Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих

Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Область биотехнологии, сфера питательных сред, суспензионного культивирования клеток почки сирийского хомячка (ВНК-21).

Уровень техники

Из литературных данных известны прописи питательных сред для суспензионного культивирования клеток:

- среда Купера (Методические рекомендации по работе с клеточными культурами и средами / Под ред. А.А.Сомниной. - Ленинград. - 1975. - С.38-40),

- специальная среда для культивирования клеток ВНК-21 (Голубев Д.Б., Сомнина А.А., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. - Л.: Медицина, 1976. С.19),

- среда Мак-Коя для суспензионного культивирования RPMI-1640 (Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / Под ред. проф. Дьяконова Л.П., проф. Ситькова В.И. - М.: Компания Спутник, 2000. С.53-55).

В состав перечисленных питательных сред входят: неорганические соли, аминокислоты, витамины, углеводы. Из указанных аналогов наиболее близким к заявляемому изобретению (прототипом) является среда RPMI-1640 (табл.1).

Состав и количество ингредиентов основных питательных сред, используемых для суспензионного культивирования перевиваемой линии клеток почки сирийского хомячка в сравнении с патентуемой питательной средой

Табл.1
Ингредиенты гр/л	Состав сред для суспензионного культивирования клеток
патентуемая среда	среда Купера	среда по Голубеву Д.Б.	RPMI-1640
1	2	3	4	5
Соли
Натрий хлористый - (NaCl)	8,0	5,48	6,4	6,0
Калий хлористый - (КСl)	0,4	0,5	0,4	0,4
Магний сернокислый -(MgSO4⋅7H2O)	0,2	-	0,2	0,1
Магний хлористый
(MgCl2⋅6H2O)	-	0,2	-	-
Натрий фосфорнокислый
двузамещенный -
(Na2HPO4⋅12H2O)	0,15	-	0,12	1,0
Калий фосфорнокислый
однозамещенный - (КН2РO4)	0,06	-	-	-
Кальций хлористый - (СаСl2)	0,14	0,2	0,2	-
Натрий двууглекислый -
(NаHCO3)	0,35	2,5	2,75	2,0
Нитрат железа
(Fe(NO3)3⋅7H2O)	-	-	0,0001	-
Хлорид аммония (NH4Cl)	-	0,05	-	-
Аминокислоты
1-аргинин НСl	-	0,25	-	-
1-аргинин	0,042	-	0,42	0,2
1-цистин	0,032	-	0,024	-
1-цистин 2НСl	-	-	-	0,065
1-глютамин	0,584	0,1	0,292	0,3
глицин	-	-	-	0,01
1-гистидин	-	-	0,016	-
1-изолейцин	-	-	0,052	0,05
1-лейцин	-	-	0,052	0,05
1-лизин НСl	-	-	0,074	0,04
1-метионин	-	0,1	0,015	0,015
1-фенилаланин	-	-	0,033	0,015
1-серин	-	-	-	0,03
1-треонин	-	-	0,048	0,02
1-тирозин	0,02	-	0,036	0,02
1-триптофан	0,015	-	0,008	0,005
1-валин	-	-	0,047	0,02
аспарагиновая кислота	-	-	-	0,02
глютаминовая кислота	-	063	-	0,02
1-гидроксипролин	-	-	-	0,02
1-пролин	-		-	0,02
1-аспарагин Н2O	-	-	-	0,0568
глютацин	-	-	-	0,001
Витамины
холин-хлорид	-	0,001	0,002	0,003
пантотенат кальция	(В3)	0,0034	0,001	0,002	0,00025
пиридоксаль⋅НСl	0,0034	-	0,002	-
пиридоксаль 5 фосфат	-	0,001	-
тиамин	(B1)	0,0034	0,001	0,002	0,001
мезо-инозит	0,0068	0,01	0,0036	0,035
никотинамид	(B5)	0,0034	0,001	-	0,001
рибофлавин	(B2)	0,00034	0,0001	0,0002	0,0002
фолиевая кислота	(В9)	0,0034	0,001	0,002	0,001
D-биотин	-	0,001	-	0,0002
дрожжевой экстракт Дифко	-	0,001	-	-
Витамин В	-	-	-	0,000005
Антибиотики
бензилпенициллина натриевая
соль (ед.)	1⋅105	-	-	-
канамицина сульфат (ед.)	1⋅105	-	-	-
амфотерицин (ед.)	2⋅103	-	-	-
глюкоза	3,6	6,0	4,5	2,2
гидролизат мышечных белков
ферментативный сухой
ТУ 46. 12.20-80	1,25	-	-	-
гидролизат лактальбумина
ферментативный
N L 0375 по кат.Sigma-
Aldridh Chemie CMBH	1,25	5,0	-	-
сыворотка кр. рог. скота	70,0	100,0	-	-
феноловый красный	-	0,01	0,015	0,053
дистиллированная вода	остальн.	остальн.	остальн.	остальн.

