Косметическая композиция из жидкости, образующейся при вылуплении рыб из икры

Косметическая композиция из жидкости, образующейся при вылуплении рыб из икры

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способам получения композиции, содержащей полипептиды и/или части полипептидов, которую можно получить из жидкости, образующейся при вылуплении рыб из икры, и к различным способам применения указанной композиции на коже. В частности, композиции, содержащие указанные полипептиды и/или части полипептидов, подходят для лечения различных медицинских и косметических расстройств или состояний кожи.

Кожа является одним из наиболее уязвимых органов тела. Хотя кожные расстройства или патологические состояния редко опасны для жизни, они могут причинять дискомфорт и вызывать хроническую утрату трудоспособности. Кроме того, поскольку кожа находится на виду, расстройства и патологические состояния кожи могут приводить к психологическому стрессу. Следовательно, существует постоянная потребность в эффективных способах лечения патологических состояний и расстройств кожи.

Кожа образует самый большой орган тела, составляющий примерно 12-16 процентов массы тела человека. Она выполняет множество жизненно важных функций, выступая в качестве как барьера, так и регулятора между внешним миром и контролируемой средой в нашем организме.

Кожа состоит из 3 слоев, а именно из эпидермиса, дермы и подкожно-жировой клетчатки. Эпидермис представляет собой самый верхний, эпителиальный слой кожи. Он действует как физический барьер, предотвращающий потерю воды организмом и проникновение веществ и организмов в тело. Его толщина варьирует в зависимости от местоположения на теле.

Эпидермис состоит из многослойного чешуйчатого эпителия, т.е. состоит из слоев плоских клеток. Кожа, волосы и ногти кератинизированы, что означает, что они имеют мертвую твердую гидрофобную поверхность, состоящую из белка, называемого кератином. Эпидермис является непроницаемым благодаря тому, что он содержит внеклеточные липиды, связанные с кератиноцитами, особенно в среднем слое эпидермиса (блестящий слой). Слизистые оболочки (например, пищевода, полости рта, половых органов и другие) в основном некератинизированы и влажные. Эпидермис состоит из трех основных типов клеток, а именно из кератиноцитов (кожных клеток), меланоцитов (клеток, продуцирующих пигмент) и клеток Лангерганса (иммунных клеток). Клетки Меркеля представляют собой четвертые, менее распространенные, эпидермальные клетки.

Кератиноциты созревают и дифференцируются с накоплением кератина по мере их движения наружу. В итоге они отпадают или стираются. Они образуют четыре или пять различных слоев, которые, начиная с самого верхнего и заканчивая самым глубоким, представляют собой (i) Stratum corneum (роговой слой) с мертвыми, сухими жесткими клетками без ядер, (ii) Stratum granulosum (зернистый слой) с клетками, содержащими базофильные гранулы, и снаружи отделенными от рогового слоя тонким блестящим слоем, (iii) Stratum spinulosum (остистый, шиловидный или шиповатый клеточный слой), в котором клетки становятся все более и более плоскими по мере того, как они поднимаются вверх, и (iv) Stratum basale (базальный слой) с цилиндрическими (высокими) регенеративными клетками.

Непосредственно под эпидермисом располагается базальная мембрана, представляющая собой особую структуру, которая лежит между эпидермисом и дермой.

Дерма представляет собой волокнистую соединительную ткань, или поддерживающий слой кожи. Основными волокнами являются волокна коллагена и эластина, которые переплетены.

Подкожно-жировая клетчатка представляет собой жировой слой, расположенный непосредственно под дермой и эпидермисом. Ее также называют подкожной основой, гиподермой или подкожной клетчаткой. Подкожно-жировая клетчатка в основном состоит из жировых клеток (адипоцитов), нервов и кровеносных сосудов.

Новые эпителиальные клетки кожи образуются в нижнем слое кожи, в зернистом слое. Со временем клетки мигрируют к поверхности кожи и становятся более кислыми. Во время своего 30-дневного путешествия они умирают и насыщаются кератином. Кератин и связанные с ними липиды являются важными, так как они защищают кожу от внешних воздействий.

Болезни, травмы, экологические факторы, возраст, уровень гормонов, медикаментозное лечение, наносимые снаружи или поступающие с пищей вещества, генетические заболевания и множество других факторов может привести к нарушениям функции кожи, приводя к нарушению нормальной работы или аномалиям. Некоторые из этих нарушений или аномалий могут иметь чисто косметический характер, например, сухая кожа, морщины или измененная пигментация, или могут быть более серьезными, приводя к боли или дискомфорту, например, экзема и псориаз.

