуральную среду сливают в стерильную емкость. Стволовые клетки могут использоваться во многих целях, в частности для приготовления препарата для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных. С этой целью в полученную клеточно-культуральную среду вводят известный препарат под названием «Повин-ВМ» (препарат для профилактики и лечения респираторных и желудочно-кишечных инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной этиологии сельскохозяйственных животных, патент №2286171, RU, прототип), в соотношении, масс. 1:5-7 соответственно, при котором конечная концентрация клеточно-культуральной среды составляет 18-20%.

В результате получают новый препарат на основе стволовых клеток для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных.

Выбор концентрации клеточно-культуральной среды в 18-20% обусловлен следующим. Низкая концентрация ростовых факторов, выделяемых стволовыми клетками, в полученном препарате (меньше 18%) требует длительного лечения, что клинически и экономически неэффективно. Высокая концентрация ростовых факторов в препарате (больше 20%) вызывает аллергические реакции по месту применения, очаговые реакции в виде припуханий, покраснений, образование отеков. Возможны общие реакции в виде повышения температуры тела, отказа от корма и воды и др. признаков клинической депрессии физиологических функций.

Полученный заявленным способом препарат на основе стволовых клеток для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных является уникальным, сочетающим в себе компоненты клеточных фракций, антисептических соединений, полимерных соединений, и обладает высокой лечебной эффективностью, подтвержденной научными и клиническими исследованиями. Препарат безопасен в применения в клинике и на производстве, что также подтверждено клиническими исследованиями. Поскольку препарат представляет готовую лекарственную форму, он удобен и прост в применении.

Благодаря дополнению известного препарата по пат. №2286171, RU клеточно-культуральной средой новый препарат обладает гораздо большей эффективностью и расширенным спектром его применения. Кроме того, заявленный препарат обладает:

- мощным регенеративным потенциалом, проявляющимся в условиях раневого процесса, оптимизирует заживление раневого процесса; стимулирует репарации сухожилий, связок, раневых дефектов, ускоряет восстановление кожных покровов после ожогов большой площади;

- остеоиндуктивными свойствами (ускорение заживления переломов) и создает условия успешного репаративного остеогенеза при прогрессирующей резорбции (уменьшении) костной ткани;

- иммуностимулирующим и противовоспалительными свойствами, устраняет инфекционные очаги в мягких тканях и органах, обеспечивает длительную ремиссию и профилактику обострений.

Препарат нашел применение в ветеринарной медицине в следующих ее областях:

1. Акушерство и гинекология:

- профилактика и лечение маститов;

- лечение эндометритов;

- стимуляция рефлексов овуляции (течка, охота у коров);

- повышение надоев молока у лактирующих коров;

- лечение послеродовых осложнений (эклампсии, парезы).

2. Ветеринарная ортопедия:

- лечение дисплазии суставов;

- лечение переломов, ушибов, трещин костей;

- лечение разрывов связок и тендовагинитов;

- лечение бурситов;

- лечение папиллом на коже;

- лечение микозов.

3. Незаразные болезни:

- лечение ран, трофических язв, свищей;

- стимуляция заживления ран в послеоперационный период;

- лечение стоматитов.

4. Инфекционные заболевания:

- вирусный (инфекционный) перитонит у кошек;

- лейкозы у собак;

- гнойные раны у животных.

5. Реконструктивная ветеринарная медицина:

- восстановление анатомической целостности органов (лечение монорхизма у котов);

- удлинение культи ампутированной конечности у собак.

Выше изложенное говорит о большой сфере применения данного аппарата и иллюстрируется многочисленными примерами конкретного применения аппарата для лечения и профилактики инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных, что, несомненно, подтверждает расширенный спектр применения созданного препарата в лечении, а также в реализации потенциальных возможностей препарата для восстановления структуры утраченных органов и тканей домашних и сельскохозяйственных животных.

Заявленный препарат расширяет группу препаратов на основе стволовых клеток для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных. Это дает возможность значительно снизить ущерб от большого отхода и снижения веса молодняка сельскохозяйственных животных в результате инфекционных, вирусных и множества других заболеваний. Оптимальное сочетание результатов применения препарата и экономической целесообразности - перспектива для внедрения данного препарата в ветеринарную медицину.

