Способ получения молочной кислоты

Способ получения молочной кислоты

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения D-, L-, и DL-молочной кислоты, применяемой в пищевой промышленности в качестве стабилизатора pH и консерванта, в химической промышленности как сырье для получения полилактатов и других соединений, синтезируемых из молочной кислоты.

В настоящее время остро стоит вопрос производства биоразлагаемых упаковочных материалов, пластических масс, биоразлагаемых медицинских пластических материалов. Сырьем для этих производств служит молочная кислота, получаемая в результате сбраживания сахаров молочнокислыми микроорганизмами. От того, насколько быстро и экономично получение молочной кислоты, зависит рентабельность производства биоразлагаемых материалов.

Для того, чтобы обеспечить высокую скорость сбраживания сахаров и низкую себестоимость получаемой молочной кислоты, необходимо наличие возобновляемого дешевого источника сахаров и ростовых веществ и технологии культивирования молочнокислых микроорганизмов, при которой скорость образования молочной кислоты будет не ниже 25 г/л*час, а концентрация молочной кислоты в культуральной жидкости по окончании процесса не менее 100 г/л.

Известен способ получения молочной кислоты на основе микробиологического синтеза (патент РФ №2306340, 2005 г.), где в качестве источника углеводов используется смесь тростникового сахара-сырца, рафинадной патоки и свекловичной мелассы, в качестве ростового фактора солодовые ростки в количестве 12-15 г/л, обработанные водой, подкисленной молочной кислотой до pH 4,0-5,0 и ферментным препаратом ксилоглюканофоетидином в количестве, соответствующем 200-600 ед./л ксиланазной активности. Среда содержит мел в количестве 60% от общего количества, рассчитанного для нейтрализации молочной кислоты, дрожжевой экстракт и питательные соли. Сбраживание осуществляется молочнокислыми бактериями Lactobacillus delbrueckii штамм Л-3.

Недостатком данного способа является применение в качестве источника углеводов сахара-сырца и рафинадной патоки, а также использование мела для нейтрализации молочной кислоты (что после выделения молочной кислоты приводит к накапливанию в значительных количествах гипса CaSO₄), а также низкая скорость сбраживания и невысокая концентрация молочной кислоты в культуральной жидкости.

Известно много способов культивирования молочнокислых микроорганизмов с возвратом биомассы (рецикл) продуцента молочной кислоты в основной ферментер после отделения от культуральной жидкости, однако при простых рециклах концентрация биомассы молочнокислых микроорганизмов не превышает 20-30 г/л.

Известен способ получения молочной кислоты (патент US 6,475,759 В1) в длительном процессе культивирования с рециклом биомассы продуцента молочной кислоты. Молочную кислоту (не соль молочной кислоты) получают с использованием в качестве штаммов-продуцентов мутантов, толерантных к низким значениям pH. Культивирование осуществляется при pH 2,5-4,5. В качестве источника углеводов используется глюкоза.

К недостаткам данного способа получения молочной кислоты следует отнести высокую стоимость сырья (кристаллической глюкозы) и необходимость использования специализированного ферментера и оборудования по концентрированию молочной кислоты, выдерживающих в течение длительного времени низкие значения pH (гуммированные, эмалированные или фторопластовые покрытия внутренних поверхностей, контактирующих с низким pH).

Наиболее близким к предлагаемому способу является патент WO 2012/140223 А1 (РСТ), где в качестве продуцентов молочной кислоты используется широкий круг молочнокислых микроорганизмов, в качестве источника углеводов указаны зерновые культуры, картофель, маис, в качестве ростовых веществ используются дрожжевой экстракт, пептон. В процессе получения молочной кислоты используется плотная культура продуцента с высокой концентрацией биомассы. Каждые 18-45 минут происходит отъем 2/3 культуральной жидкости из основного ферментера, фильтрация культуральной жидкости мембранными методами (мембранный ферментер или выносная ячейка ультра- или нанофильтрации), возврат биомассы продуцента в основной ферментер со свежей порцией питательной среды. Для снижения роста культуры продуцента и направления биомассы на сбраживание сахаров, а не на рост клеток, в питательную среду и доливную среду вносят антибиотики.