Сухая кожа является одним из наиболее распространенных кожных состояний или аномалий. Хотя некоторые люди более предрасположены к сухости кожи, указанное состояние может возникнуть у любого, независимо от возраста, пола или типа кожи.

Сухость кожи возникает когда внешний слой кожи (роговой слой с блестящим слоем) обедняется водой. Когда этот слой хорошо увлажнен, он сводит к минимуму потери воды через кожу и помогает препятствовать проникновению раздражающих веществ, аллергенов и микробов. Однако когда роговой слой высыхает, его защитные функции падают.Это приводит к большей потери воды, оставляя кожу уязвимой к действию факторов окружающей среды.

В нормальных условиях роговой слой имеет содержание воды от 10 до 30%. Эта вода придает коже мягкую, гладкую и гибкую текстуру. Вода поступает из атмосферы, нижележащих слоев кожи и пота. Жир, производимый кожными железами, и жировые вещества, производимые клетками кожи, действуют как природные увлажняющие средства, которые позволяют роговому слою удерживать воду.

Организм непрерывно теряет воду с поверхности кожи путем испарения. В нормальных условиях скорость потери невысокая, и вода замещается надлежащим образом. Характерные признаки и симптомы сухости кожи возникают тогда, когда потеря воды превышает замещение воды и содержание воды в роговом слое падает ниже 10%.

Крайне необходимы увлажняющие средства, которые улучшают или устраняют сухость кожи. Хотя в данной области техники известно много увлажняющих средств, все еще существует потребность в натуральных продуктах, которые эффективны и в тоже время деликатны.

Другая распространенная аномалия или патологическое состояние кожи представляет собой чрезмерное количество рогового слоя кожи. Это может происходить из-за недостаточного слущивания рогового слоя или из-за избыточного отложения кератина в роговом слое. Первое может иметь место тогда, когда естественный процесс слущивания кожи становится неравномерным, что придает коже сухой и грубый вид. Доброкачественные гиперпролиферативные расстройства включают эпидермолитический гиперкератоз (или растрескавшуюся кожу) и кератоз волосяного фолликула. Одним из распространенных доброкачественных гиперпролиферативных состояний является периферическая гипертрофия вокруг шрамов и/или формирование келоидных рубцов. Другими гиперпролиферативными состояниями являются мозоли, натоптыши, гиперкератозные бородавки (в частности, простые бородавки), ихтиозы и ладонно-подошвенные кератозы.

Современные методы лечения включают отшелушивание или в крайних случаях хирургию. Гиперкератоз обычно лечат путем смягчения рогового слоя и удаления утолщенной кожи.

Отшелушивание также можно применять для удаления поврежденных эпидермальных клеток, например эпидермальных клеток эпидермиса, проявляющего нарушение пигментации, например печеночные пятна.

Отшелушивание удаляет внешние слои эпидермиса, чтобы обнажить под ним новые клетки кожи. Отшелушивание можно осуществить при помощи физических средств (т.е. истирания кожи) или при помощи химических средств. Химические отшелушивающие средства включают скрабы, содержащие салициловую кислоту, гликолевую кислоту, фруктовые ферменты, лимонную кислоту или яблочную кислоту, и могут содержаться в высоких концентрациях в продуктах, применяемых дерматологамиов, или в более низких концентрациях в продуктах, продаваемых без рецепта. Химическое отшелушивание может включать применение продуктов, содержащих альфа-гидроксикислоты (АГК) или бета-гидроксикислоты (БГК), или ферментов, которые влияют на ослабление клееподобных веществ, которые удерживают клетки вместе в межклеточных контактах, что позволяет им легко удаляться. Данный тип отшелушивания рекомендуется для людей, проходящих лечение акне.

Самым большим недостатком отшелушивания является высокая цена некоторых продуктов и способов, применяемых для его достижения. Отшелушивание приводит к некоторому первоначальному покраснению кожи. Ближе к концу химического пилинга кожа немеет и имеет цвет, варьирующий от ярко-белого до серого на поверхности кожи. Таким образом, необходимы более эффективные способы, которые имеют более мягкое воздействие на кожу.

Следовательно, сохраняется потребность в средствах, подходящих для увлажнения кожи и/или для отшелушивания рогового слоя кожи.