Изобретение иллюстрируется чертежами.

На фиг. 1 изображена схема, поясняющая заявленный способ получения препарата на основе стволовых клеток для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных; на фиг. 2 показан прирост массы тела кроликов, инъецированных заявленным препаратом, за сутки, в сравнении с приростом массы тела кроликов, не инъецированных заявленным препаратом, за сутки; на фиг. 3 - то же, для крольчат Калифорнийской породы; на фиг. 4 - фиг. 7 изображен клинический случай лечения гнойного миозита у коровы на производстве с помощью заявленного лекарственного средства (пример 23).

В описании раскрыт лучший способ осуществления заявленного изобретения.

Пример конкретного выполнения способа получения препарата на основе стволовых клеток для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных.

Препарат получен и испытан в инновационной ветеринарной клинике Тверской ГСХА.

Способ получения препарата на основе стволовых клеток для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней домашних и сельскохозяйственных животных осуществляют следующим образом.

Полученную селезенку свиньи массой 80 граммов подвергают механическому измельчению путем нарезания на мелкие фрагменты объемом 0,2-0,5 мм³, после чего проводят антисептическую обработку измельченной ткани селезенки. Для этого измельченную селезенку промывают на Шуттель-аппарате в течение 2-4 часов при комнатной температуре 240 мл 0,5%-ного раствора метронидазола, отработанный раствор метронидазола удаляют путем слива и затем осуществляют последующую промывку измельченной селезенки на Шуттель-аппарате в течение 6-8 часов при комнатной температуре 240 мл 0,05%-ного раствора хлоргексина с последующим его удалением. Прошедший промывку клеточный материал обрабатывают ферментом, который ослабляет или разрушает связи между клетками. Дезагрегацию измельченной ткани селезенки проводят обработкой 240 мл 0,25%-ного раствора трипсина на магнитной мешалке в условиях термостата при температуре 37°С в течение 15-20 мин

Стадия дезагрегации обычно дает взвесь или суспензию агрегированных клеток и жидкой фракции, содержащей обычно свободные стромальные клетки (например, эритроциты, гладкомышечные клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты и стволовые клетки). Следующая стадия в способе отделения заключается в отделении агрегированных клеток от стромальных клеток.

После обработки измельченной ткани селезенки трипсином на магнитной мешалке в условиях термостата при температуре 37°С в течение 15-20 мин, надосадочную жидкость удаляю путем слива ее в стерильную емкость; данную операцию (дезагрегацию трипсином и слив надосадочной жидкости) повторяют трижды, каждый раз сливая надосадочную жидкость в одну и ту же стерильную емкость.

Обычными методами, например, с использованием красителя метилфиолетового, подсчитывают число ядросодержащих клеток селезенки в суспензии и разбавляют ростовую среду до концентрации, обеспечивающей содержание 1,5⋅10⁶-2,0⋅10⁶ ядросодержащих клеток в 1 мл ростовой среды.

В качестве ростовой среды используют среду Игла-MEM с добавлением 10-15% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, предварительно обработанной ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 244-264 нм, мощностью излучателя 30 Вт в течение 30-60 минут; для получения данной сыворотки ее размещают на расстоянии 15-20 см от источника излучения и наливают тонким слоем 0,8-1,0 см в стерильную чашку Петри, после чего ее вносят в суспензию стволовых клеток на среде Игла-MEM до конечной концентрации сыворотки 10-15%., и стимулятор роста клеточных культур Пинексид, состоящий из 9 частей питуитрина и 1 части диметилсульфоксида. Соотношение компонентов, масс. 1:3:0,45 соответственно.

Культивирование проводят в таком культуральном сосуде, как пластиковая матра емкостью 1,5 л. Культуральный сосуд помещают в термостат и в течение 48-72 часов при температуре 37°С осуществляют культивирование стволовых клеток селезенки свиньи.

Данная технология выделения стволовых клеток имеет непосредственную связь с исходным материалом, особенности которого диктуют выбор количества операций, параметры и условия их проведения.