Недостатком данного способа является отсутствие ферментативного гидролиза крахмалсодержащего сырья до глюкозы, т.к многие молочнокислые микроорганизмы не имеют активных экзогенных амилолитических ферментов. Применение для отделения от культуральной жидкости мембранных методов приводит к образованию большого количества стоков, т.к. клетки молочнокислых культур быстро забивают поры фильтрующего материала, скорость фильтрации падает. При мембранных методах отделения биомассы происходит травмирование и частичная гибель клеток культуры-продуцента за счет большой энергии сдвига. Внесение в питательную среду антибиотиков для снижения скорости роста молочнокислых микроорганизмов делает невозможным использование биомассы продуцента в дальнейшем в виде вторичного кормового продукта.

Задачей настоящего изобретения является биосинтез молочной кислоты с высокой скоростью сбраживания сахаров и накоплением высокой концентрации молочной кислоты в культуральной жидкости в виде соли, доступной для получения молочной кислоты без образования гипса, либо соли, обеспечивающей при дальнейшей обработке полимеризацию молочной кислоты, с возможностью использования биомассы продуцента молочной кислоты для получения вторичного продукта кормового назначения.

Поставленная задача достигается тем, что:

- ферментационную среду загружают в накопительный ферментер, объем которого в 5-10 раз превышает объем основного ферментера, стерилизуют при 120°C в течение 40 мин, охлаждают до температуры культивирования, вносят посевной материал в количестве 15-20% от объема ферментационной среды в накопительном ферментере, длительность накопительной ферментации - 12-24 часа, накопленную биомассу отделяют в центробежном поле при факторе разделения 2700-3000, ресуспендируют в доливной среде, переносят в основной ферментер, где культивируют в течение 2-3 часов с одновременной подачей дополнительной среды (подпитки), содержащей ферментолизат крахмалсодержащего сырья, полученный из крахмалсодержащего зернового сырья или отрубей влажным дроблением гидро-механо-акустическим способом по патенту №2586734 с выделением фракционированием крахмала А и В, с двухстадийным ферментативным гидролизом альфа-амилазами и глюко-амилазами полностью до глюкозы (далее ферментолизат крахмалсодержащего сырья, гидролизованного до глюкозы), имеющий следующие характеристики: СВ - не менее 44%, концентрация глюкозы - не менее 40%, с титрующими агентами для поддержания pH аммиачной водой в случае получения лактата аммония или раствора гидроксида натрия в случае получения лактата натрия, затем полностью сливают все содержимое ферментера и отделяют биомассу продуцента от культуральной жидкости в центробежном поле при факторе разделения 2700-3000, биомассу продуцента ресуспендируют со следующей порцией доливной среды и культивируют в очередном цикле, количество циклов в основной ферментации - 10-20 циклов, фугат после отделения биомассы продуцента используют для дальнейшей переработки в молочную кислоту или полилактаты; в качестве штамма-продуцента используют молочнокислые микроорганизмы, обладающие средней скоростью образования молочной кислоты не менее 5 г/л*час в периодическом процессе культивирования; ферментационная, доливная и дополнительная питательные среды содержат в качестве источника углеводов ферментолизат крахмалсодержащего сырья, полученный из крахмалсодержащего зернового сырья или отрубей влажным дроблением гидро-механо-акустическим способом с выделением фракционированием крахмала А и В, с двухстадийным ферментативным гидролизом альфа-амилазами и глюко-амилазами полностью до глюкозы, в количестве 4-12% в ферментационной среде, 2-8% в доливной среде и не менее 40% в дополнительной среде (подпитке) по глюкозе соответственно; после 10-20-го цикла во всех последующих циклах осуществляется промывка влажной биомассы молочнокислых микроорганизмов после отделения ее от культуральной жидкости стерильной водопроводной водой в соотношении 1:1 с количеством влажной биомассы, отделение биомассы продуцента от промывной воды в центробежном поле при факторе разделения 2700-3000, возврат биомассы продуцента для проведения последующих циклов ферментации и объединение фугата после промывки биомассы стерильной водопроводной водой с фугатом культуральной жидкости после отделения биомассы продуцента перед стадией выделения молочной кислоты.