Неожиданно было обнаружено, что некоторые полипептиды и пептиды (например, части полипептидов), обнаруженные в жидкости, образующейся при вылуплении рыб из икры, являются в высшей степени эффективными увлажняющими и отшелушивающими средствами. Вылупление эмбрионов яйцекладущих позвоночных организмов, например, рыб, амфибий, птиц и рептилий, облегчается благодаря различным ферментам, обычно известным как ферменты вылупления, которые способны частично или полностью разрушать белковые части яйцевой оболочки. Ооциты всех позвоночных имеют характерные внеклеточные оболочки, известные как желточные оболочки, яйцевые оболочки или хорион (применяется здесь взаимозаменяемо), которые состоят различных поперечно-сшитых полипептидов. Протеазы с различной специфичностью воздействуют на хорион для смягчения, разъедания и/или разрушения (т.е. распада) яйцевой оболочки и содействуют высвобождению эмбриона. Следовательно, жидкость, высвобождающаяся из яйца в процессе вылупления, и/или жидкость, в которой эмбрион вылупляется (т.е. жидкость, образующаяся при вылуплении), содержит множество полипептидов и частей полипептидов, т.е. продуктов распада.

Авторы настоящего изобретения установили, что конкретный состав ферментов вылупления и полипептидов яйцевой оболочки рыб, образующихся при разрушении яйцевой оболочки (в частности, части или фрагменты указанных полипептидов яйцевой оболочки), особенно подходит для увлажнения кожи и/или для отшелушивания рогового слоя кожи.

Вылупление эмбрионов достигается или облегчается, по меньшей мере частично, при помощи так называемых ферментов вылупления. Например, хориолизины рыб представляют собой типичные металлопротеиназы, обнаруживаемые в жидкости, образующейся при вылуплении. Хориолизины обычно находятся в двух формах, а именно, большой хориолитический фермент (хориолизин Н, НСЕ) и малый хориолитический фермент (хориолизин L, LCE), которые похожи по некоторым структурным и каталитическим характеристикам и принадлежат к семейству астацинов, но заметно отличается по предпочтению субстратов. Также были определены и охарактеризованы ферменты вылупления с другой каталитической активностью, например сериновые протеазы.

Без ограничения рамками какой-либо конкретной теории, в примерах показано, что композиции, содержащие комбинацию ферментов вылупления, как металлопротеиназы так и сериновой протеазы, и частей белков яйцевой оболочки из жидкости, образующейся при вылуплении Salmonidae, способны к увлажнению кожи и/или отшелушиванию рогового слоя кожи.

Жидкость, образующаяся при вылуплении других рыб, содержит полипептиды, которые функционально эквивалентны полипептидам, обнаруженных в жидкости, образующейся при вылуплении Salmonidae.

Полагают, что сочетание ферментов вылупления и продуктов распада полипептидов (например, полипептидов яйцевой оболочки и частей указанных полипептидов) в композициях, описанных в настоящей заявке, может взаимодействовать с различными типами белков, присутствующих в дерме и эпидермисе кожи. Полагают, что это уникальное сочетание полипептидов и частей полипептидов может иметь синергетическое действие, и что эти взаимодействия могут отвечать за действия композиции при лечении различных расстройств или состояний кожи.

В соответствии с его самым широким пониманием изобретение можно рассматривать как обеспечивающие композицию, получаемую из жидкости, образующейся при вылуплении рыб, согласно способу, описанному ниже. Указанная композиция содержит металлопротеиназу, сериновую протеазу и один или более полипептид яйцевой оболочки и/или части указанных полипептидов. В частности, композиция предназначена для лечения или для способов лечения различных аномалий, расстройств или состояний кожи, увлажнения и/или отшелушивания кожи, как описано ниже. Другими словами, композиция описанная в настоящей заявке, предназначена для лечения или для способов лечения состояний или расстройств, таких как сухость кожи, кожи, у которой роговой слой толще, чем требуется, например, при гиперкератозных состояниях, или кожи с нежелательной пигментацией на эпидермисе, например с печеночными, возрастными, солнечными или коричневыми пятнами. В особенно предпочтительном аспекте изобретение можно рассматривать как обеспечивающие композицию, получаемую из жидкости, образующейся при вылуплении, как описано в настоящей заявке, для обработки или для способов косметической обработки нормальной, но сухой кожи или утолщенной кожи (например, натоптышей, мозолей или гиперкератозных бородавок) или косметической обработки нарушений пигментации, таких как печеночные пятна. В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение можно рассматривать как обеспечивающие композицию, получаемую из жидкости, образующейся при вылуплении, как описано в настоящей заявке, для применения или для способов терапевтического лечения расстройств или состояний кожи, таких как акне, экзема, псориаз или бородавок, приводящих к боли. Композиция, упомянутая выше, также упоминается в настоящей заявке как «экстракт жидкости, образующейся при вылуплении». В дополнение к ферментам вылупления и полипептидам яйцевой оболочки и пептидам, указанный экстракт может содержать природные небелковые вещества.