В полученную клеточно-культуральную среду вводят известный препарат под названием «Повин-ВМ» (препарат для профилактики и лечения респираторных и желудочно-кишечных инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной этиологии сельскохозяйственных животных, патент №2286171, RU, прототип), в соотношении, масс. 1:5-5,5 соответственно, в результате конечная концентрация клеточно-культуральной среды составляет 18-20%.

Лечебный и профилактический эффект подтвержден результатами апробации заявляемого препарата в клинике и на производстве, приведенными в примерах конкретного применения.

Лечение и профилактика широкого спектра заболеваний животных, а так же реконструкция пораженных органов и тканей за короткий промежуток времени осуществляется в инновационной ветеринарной клинике Тверской ГСХА, в ветеринарных клиниках Тверской и Московской областей, где используются эксклюзивные методы восстановительной терапии с применением стволовых клеток.

Пример 1. В октябре 2012 года в инновационную ветеринарную клинику Тверской ГСХА поступил кот с клиническими признаками монорхизма (по данным УЗИ). В мошонку 1 раз в 7 дней вводили препарат в дозе 0,3-0,5 мл на одно введение. Через 8 инъекций препарата в мошонке появился второй семенник (по данным УЗИ).

Пример 2. В феврале 2014 года в инновационную ветеринарную клинику Тверской ГСХА поступил на лечение французский дог с клиникой дисплазии тазобедренных суставов. Отмечены нарушения походки, хромота, боли, бурсит, тендовагинит левых тазобедренного и локтевого сустава. Проводили внутрикожное обкалывание вдоль позвоночника в районе тазобедренного и локтевого сустава, околосуставных областей в дозе 0,2-0,4 мл на точку введения 1 раз в 7-14 дней в течение 4 месяцев. В результате лечения хромота и боли прекратились.

Пример 3. В марте 2014 года в инновационную ветеринарную клинику Тверской ГСХА поступила собака породы Шелти (мини Колли), у которой удалена нижняя треть левой задней конечности. В культю вводили препарат: 0,2-0,4 мл, 1 раз в 7-14 дней. После каждой инъекции культя вырастала на 1,7-2 см. При пальпации отмечена прочная хрящевая ткань. Собака, ранее перемещавшаяся на трех ногах, стала опираться на выросшую культю левой конечности.

Пример 4. В июне 2014 года в инновационную ветеринарную клинику Тверской ГСХА поступила кошка с клиникой инфекционного (вирусный) перитонита. Внутрикожное применение препарата вдоль позвоночника над областью печени на точку введения 0,2-0,3 мл и брюшной полости в дозе 2-3 мл препарата привело к полному выздоровлению.

Пример 5. В апреле 2014 года в инновационную ветеринарную клинику Тверской ГСХА поступила собака породы Восточно-европейская овчарка с клиникой микроспории. В очаг повреждения внутрикожно вводили препарат в дозе 0,2-0,4 мл на одну точку введения однократно или несколько раз. Отмечено быстрое восстановление очага: исчезли корки, появился рост волос.

Пример 6. В мае 2013 года в инновационную ветеринарную клинику Тверской ГСХА поступила собака породы Той-терьер с деформацией грудной клетки.

Показания к лечению:

- болезненность в области грудной клетки;

- две папилломы (одна на задней правой лапе, другая на спине);

Также отсутствовал передний резец (он выпал в возрасте 2 лет).

Лечение:

Курс терапии предлагаемым препаратом внутрикожно в дозе 0,2 мл на точку введения 1 раз в 7 дней в течение 1,5 месяцев вдоль позвоночника.

Результаты:

- боль в грудине уменьшилась, а через 2 месяца собака не испытывала боли при нажатии на грудину.

- папилломы исчезли через месяц после инъекций.

Через полгода после лечения неожиданно вырос новый зуб.

Результаты применения препарата для лечения маститов у коров и иммунной стимуляции молодняка в ООО «Орехово-Зуево-молоко» Орехово-зуевского района Московской области.