В представленной таблице к существенным отличительным признакам патентуемой питательной среды относится то, что среда дополнительно содержит гидролизат мышечных белков ферментативный сухой и гидролизат лактальбумина ферментативный и только пять аминокислот вместо 20 аминокислот в прототипе.

Раскрытие изобретения

(1) Сведения, раскрывающие сущность изобретения

(1.1) Сущность изобретения: подобран состав компонентов питательной среды, включающий: гидролизат мышечных белков ферментативный сухой и гидролизат лактальбумина ферментативный; аминокислоты - аргинин, глутамин, тирозин, триптофан и цистин, обеспечивающий накопление клеток при суспензионном культивировании перевиваемой линии ВНК-21 до 3,5⋅10⁶ кл./см³.

(1.2.) Техническим результатом заявляемого изобретения является создание экономически выгодной питательной среды для суспензионного культивирования клеток ВНК-21 в условиях массового биопроизводства при изготовлении культуральных вакцин.

Технический результат достигнут введением в состав питательной среды оптимального количественного соотношения компонентов, представленных в таблице 2.

Состав и количество ингредиентов питательной среды для суспензионного культивирования клеток почки сирийского хомячка (ВНК-21) (патентуемая)

Табл.2
N п/п	Наименование компонентов	Количество (гр/л)	Фирма, N серии
	Соли
1	Натрий хлористый - (NaCl)	8,0	Россия	1
2	Калий хлористый - (КСl)	0,4	-“-	23
3	Магний сернокислый -(MgSO4⋅7H2O)	0,2	-“-	9
4	Натрий фосфорнокислыйдвузамещенный -(Na2HPO4⋅12Н2О)	0,15	-“-	43
5	Калий фосфорнокислыйоднозамещенный - (КН2РO4)	0,06	-“-	8
6	Кальций хлористый - (СаСl2)	0,14
7	Натрий двууглекислый -(NaHCO3)	0,35	-“-	7
	Аминокислоты
8	1-аргинин	0,042	Sigma	102K0070
9	1-глютамин	0,584	-“-	42K0889
10	1-тирозин	0,02	-“-	78H06822
11	1-триптофан	0,015	-“-	77H13631
12	1-цистин	0,032	-“-	39H1091
	Витамины
13	пантотенат кальция (В3)	0,0034	-“-	57H11053
14	пиридоксаль⋅НСl	0,0034	-“-	22K16425
15	тиамин (B1)	0,0034	-“-	20K09406
16	мезо-инозит	0,0068	-“-	12K0110
17	никотинамид (B5)	0,0034	-“-	119H8057
18	рибофлавин (В2)	0,00034	-“-	97H0433
19	фолиевая кислота (В9)	0,0034	Индия
	Антибиотики
20	Бензилпенициллина натриеваясоль (ед)	1⋅105	Россия	318
21	Канамицина сульфат (ед.)	1⋅105	-“-	01-02
22	Амфотерицин (ед.)	2⋅103	-“-	140601
23	глюкоза	3,6	Франция
24	гидролизат мышечных белковферментативный сухойТУ 46. 12.20-80	1,25	ФГУП ЩБК	2-02
25	гидролизат лактальбуминаферментативный	1,25	Sigma 11K1259
26	сыворотка крупного рогатогоскота (мл)	70,0	ФГУП ЩБК 2-04
27	дистиллированная вода	остальное

Осуществление изобретения

Изобретение относится к композиции, в которую входят ингредиенты в соотношениях количества граммов на 1 литр дистиллированной воды, указанных в таблице 2.