Из раскрытия ниже будет очевидно, что композиция, получаемая из жидкости, образующейся при вылуплении рыб, как описано в настоящей заявке, может быть предложена в виде фармацевтической или косметической композиции, которая содержит один или более фармацевтически приемлемых наполнителей и/или разбавителей.

Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения фармацевтической или косметической композиции, как описано в настоящей заявке, из жидкости, образующейся при вылуплении рыб, включающий по меньшей мере следующие стадии:

а) суспендирование икры в минимальном объеме воды (например, эквивалентном объему икры или менее);

b) индукцию синхронизированного быстрого вылупления указанной икры, предпочтительно таким образом, что вылупление завершается в течение менее 6 часов для более чем 80% эмбрионов;

c) необязательно, фильтрацию икры, из которой вышли мальки, с получением жидкости, образующейся при вылуплении; и

d) фильтрацию жидкости, образующейся при вылуплении, со стадии b) или с) с получением композиции, при этом стадия фильтрации жидкости, образующейся при вылуплении, включает по меньшей мере следующие стадии:

(i) фильтрацию жидкости, образующейся при вылуплении, с применением фильтра с размером пор по меньшей мере 5 мкм, предпочтительно 5-15 мкм, и особенно предпочтительно с размером пор 7 мкм, и сбор фильтрата;

(ii) необязательно, фильтрацию фильтрата со стадии (i) с применением фильтра с размером пор 0,30-0,60 мкм, предпочтительно с размером пор 0,35-0,55 мкм, особенно предпочтительно 0,40-0,50 мкм, наиболее предпочтительно 0,45 мкм, и сбор фильтрата;

(iii) обработку фильтрата со стадии (i) или (ii) посредством ионообменной хроматографии, включающей:

(1) загрузку фильтрата на ионообменную колонку, такую как ДЭАЭ (диэтиламиноэтильную) колонку;

(2) промывку колонки подходящим буфером, например, забуференным промывочным раствором с pH 7-9, например, содержащим 20 мМ Трис-HCl, pH 8,5;

(3) элюирование полипептидов с колонки (в частности лейколектиновых полипептидов) с применением первого элюирующего буфера или растворителя (например, с ионной силой ниже второго элюирующего буфера на стадии (4)), такого как забуференный промывочный раствор, дополнительно содержащий соль, например, в концентрации 50-100 мМ, например 50 мМ NaCl;

(4) элюирование оставшихся полипептидов с колонки с применением второго элюирующего буфера или растворителя (например, с ионной силой выше первого элюирующего буфера на стадии (3)), такого как забуференный промывочный раствор, содержащий более высокую концентрацию соли, чем первый элюирующий буфер, например, в концентрации 500 мМ-2 М, например 1М NaCl;

(5) сбор элюата со стадии (4);

e) замену воды в элюате со стадии (5) на фармацевтически (или косметически) приемлемый буфер;

f) фильтрацию раствора, полученного на стадии (е) с применением фильтра с размером пор 0,15-0,30 мкм, предпочтительно с размером пор 0,22 мкм и сбор фильтрата; и

g) приготовление указанной фармацевтической или косметической композиции из фильтрата, полученного на стадии (f).

В настоящей заявке «жидкость, образующаяся при вылуплении» представляет собой жидкость, высвобождающуюся из икры в процессе вылупления, и она может быть в сырой, разбавленной или фильтрованной форме. Сырая жидкость, образующаяся при вылуплении, относится к неразбавленной, необработанной жидкости. Разбавленная жидкость, образующаяся при вылуплении, относится к жидкости, образующейся при вылуплении, которая может быть смешана с другой жидкостью во время или после вылупления, например, когда вылупление происходит в воде.

В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая или косметическая композиция, полученная или получаемая по способу, описанному в настоящей заявке.