Получение изомеров молочной кислоты зависит от свойств выбранного штамма-продуцента молочной кислоты, заложенных генетически. Штаммы-продуценты молочной кислоты, могут сбраживать сахара в рацематную смесь D-, L-молочной кислоты или сбраживать сахара преимущественно в D-молочную кислоту или L-молочную кислоту, тогда содержание преимущественного изомера составляет не менее 90%.

Сущность предлагаемого способа получения молочной кислоты заключается в следующем:

- культуру продуцента молочной кислоты с агаризованной питательной среды переносят в посевную питательную среду, содержащую в качестве источника углеводов ферментолизат крахмала, полученный из крахмалсодержащего зернового сырья или отрубей влажным дроблением гидро-механо-акустическим способом с выделением фракционированием крахмала А и В, отличающихся строением (амилопектин - крахмал А, и амилоза - крахмал В) и молекулярной массой, затем крахмал А и B в две стадии ферментативного гидролиза ферментами альфа-амилазами и глюко-амилазами полностью гидролизуют до глюкозы (далее ферментолизат крахмалсодержащего сырья, гидролизованного до глюкозы), полученный ферментолизат имеет следующие характеристики: СВ - не менее 44%, концентрация глюкозы - не менее 40%; в качестве ростовых веществ - дрожжевой экстракт или упаренный до содержания сухих веществ 50% ферментолизат зернового белка, получаемый ферментативным гидролизом протеазами зернового белка, полученного после отделения зерновых оболочек и крахмала А и В при глубокой переработке зернового сырья влажным дроблением гидро-механо-акустическим способом, содержащий не менее 50% зернового белка, из которых не менее 10% от общего количества белка составляют аминокислоты (далее ферментолизат зернового белка); соли калия, магния, марганца, аммония и культивируют в колбах на качалке при температуре, оптимальной для данного штамма-продуцента, и числе оборотов качалки, обеспечивающем микроаэробные условия культивирования в течение 20-24 часов;

- полученным посевным материалом в количестве 15-20% засевают накопительный ферментер с ферментационной средой, содержащей в качестве источника углеводов ферментолизат крахмалсодержащего сырья, гидролизованного до глюкозы, в качестве ростовых веществ - дрожжевой экстракт или ферментолизат зернового белка, соли калия, магния, марганца, аммония и культивируют в течение 12-24 часов для накопления биомассы молочнокислых микроорганизмов; объем накопительного ферментера должен быть в 5-10 раз больше, чем основного рабочего ферментера;

- полученную культуральную жидкость из накопительного ферментера обрабатывают в асептических условиях в центробежном поле при факторе разделения 2700-3000 и отделенную биомассу молочнокислых микроорганизмов переносят в рабочий ферментер меньшего объема таким образом, чтобы концентрация биомассы в рабочем ферментере составила не менее 50 г/л сухой биомассы (СБ), биомассу смешивают с доливной средой, содержащей в качестве источника углеводов ферментолизат крахмалсодержащего сырья, гидролизованного до глюкозы, в качестве ростовых веществ дрожжевой экстракт или ферментолизат зернового белка, соли калия, магния, марганца, аммония, культивируют в течение 2-3 часов в оптимальных для процесса сбраживания условиях (поддерживая необходимые pH, температуру, число оборотов мешалки), начиная внесение дополнительной питательной среды, состоящей из стерильного ферментолизата крахмалсодержащего сырья, гидролизованного до глюкозы, с содержанием РВ не менее 40% сразу после смешения биомассы и доливной среды, ферментолизат крахмалсодержащего сырья, гидролизованного до глюкозы задают в течение 1-2 часов цикла;

- после 2-3 часов культивирования в основном аппарате концентрация молочной кислоты в культуральной жидкости составляет не менее 120 г/л, а средняя скорость синтеза молочной кислоты - не менее 50 г/л*час;

- культуральную жидкость из основного ферментера сливают полностью и обрабатывают в асептических условиях в центробежном поле при факторе разделения 2700-3000, отделенную биомассу молочнокислых микроорганизмов возвращают в основной ферментер, где смешивают со следующей порцией доливной среды и повторяют 2-3 часовой цикл культивирования;