Пример 7. В марте 2013 года препарат был апробирован в ООО «Орехово-Зуево-молоко» Орехово-зуевского района Московской области. Всего обработано 40 голов. Выписано из маститной группы после полного выздоровления 22 головы. Из них:

- после однократного применения препарата - 12 голов;

- после двукратного применения - 7 голов;

- после трехкратного применения - 2 головы;

- после четырехкратного применения - 1 голова;

- на запуск - 1 голова.

Рецидив - 1 голова. Выбыло - 2 головы.

Пример 8. В марте 2013 года препарат был апробирован в ООО «Орехово-Зуево-молоко» Орехово-зуевского района Московской области. Всего обработано 74 головы. Выписано из маститной группы после полного выздоровления - 37 голов. Из них:

- после однократного применения - 17 голов;

- после двукратного применения - 12 голов;

- после трехкратного применения - 4 головы;

- после четырехкратного применения - 2 головы;

- запуск - 2 головы

Рецидив - 3 головы. Выбыло - 1 голова

Этим препаратом обрабатывали не только с острыми формами мастита, но и «хроников». Самые лучшие результаты были поучены у коров с повышенной соматикой, кровью в молоке и катаральными формами мастита. Наблюдались случаи, когда полное выздоровление коровы наступало через 3-4 недели после последнего применения препарата без какого-либо дополнительного лечения.

Пример 9. Профилактика заболеваний телят Орехово-зуевского района Московской области. В апреле 2013 года препарат был апробирован в ООО «Орехово-Зуево-молоко» Орехово-зуевского района Московской области. Мы вводили препарат на второй день жизни теленка подкожно в предлопаточную область в дозе 1 мл. До применения препарата нашей основной проблемой было заболевание гастроэнтеритами телят на телятнике после перевода из родильного отделения. После начала применения количество телят с заболеванием гастроэнтерита сократилось вдвое, переносили заболевание гораздо легче и курс лечения сократился на 1-2 дня.

Результаты применения препарата на кроликах в ООО «Беж-Миакро», Бежецкого района Тверской области.

Пример 10. В сентябре 2014 года препарат был апробирован в ООО «Беж-Миакро», Бежецкого района Тверской области. Все кролики находились в одинаковых условиях. С учетом породы, пола, возраста, массы тела отобрали 16 кроликов, из которых сформировали 2 группы. Первая группа контрольная, вторая группа опытная. В опытной группе были крольчата больные с диагнозом «Ринит», «Конъюнктивит». Крольчатам второй группы ввели препарат внутримышечно, в заднюю часть бедра, в дозе 0,2-0,5 мл - однократно. Крольчатам контрольной группы препарат не водился, проводили вакцинации против миксоматоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, за это время обработали против эймериоза согласно плану противоэпизоотических мероприятий, не смотря на то, что крольчат обработали дважды Толукоксом 2,5% согласно наставлении появлялись клинические признаки эймериоза. Заболевания и падежа среди инъецированных заявленным препаратом кроликов не отмечалось. В течение первой недели клинические признаки ринита и конъюнктивита прекратились.

Таким образом, можно сделать заключение, что предлагаемый препарат:

- повышает сохранность крольчат после отъема 100%.

- увеличивает прирост живой массы.

- профилактирует болезни желудочно-кишечного тракта крольчат в период отъема и при смене комбикорма.

- повышает устойчивость крольчат на негативное влияние неблагоприятных, стрессовых факторов,

- активизирует рост и развитие крольчат.

- не специфическая профилактика и лечение инфекционных и инвазионных болезней.

- купирует воспалительный процесс.

Заявляемый препарат прост в применении, не оказывает побочных действий, не требует дополнительного применения антимикробного и противовоспалительных средств и кокцидиостатиков и будет целесообразен в комплексе со специфической профилактикой против ВГБК и миксоматоза кроликов.

За данным препаратом перспектива на будущее для получения экологически чистого мяса кроликов. Новорожденные крольчата растут очень быстро. Средняя живая масса 4,7-5,2 кг - крольчиха, 4,5-5 кг - кролик (фиг. 2 и фиг. 3).

Результаты применения препарата в Кашинской станции по борьбе с болезнями животных.