Стадию обработки фильтрата посредством ионообменной хроматографии можно выполнять с применением любого подходящего способа, при котором получают фильтрат, в котором полипептиды композиции согласно изобретению (включая их части, как это определено ниже) обогащены по отношению к по меньшей мере одному из других полипептидов, присутствующих в экстракте жидкости, образующейся при вылуплении, до ее очистки (т.е. до ионообменной хроматографии). Например, ионообменная хроматография может привести к получению конечного элюата (т.е. элюата, полученного при помощи второго элюирующего буфера), в котором ферменты вылупления и полипептиды яйцевой оболочки в жидкости, образующейся при вылуплении, обогащены по меньшей мере на 5% по отношению к по меньшей мере одному из других полипептидов, присутствующих в жидкости, образующейся при вылуплении, предпочтительно ко всем другим полипептидам, присутствующим в экстракте жидкости, образующейся при вылуплении, до этой стадии очистки. Другие полипептиды могут быть определены как полипептиды, которые не входят в структурное и/или функциональное определение полипептида в композиции для применения в способах согласно изобретению (т.е. фермента вылупления или полипептида яйцевой оболочки или его части), как определено в настоящей заявке. Фармацевтическая или косметическая композиция согласно изобретению (т.е. полученная или получаемая по способу, описанному в настоящей заявке) не содержит лейколектиновые полипептиды, которые определены ниже. Предпочтительно, полипептиды обогащаются по меньшей мере на 10, 20, 30, 40 или 50% на данной стадии. Особенно предпочтительно полипептиды очищены до степени чистоты более 50 или 60%, например > 70, 80 или 90%, предпочтительно более 95 или 99% чистоты по отношению к по меньшей мере одному из других полипептидов, присутствующих в экстракте жидкости, образующейся при вылуплении, до очистки, например, лейколектину. Таким образом, элюат может содержать только следовые количества других полипептидов, таких как лейколектин, которые присутствуют в жидкости, образующейся при вылуплении, до ионообменной хроматографии, например, менее 0,1%, 0,01%, 0,001%, 0,0001% или 0,00001% мас/мас.

Ионообменная хроматография хорошо известна в данной области техники, и подходящие ионообменные колонки коммерчески доступны. В примере варианта реализации ионообменная колонка представляет собой ДЭАЭ (диэтиламиноэтилльную) колонку, т.е. колонку с инертной матрицей, такой как целлюлоза, силикагель, сефароза т.д., к которой присоединен ДЭАЭ. Тем не менее, другие ионообменные колонки могут быть пригодны для применения в описанном выше способе.

Стадия загрузки фильтрованной жидкости, образующейся при вылуплении, на ионообменную колонку включает нанесение жидкости, образующейся при вылуплении, на ионообменную колонку, которую подготовили или активировали таким образом, что она способна связывать полипептиды композиции согласно изобретению. Подготовка или активация ионообменной колонки обычно включает промывку колонки буфером, например, промывочным буфером, как определено ниже. Данная предварительная стадия промывки приводит ионообменную колонку к оптимальным условиям, например, pH, которые позволяют полипептидам связываться с колонкой. Таким образом, стадию загрузки можно рассматривать как стадию связывания полипептидов композиции согласно изобретению с ионообменной колонкой.

После стадии загрузки фильтрованной жидкости, образующейся при вылуплении, на ионообменную колонку, и в соответствии со стандартными протоколами колонку можно промывать подходящим буфером для удаления нежелательных компонентов, присутствующих в жидкости, образующейся при вылуплении, которые не связались с колонкой. Промывка включает нанесение объема промывочного буфера на колонку, обычно объем промывочного буфера, наносимый на колонку, по меньшей мере равен объему ионообменной колонки и может быть более, например, по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4 или 5-кратного объема колонки. В некоторых вариантах реализации стадия промывки может повторяться, например, 2, 3, 4, 5 или более раз. В способе согласно изобретению можно применять любой подходящий промывочный буфер. Подходящим промывочным буфером является буфер, который существенно не нарушает взаимодействие между целевыми полипептидами и ионообменной колонкой, например, менее 10%, например, менее 5, 4, 3, 2 или 1%, полипептидов композиции согласно изобретению удаляется из ионообменной колонки каждой стадии промывки. В предпочтительном варианте реализации промывочный буфер представляет собой раствор Трис-HCl в диапазоне 10-100 мМ, предпочтительно 10-50 мМ, например 20-30 мМ, с pH в диапазоне 6-10, предпочтительно 7-9, например 8,5. Промывную жидкость со стадии промывки можно собирать, например, для определения необходимости дальнейших стадий отмывки (например, для испытаний на наличие полипептидов, полисахаридов, солей и т.д., которые представляют нежелательные компоненты, присутствующие в жидкости, образующейся при вылуплении, до очистки), и/или для выброса.