- количество циклов зависит от выбранного штамма - продуцента и составляет 10-20 циклов;

- фильтрат, содержащий соль молочной кислоты, поступает на стадию выделения молочной кислоты или на дальнейшую переработку в полилактат;

- для увеличения количества циклов, которые возможно провести с использованием одной порции биомассы после накопительного ферментера, после проведения 10-20 первых циклов культивирования биомассу продуцента молочной кислоты после каждого отделения смешивают в соотношении 1:1 со стерильной водопроводной водой для дополнительного удаления ингибирующих получение молочной кислоты продуктов метаболизма;

- после промывки биомассу продуцента отделяют в центробежном поле при факторе разделения 2700-3000, биомассу продуцента возвращают в основной ферментер для проведения следующего цикла ферментации;

- промывку (фугат после промывки биомассы) объединяют с фугатом культуральной жидкости, т.к. концентрация молочной кислоты в промывке - не менее 50 г/л, это увеличивает съем молочной кислоты за один цикл на 5-10%;

- по окончании культивирования (при снижении скорости образования молочной кислоты ниже 25 г/л*час) образовавшуюся биомассу продуцента молочной кислоты высушивают и получают вторичный продукт (пробиотик);

Сущность предлагаемой технологии раскрывается, но не исчерпывается в приведенных примерах.

По пункту 1.

Пример №1.

Культуру Lactobacillus plantarum В 1615 3П с агаризованной среды переносим в 3,2 л посевной среды следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы	15,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт	35,0
(NH4)2SO4	0,2
KH2PO4	0,15
MgSO4	0,1
MnSO4	0,1
Аммоний лимоннокислый	2,0
Натрий уксуснокислый	0,5
вода водопроводная	остальное
pH до стерилизации	6,8-7,1

Посевную среду с культурой разливают в асептических условиях в колбы вместимостью 250 мл по 50 мл и культивируют на качалке при температуре 30°C и числе оборотов качалки 300 об/мин в течение 24 часов.

Накопительный ферментер объемом 20 л с 11,0 л ферментационной накопительной среды без углеводной части среды стерилизуют в автоклаве при 0,8 ати в течение 1,5 часа, затем устанавливают на стойке, подключают к системам регулирования и выводят на режим: температура 30°C, pH 6,5, число оборотов мешалки 700 об/мин. Асептически вносят предварительно простерилизованный при 0,5 ати с выдержкой 30 мин 1,8 л ферментолизат крахмалсодержащего сырья, полностью гидролизованного до глюкозы с содержанием глюкозы 41,3%, 3,2 л посевного материала из колб и культивируют в течение 12 часов.

Состав ферментационной накопительной среды для накопительного ферментера, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы	40,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт	35,0
(NH4)2SO4	0,4
KH2PO4	0,3
MgSO4	0,2
MnSO4	0,2
Аммоний лимоннокислый	2,0
Натрий уксуснокислый	0,5
вода водопроводная	остальное

В процессе культивирования поддерживается pH 6,5 12,0%-ной аммиачной водой, температура культивирования 30°C, число оборотов мешалки 700 об/мин.

По окончании накопительной стадии культуральную жидкость в асептических условиях центрифугируют при факторе разделения 3000, супернатант с концентрацией соли молочной кислоты 38 г/л (в пересчете на молочную кислоту) направляют на дальнейшую переработку, а влажную биомассу ресуспендируют в ферментационной доливной среде следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы	80,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт	15,0
(NH4)2SO4	4.0
KH2PO4	1,5
MgSO4	1,0
MnSO4	1,0
Аммоний лимоннокислый	3,0
Натрий уксуснокислый	1,0
вода водопроводная	остальное

Ферментационная дополнительная питательная среда - ферментолизат крахмалсодержащего сырья, полностью гидролизованный до глюкозы, с содержанием РВ по глюкозе 52%.