Пример 11. В мае 2014 года в деревне «Бузыково», ЛПХ Графова К.Н. был апробирован препарат при патологии репродуктивных органов молочной железы. Корова «Роза» возраст 12 лет №32. Животное обладает хорошей молочной продуктивностью, однако приходило в охоту и успешно крылось 1 раз в год, последний отел - весна 2013 года. Соответственно период лактации составлял не 300 дней а около двух лет. В течение этого времени молочная продуктивность снижалась, однако оставалась на приемлемом для владельцев уровне. В 29.05 и 05.06.2014 года двукратно, в пять точек (затылочная область одно введение и по 2 введения в предлопаточную и поясничную области отступая на 2 см от остистых отростков), вводили исследуемый препарат. Введение осуществлялось подкожно т.к. внутри кожное ведение в дозе 0,5 мл в пять точек достаточно болезненно для коровы и соответственно настороженно встречается владельцами, животных. Животное пришло в охоту через 5 суток после первого введения. До этого признаки охоты отмечались 6 месяцев назад. Суточный удой на дату первого введения составлял 18 литров. Через 3-е суток объем молока начал увеличиваться и через неделю после второго введения достиг 25-26 литров. Против 18-и на день первого введения. Молочная продуктивность держалась на высоком уровне до середины сентября.

Пример 12. В августе 2014 года в деревне «Первомайское», Крууз И.В. был апробирован препарат при патологии вымени и репродуктивных органов. Корова «Катя» №75 возраст 14 лет, удой 6 литров. С весны отмечалось ухудшение аппетита, шаткость походки, животное стало труднее выводить на привязь, т.к. до поля она ходила медленно с остановками. Препарат введен 08.08.14 г. в пять точек однократно, подкожно. Через 7 дней замечены признаки охоты. Животное водили к быку, однако после покрытия оплодотворения не произошло. Затем в течение недели отмечено улучшение аппетита, восстановилась походка, животное стало «резвиться», чего давно уже не было. Молочная продуктивность не возросла, однако восстановилась регулярная овуляция (1 раз в 3 недели), до этого последний раз признаки охоты замечались весной. Животное стало набирать вес. В настоящее время лоб ка ухудшения здоровья коровы у владельцев нет.

Вывод: В указанных выше случаях наблюдается очевидная связь между введением препарата и восстановлением овуляции животных, улучшением общего физиологического состояния, повышением молочной продуктивности, или, как во втором случае, прекращением потери веса и восстановлением прежней упитанности коровы. Таким образом, полученный результат позволяет предположить возможность эффективного использования заявляемого препарата для продления срока службы дойных коров и для улучшения предубойного откорма выбракованных животных, Эффект, полученный после применения препарата 14-летней, весьма пожилой корове, позволяет предположить очень хорошее восстанавливающее действие данного препарата и у более молодых животных, перенесших серьезное заболевание (на практике лечение проводится комплексно, что затрудняет возможность отдать приоритет какому-либо лекарственному средству.

Результаты применения апробируемого препарата в Торопецкой станции по борьбе с болезнями животных.

Пример 13. В апреле 2014 года в Торопецкую СББЖ поступила собака породы Лайка с рваной раной на теле. Проведен курс лечения собаки заявленным препаратом в период с 06.04 по 19.04.2014 г.

При клиническом осмотре при первичном посещении было установлено, что у собаки в области правого предплечья оторван кожно-мышечный лоскут, который держится на участке кожи мышц шириной около 15 мм. Рана сильно загрязнена, имеются участки некроза, ихорозный запах. Рана получена 7-10 дней назад. Все это время собаки не было дома (убежала во время охоты). При хирургическом вмешательстве мышцы и кожу очистили, удалили некротизированные участки, и оторванный лоскут соединили с тканями предплечья с помощью швов. Сразу после наложения швов собаке инъецировали данный препарат в дозе 3 мл подкожно в области правой лопатки.

Через пять дней при осмотре раны было заметно, что с латеральной стороны шов сильно воспален, рана как бы раскрыта, хотя швы сохранены. Из раны выделяется серозный экссудат с элементами фибрина. Швы обработали антисептическими растворами и сделали вторую инъекцию исследуемым препаратом в той же дозировке. Через пять дней выявлено полное заживление, восстановление иннервации и кровоснабжения. Через несколько дней восстановленный лоскут не выделялся над поверхно