Стадию элюирования лейколектиновых полипептидов из ионообменной колонки («первую» стадию элюирования) можно выполнять при помощи любых подходящих средств, и обычно она включает нанесение растворителя или раствора на колонку для разрушения взаимодействия по меньшей мере между лейколектиновыми полипептидами и ионообменной колонкой, т.е. первого элюирующего раствора (например, буфера) или растворителя. Однако первого элюирующего растворителя или раствора недостаточно для разрушения взаимодействия между целевыми полипептидами и ионообменной колонкой, например, менее 10%, например, менее 5, 4, 3, 2 или 1% в общей сложности полипептидов композиции согласно изобретению удаляется из ионообменной колонки на стадии элюирования для элюирования лейколектиновых полипептидов. Обычно объем первого элюирующего буфера или растворителя, наносимый на колонку, по меньшей мере равен объему ионообменной колонки и может быть более, например, по меньшей мере 1,5-, 2-, 3-, 4- или 5-кратного объема колонки. В некоторых вариантах реализации «первую» стадию элюирования (т.е. с применением первого элюирующего раствора или растворителя) можно повторять, например, 2, 3, 4, 5 или более раз. Элюат, содержащий лейколектиновые полипептиды (промывная жидкость из «первой» стадии элюирования), можно собирать на каждой стадии элюирования. Альтернативно или дополнительно, элюат, содержащий лейколектиновые полипептиды, отбрасывается. Подходящим первым элюирующим буфером или растворителем является такой, который нарушает взаимодействие между лейколектиновыми полипептидами и ионообменной колонкой, например, по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95 или 99% лейколектиновых полипептидов, связанных с колонкой, элюируется с колонки на каждой стадии элюирования.

В предпочтительном варианте реализации первый элюирующий буфер является таким же, как и промывочный буфер, также содержащий вещество, способное нарушать взаимодействие между лейколектиновыми полипептидами и ионообменной колонкой, например, соль для обеспечения низкой ионной силы (по отношению ко второму элюирующему буферу). Соль может присутствовать в диапазоне 10-500 мМ, предпочтительно 20-400 мМ, 30-300 мМ, 40-200 мМ или 50-100 мМ, например 50 мМ NaCl. Таким образом, в некоторых вариантах реализации элюирующий буфер представляет собой раствор Трис-HCl в диапазоне 10-100 мМ, предпочтительно 10-50 мМ, например, 20-30 мМ, с pH в диапазоне 6-10, предпочтительно 7-9, например 8,5 также, содержащий соль, например NaCl, KCl и т.д. в диапазоне, описанном выше.

Стадию элюирования полипептидов композиции согласно изобретению из ионообменной колонки («вторую» или «окончательную» стадию элюирования) можно выполнять при помощи любых подходящих средств, и обычно она включает нанесение растворителя или раствора на колонку для разрушения взаимодействия между целевыми полипептидами и ионообменной колонкой. Обычно объем элюирующего буфера или растворителя, наносимый на колонку, по меньшей мере равен объему ионообменной колонки и может быть более, например, по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4 или 5-кратного объема колонки. В некоторых вариантах реализации «вторую» стадию элюирования (т.е. стадию с использованием второго элюирующего раствора или растворителя) можно повторять, например, 2, 3, 4, 5 или более раз. Элюат можно собирать на каждой стадии элюирования, и один или более элюатов можно объединять перед стадией обмена воды в элюате. Подходящим элюирующим буфером или растворителем является такой, который нарушает взаимодействие между полипептидами композиции согласно изобретению и ионообменной колонкой, например, по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, полипептидов композиции согласно изобретению, связанных с колонкой, элюируется из колонки на каждой «второй» стадии элюирования.

В предпочтительном варианте реализации второй элюирующий буфер является таким же, как и промывочный буфер, также содержащий вещество, способное нарушать взаимодействие между целевыми полипептидами и ионообменной колонкой, например, соль для обеспечения более высокой ионной силы, чем у первого элюирующего буфера. Соль может присутствовать в диапазоне 500-2000 мМ, предпочтительно 600-1800 мМ, 700-1700 мМ, 800-1500 мМ или 900-1200 мМ, например примерно 1000 мМ NaCl. Таким образом, в некоторых вариантах реализации элюирующий буфер представляет собой раствор Трис-HCl в диапазоне 10-100 мМ, предпочтительно 10-50 мМ, например, 20-30 мМ, с pH в диапазоне 6-10, предпочтительно 7-9, например 8,5, также содержащий соль, например NaCl, KCl и т.д., в диапазоне, описанном выше.