Объем ферментационной доливной среды составляет 1,2 л, объем ферментационной доливной среды с биомассой составляет 1,5 л. Циклический процесс ведут в основном ферментере вместимостью 2 л при температуре 30°C, pH 6,5 поддерживают концентрированным раствором аммиака (25%), и скорости перемешивания 700 об/мин. Начальная концентрация биомассы - 67 г/л (СБ). Через 5 мин после вывода аппарата на режим включают подачу дополнительной ферментационной среды - ферментолизата крахмалсодержащего сырья, полностью гидролизованного до глюкозы, с постоянной скоростью 25 мл/час (концентрация глюкозы в ферментолизате крахмала - 52%). За полчаса до окончания (через 1,5 часа) цикла прекращают подачу дополнительной ферментационной среды. Через 2 часа ферментации культуральную жидкость сливают полностью, отделяют биомассу в центробежном поле при факторе разделения 3000, биомассу направляют для смешивания с ферментационной доливной средой и культивирования в следующем цикле; культуральная жидкость перед отделением биомассы содержит 120 г/л D-L соли молочной кислоты (при культивировании указанного штамма происходит образование рацематной смеси изомеров молочной кислоты), средняя скорость образования молочной кислоты - 60 г/л*час. Съем культуральной жидкости за 1 цикл составляет 1,8 л и 216 г аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

За 20 циклов съем культуральной жидкости составляет 36 л и 4320 г аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

Далее от культуральной жидкости в центробежном поле при факторе разделения 3000 отделяют биомассу молочнокислых бактерий и получают 13 кг влажной биомассы молочнокислых микроорганизмов с содержанием сухих веществ 18% и 23 л раствора лактата аммония с концентрацией лактата аммония 150,3 г/л. Из лактата аммония известным способом, например ионообменом, выделяют молочную кислоту.

Пример №2.

Культуру Lactobacillus plantarum В 1615 3П с агаризованной среды переносим в 0,8 л посевной среды следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы	15,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт	35,0
(NH4)2SO4	0,2
KH2PO4	0,15
MgSO4	0,1
MnSO4	0,1
Аммоний лимоннокислый	2,0
Натрий уксуснокислый	0,5
вода водопроводная	остальное
pH до стерилизации	6,8-7,1

Посевную среду с культурой разливают в асептических условиях в колбы вместимостью 250 мл по 50 мл и культивируют на качалке при температуре 30°C и числе оборотов качалки 300 об/мин в течение 24 часов.

Накопительный ферментер объемом 5 л с 2,75 л ферментационной накопительной среды без углеводной части среды стерилизуют в автоклаве при 0,8 ати в течение 1,5 часа, затем устанавливают на стойке, подключают к системам регулирования и выводят на режим: температура 30°C, pH 6,5, число оборотов мешалки 700 об/мин. Асептически вносят предварительно простерилизованный при 0,5 ати с выдержкой 30 мин 0,9 л ферментолизат крахмалсодержащего сырья, полностью гидролизованного до глюкозы, 0,8 л посевного материала из колб и культивируют в течение 24 часов.

Состав ферментационной накопительной среды для накопительного ферментера, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы	120,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт	35,0
(NH4)2SO4	0,8
KH2PO4	0,6
MgSO4	0,4
MnSO4	0,4
Аммоний лимоннокислый	4,0
Натрий уксуснокислый	1,5
вода водопроводная	остальное

В процессе культивирования поддерживается pH 6,5 12,0%-ной аммиачной водой, температура культивирования 30°C, число оборотов мешалки 700 об/мин.

По окончании накопительной стадии культуральную жидкость в асептических условиях центрифугируют при факторе разделения 2700, супернатант с концентрацией аммония молочнокислого 110 г/л (в пересчете на молочную кислоту) направляют на дальнейшую переработку, а влажную биомассу ресуспендируют в ферментационной доливной среде следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы	80,0 по глюкозе
дрожжевой экстракт	15,0
(NH4)2SO4	4,0
KH2PO4	1,5
MgSO4	1,0
MnSO4	1,0
Аммоний лимоннокислый	3,0
Натрий уксуснокислый	1,0
вода водопроводная	остальное

Ферментационная дополнительная среда - ферментолизат крахмалсодержащего сырья, гидролизованный до глюкозы, с содержанием РВ по глюкозе 52%.