Стадию замены воды в фильтрате можно выполнять с применением любого подходящего способа, известного в данной области техники, например, диафильтрации или диализа. В особенно предпочтительном варианте реализации эту стадию выполняют с применением диафильтрации с использованием фильтра с размером пропускания менее 12 кДа, предпочтительно 10 кДа или менее, например 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 кДа или менее.

При диафильтрации применяют ультрафильтрационные мембраны для удаления, например, солей или других ненужных или нежелательных микроскопических растворенных частиц (microsolutes) из раствора, или как способ замены растворителя, например, буфера, в растворе. Маленькие молекулы отделяются от раствора, в то время как более крупные молекулы удерживаются в ретентате (материале, который не проходит через фильтр). Микроскопические растворенные частицы и растворители, например, вода, в основном легко вымываются через мембрану. Обычно примерно 3 объема диафильтрационного растворителя (например, фосфатно-солевого буферного раствора) устраняют 95% микроскопических растворенных частиц. Таким образом, вышеуказанный фильтрат, т.е. элюат со стадии (5) первоначально обрабатывают путем диафильтрации, и это приводит к концентрации ретентата пропорционально раствору (который содержит растворимые примеси/ненужные фракции жидкости, образующейся при вылуплении), прошедшему через мембрану. Ретентат затем разбавляют фармацевтически приемлемым буфером, например, 0,5 мМ натрия фосфата и 1 мМ натрия хлорида, фосфатно-солевом буферным раствором и т.д. При необходимости разбавленный ретентат можно повторно подвергать циклам диафильтрации. Обычно перед стадией (f) ретентат разбавляют таким образом, что фильтрат со стадии (f) имеет ферментативную активность 25000-45000 мЕ/л, предпочтительно 25000-35000 мЕ/л и наиболее предпочтительно примерно 30000 мЕ/л. Ферментативную активность фильтрата можно измерять по способности фильтрата расщеплять хромогенный субстрат фактора Ха (CH₃OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA-AcOH, Sigma Aldrich, код продукта: F3301-25MG). До стадии диафильтрации жидкость, образующаяся при вылуплении, может иметь ферментативную активность в диапазоне от 90 до 1300000 мЕ/л. Одна единица (1 Е) может быть определена как количество фермента, необходимого, чтобы катализировать превращение 1 мкмоль субстрата в минуту.

Хромогенный субстрат фактора Ха (Sigma-Aldrich) расщепляется ферментом сериновой протеазой, присутствующей в жидкости, образующейся при вылуплении, с получением желтого продукта, который удобно анализировать с применением спектрофотометрического анализа при длине волны 405 нм. Типичный анализ включает добавление 100 мкл раствора жидкости, образующейся при вылуплении, полученной на стадии (d) или (е) вышеуказанного способа, к 600 мкл раствора субстрата, содержащего 10 мкл хромогенного субстрата фактора Ха (10 мг/мл в Milli Q или дистиллированной воде), 70 мкл 0,2 М Трис-HCl рН 8,5 и 520 мкл дистиллированной H₂O. Изменение оптической плотности можно удобно измерять в течение 5-20 мин (или до часа для образцов с низкой ферментативной активностью), обычно в течение 10 минут. Результат умножают на соответствующий коэффициент, например 10 (для 10 минутного анализа), для получения ферментативной активности на 1 мл образца. Другие подходящие и эквивалентные субстраты можно применять для определения активности жидкости, образующейся при вылуплении.

Как упоминалось выше, в некоторых вариантах реализации может быть предпочтительно синхронизировать стадию вылуплении яиц для максимизации полученного количества жидкости, образующейся при вылуплении, в частности, количества требуемых полипептидов или их частей в жидкости, образующейся при вылуплении, для очистки. Синхронизированное вылупление может быть достигнуто любым подходящим способом, известным в данной области техники. Например, некоторые яйца можно синхронизировать с помощью фото-манипуляции, например, при перемещении яиц со света (который ингибирует вылупление) в условия без освещения. Манипулирование температурой яиц, например, температурой раствора, в котором вылупляются яйца, удалением кислорода из среды вылупления, например удалением кислорода из раствора, в котором вылупляются яйца (Oppen-Berntsen et al. 1990, Aquaculture, 86, pp. 417-430), увеличение количества углекислого газа в среде вылупления и стимулирование яиц с использованием электричества также можно применять для того, чтобы вызвать синхронизированное вылупление. В некоторых вариантах реализации синхронизированное вылупление может быть достигнуто при помощи феромонов, например, пептидных феромонов, способных влиять на, т.е. стимулировать, развитие эмбриона и вылупление. Как отмечалось выше, икру можно суспендировать в минимальном объеме воды, который может быть эквивалентен объему икры или менее, например, на каждый 1 мл икры можно использовать ≤ 1, 0,75, 0,5, 0,25 мл суспендирующей жидкости, например, от 0,5 до 1 мл. В некоторых вариантах реализации может быть выгодно разбавлять жидкость, образующуюся при вылуплении, для облегчения последующих этапов очистки, например, для уменьшения вязкости жидкость, образующейся при вылуплении. Таким образом, способ может включать дополнительную стадию разбавления жидкости, образующейся при вылуплении. Предпочтительно фильтрат можно разбавлять с учетом коэффициента по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,5, 0,75, 1,0, 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 1000, 5000 или 10000.

В предпочтительных вариантах реализации синхронизированное быстрое вылупление икры таково, что вылупление завершается в течение менее 6 часов для более чем 80% эмбрионов. В особенно предпочтительных вариантах реализации, вылупление завершается в течение менее 5, 4, 3 или 2 часа, например, за 0,5-6 часов, 1-5 часов, 1,5-4 часа, 2-3 часов, например, за 1-2 часа. Кроме того, в некоторых вариантах реализации вылупление завершения в сроки, указанные выше, для более чем 85%, 90% или 95% эмбрионов, например, для более чем 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% эмбрионов.

Способ получения фармацевтической или косметической композиции, описанной выше, приводящий к получению обогащенного препарата, который предпочтительно по существу не содержит каких-либо загрязняющих компонентов, происходящих из исходного материала, или материалов, применяемых в процессе выделения, например, компонентов, кроме полипептидов или частей полипептидов, содержащихся в сырой жидкости, образующейся при вылуплении. Другие загрязняющие компоненты включают лейколектиновые полипептиды. В предпочтительном варианте реализации композиция может быть обогащена до степени чистоты более 30, 40, 50 или 60%, например, > 70, 80 или 90% чистоты в расчете мас /мас , (сухой вес) на целевые полипептиды и части полипептидов по сравнению с исходной жидкостью, образующейся при вылуплении, т.е. 90% чистоты относится к потере 90% от исходного материала (загрязняющих компонентов) в ходе процесса получения. Однако, можно применять композиции, которые имеют более низкую чистоту, например, сохраняют более 40, 50, 60, 70, 80 или 90% исходного материала. Тем не менее, даже композиции с низкой чистотой не содержат лейколектиновых пептидов, т.е. менее 0,0005% [мас ./мас ], предпочтительно менее 0,0001, 0,00005 или 0,00001% [мас ./мас ].

Хотя фильтрат со стадии (f) может сам по себе образовывать фармацевтическую или косметическую композицию, необязательно указанный продукт (фильтрат со стадии (f)), полученный или получаемый вышеуказанным способом, может быть разбавлен (или концентрирован) до соответствующей концентрации на стадии (g) для получения фармацевтической или косметической композиции и/или перед его использованием в способах и вариантах применения настоящего изобретения. Таким образом, способ может включать дополнительную стадию разбавления (или концентрирования) композиции. Предпочтительно фильтрат может быть разбавлен (или концентрирован) с учетом коэффициента по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 1000, 5000 или 10000. Особенно предпочтительно конечная композиция содержит 0,5-10%, например 0,5-5%, предпочтительно 0,5-3% (например, 1 или 3%) фильтрата со стадии (f). В особенно предпочтительном варианте реализации раствор со стадии (е) описанного выше способа, разбавляют или концентрируют для получения раствора с ферментативной активностью 10000-100000 мЕ/л при измерении при помощи описанного выше способа. Предпочтительно раствор, и поэтому фильтрат со стадии (f), обладает активностью 20000-90000, 25000-80000, 25000-60000, 25000-50000, 25000-45000 25000-35000 или мЕ/л. Наиболее предпочтительно раствор имеет активность примерно 30000 мЕ/л.

Необязательно, одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ и/или разбавителей могут быть добавлены к композиции, полученной или получаемой при помощи описанно