Объем ферментационной доливной среды составляет 0,6 л, объем ферментационной доливной среды с биомассой составляет 0,75 л. Циклический процесс ведут в основном ферментере вместимостью 1 л при температуре 30°C, pH 6,5 поддерживают концентрированным раствором аммиака (25%), и скорости перемешивания 700 об/мин. Начальная концентрация биомассы - 85 г/л (СБ). Через 5 мин после вывода аппарата на режим включают подачу ферментационной дополнительной среды - ферментолизата крахмалсодержащего сырья, полностью гидролизованного до глюкозы, с постоянной скоростью 75 мл/час (концентрация глюкозы в ферментолизате крахмала - 52%). За полчаса до окончания (через 2,5 часа) цикла прекращают подачу ферментационной дополнительной среды. Через 3 часа ферментации культуральную жидкость сливают полностью, отделяют биомассу в центробежном поле при факторе разделения 2700, биомассу направляют для смешивания с ферментационной доливной средой и культивирования в следующем цикле; культуральная жидкость перед отделением биомассы содержит 198 г/л D-L соли молочной кислоты, средняя скорость образования молочной кислоты - 66 г/л*час. Съем культуральной жидкости за 1 цикл составляет 0,9 л и 178,2 г аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

За 10 циклов съем культуральной жидкости составляет 9 л и 1782 г аммония молочнокислого (по молочной кислоте).

Далее от культуральной жидкости в центробежном поле при факторе разделения 3000 отделяют биомассу молочнокислых бактерий и получают 4,25 кг влажной биомассы молочнокислых микроорганизмов с содержанием сухих веществ 18% и 4,75 л раствора лактата аммония с концентрацией лактата аммония 330,1 г/л. Из лактата аммония известным способом, например ионообменом, выделяют молочную кислоту.

Пример №3.

Культуру Lactobacillus plantarum В 1615 3П с агаризованной среды переносим в 3,2 л посевной среды следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы	15,0 по глюкозе
ферментолизат зернового белка (50% СВ)	25,0
(NH4)2SO4	0,2
KH2PO4	0,15
MgSO4	0,1
MnSO4	0,1
Аммоний лимоннокислый	2,0
Натрий уксуснокислый	0,5
вода водопроводная	остальное
pH до стерилизации	6,8-7,1

Посевную среду с культурой разливают в асептических условиях в колбы вместимостью 250 мл по 50 мл и культивируют на качалке при температуре 30°C и числе оборотов качалки 300 об/мин в течение 24 часов.

Накопительный ферментер объемом 20 л с 11,0 л ферментационной накопительной среды без углеводной части среды стерилизуют в автоклаве при 0,8 ати в течение 1,5 часа, затем устанавливают на стойке, подключают к системам регулирования и выводят на режим: температура 30°C, pH 6,5, число оборотов мешалки 700 об/мин. Асептически вносят предварительно простерилизованный при 0,5 ати с выдержкой 30 мин 1,8 л ферментолизат крахмала полностью гидролизованного до глюкозы, 3,2 л посевного материала из колб и культивируют в течение 12 часов.

Состав ферментационной накопительной среды для накопительного ферментера, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы	40,0 по глюкозе
ферментолизат зернового белка (50% СВ)	35,0
(NH4)2SO4	0,4
KH2PO4	0,3
MgSO4	0,2
MnSO4	0,2
Аммоний лимоннокислый	2,0
Натрий уксуснокислый	0,5
вода водопроводная	остальное

В процессе культивирования поддерживается pH 6,5 20% раствором гидроксида натрия, температура культивирования 30°C, число оборотов мешалки 700 об/мин.

По окончании накопительной стадии культуральную жидкость в асептических условиях центрифугируют при факторе разделения 3000, супернатант с концентрацией соли молочной кислоты 33 г/л (в пересчете на молочную кислоту) направляют на дальнейшую переработку, а влажную биомассу ресуспендируют в ферментационной доливной среде следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы	80,0 по глюкозе
ферментолизат зернового белка (50% СВ)	25,0
(NH4)2SO4	4.0
KH2PO4	1,5
MgSO4	1,0
MnSO4	1,0
Аммоний лимоннокислый	3,0
Натрий уксуснокислый	1,0
вода водопроводная	остальное

Ферментационная дополнительная питательная среда - ферментолизат крахмала, полностью гидролизованный до глюкозы, с содержанием РВ по глюкозе 52%.

Объем ферментационной доливной среды составляет 1,2 л, объем ферментационной доливной среды с биомассой составляет 1,5 л. Циклический процесс ведут в основном ферментере вместимостью 2 л при температуре 30°C, pH 6,5 поддерживают концентрированным раствором гидроксида натрия (40%), и скорости перемешивания 700 об/мин. Начальная концентрация биомассы - 67 г/л (СБ). Через 5 мин после вывода аппарата на режим включают подачу ферментационной дополнительной среды - ферментолизата крахмала, полностью гидролизованного до глюкозы, с постоянной скоростью 25 мл/час (концентрация глюкозы в ферментолизате крахмала - 52%). За полчаса до окончания (через 1,5 часа) цикла прекращают подачу ферментационной дополнительной среды. Через 2 часа ферментации культуральную жидкость сливают полностью, отделяют биомассу в центробежном поле при факторе разделения 3000, биомассу направляют для смешивания с ферментационной доливной средой и культивирования в следующем цикле; культуральная жидкость перед отделением биомассы содержит 120 г/л D-L соли молочной кислоты, средняя скорость образования молочной кислоты - 60 г/л*час. Съем культуральной жидкости за 1 цикл составляет 1,8 л и 216 г натрия молочнокислого (по молочной кислоте).

За 20 циклов съем культуральной жидкости составляет 36 л и 4320 г натрия молочнокислого (по молочной кислоте).

Далее от культуральной жидкости в центробежном поле при факторе разделения 3000 отделяют биомассу молочнокислых бактерий и получают 13,4 кг влажной биомассы молочнокислых микроорганизмов с содержанием сухих веществ 18% и 22,6 л раствора лактата натрия с концентрацией лактата натрия 152,9 г/л. Из лактата нватрия известным способом, например ионообменом, выделяют молочную кислоту.

Пример №4.

Культуру Lactobacillus plantarum В 1615 3П с агаризованной среды переносим в 10,8 л посевной среды следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы	15,0 по глюкозе
ферментолизат зернового белка (50% СВ)	25,0
(NH4)2SO4	0,2
KH2PO4	0,15
MgSO4	0,1
MnSO4	0,1
Аммоний лимоннокислый	2,0
Натрий уксуснокислый	0,5
вода водопроводная	остальное
pH до стерилизации	6,8-7,1

Посевную среду с культурой разливают в асептических условиях в колбы вместимостью 250 мл по 50 мл и культивируют на качалке при температуре 30°C и числе оборотов качалки 300 об/мин в течение 24 часов.

Накопительный ферментер объемом 5 л с 2,75 л ферментационной накопительной среды без углеводной части среды стерилизуют в автоклаве при 0,8 ати в течение 1,5 часа, затем устанавливают на стойке, подключают к системам регулирования и выводят на режим: температура 30°C, pH 6,5, число оборотов мешалки 700 об/мин. Асептически вносят предварительно простерилизованный при 0,5 ати с выдержкой 30 мин 0,45 л ферментолизат крахмала, гидролизованного полностью до глюкозы, 0,8 л посевного материала из колб и культивируют в течение 24 часов.

Состав ферментационной накопительной среды для накопительного ферментера, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы	120,0 по глюкозе
ферментолизат зернового белка (50% СВ)	35,0
(NH4)2SO4	0,8
KH2PO4	0,6
MgSO4	0,4
MnSO4	0,4
Аммоний лимоннокислый	4,0
Натрий уксуснокислый	1,5
вода водопроводная	остальное

В процессе культивирования поддерживается pH 6,5 20% раствором гидроксида натрия, температура культивирования 30°C, число оборотов мешалки 700 об/мин.

По окончании накопительной стадии культуральную жидкость в асептических условиях центрифугируют при факторе разделения 2700, супернатант с концентрацией натрия молочнокислого 106 г/л (в пересчете на молочную кислоту) направляют на дальнейшую переработку, а влажную биомассу ресуспендируют в ферментационной доливной среде следующего состава, г/л:

ферментолизат крахмалсодержащего сырья,
гидролизованный до глюкозы	20,0 по глюкозе
ферментолизат зернового белка (50% СВ)