Способ получения композиции следующий: навески отдельных компонентов берут, соблюдая правила взвешивания для весов соответствующего класса. Учитывая объем приготавливаемой смеси, допускается взвешивание солей, гидролизатов, глюкозы на весах 3-го класса; навески отдельных аминокислот, витаминов и антибиотиков - на аналитических весах 2-го класса с соблюдением точности до второго знака после запятой.

Процесс приготовления питательной среды заключается в приготовлении солевой основы среды, которой является раствор Хенкса, и растворении в нем антибиотиков, солей, глюкозы, гидролизата мышечных белков ферментативного сухого и гидролизата лактальбумина ферментативного по 1,25 г/л с конечной концентрацией суммы гидролизатов в питательной среде, равной 0,25%, пяти аминокислот, сыворотки, витаминов, бикарбоната натрия.

Растворение компонентов питательной среды ведут в дистиллированной воде, имеющей температуру 35-40°С, при непрерывном перемешивании. В начале растворяют антибиотики и навески солей поочередно NaCl, KCl, MgSO₄ 7H₂O, Na₂HPO₄ 12H₂O (развести в горячей воде), KH₂PO₄ до полного растворения предыдущей навески, вносят навеску глюкозы 3,6 гр/л среды. Дополнительно к механическому перемешиванию осуществляют перемешивание сжатым воздухом, т.е. барботированием в течение 10 минут. После растворения навесок убирают барботирование. В глюкозо-солевой раствор осторожно тонкой струйкой при механическом перемешивании вносят хлористый кальций (CaCl₂) в виде 40%-ного раствора и вновь барботируют. Из указанного в табл.2 количества гидролизата мышечных белков ферментативного сухого и гидролизата лактальбумина ферментативного готовят 10%-ный раствор и вносят его в полученный глюкозо-солевой раствор и растворяют в течение 10 минут перемешиванием и барботированием.

Отдельно растворяют аминокислоты. Растворение навесок проводят последовательно согласно прописи питательной среды в таблице 2. L-цистин и l-тирозин растворяют отдельно в небольшом количестве дистиллированной воды при нагревании до кипения с добавлением по каплям концентрированной соляной кислоты (d=1,19) до полного просветления раствора. Сначала растворяют l-цистин, затем l-тирозин. Если при внесении l-тирозина раствор помутнел, необходимо вновь вносить по каплям концентрированную НСl, до полного растворения навески. Вместо l-цистина можно использовать l-цистин НСl и растворять l-цистин НСl просто в кипящей воде.

Все витамины, кроме рибофлавина и фолиевой кислоты, последовательно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды комнатной температуры. При этом каждую последующую навеску растворяют только после полного растворения предыдущей. Рибофлавин и фолиевую кислоту растворяют отдельно в небольшом количестве дистиллированной воды комнатной температуры с добавлением по каплям 20%-ного раствора NaOH до полного растворения навесок. Сначала растворяют рибофлавин, затем фолиевую кислоту, при растворении которой необходимо вновь по каплям вносить 20%-ный р-р NaOH до полного просветления раствора.

В глюкозо-солевой раствор вносят растворы аминокислот, витаминов, сыворотку, натрий двууглекислый и перемешивают. После внесения в среду всех необходимых компонентов добавляют дистиллированную воду до необходимого объема, перемешивают, стерилизуют фильтрацией в реактор для культивирования клеток.

Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих, содержащая натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций хлористый, натрий двууглекислый, L-аргинин, L-глутамин, L-тирозин, L-триптофан, L-цистин, пантотенат кальция, пиридоксаль НСl, тиамин, мезо-инозит, никотинамид, рибофлавин, фолиевую кислоту, глюкозу, ферментативный гидролизат мышечных белков, ферментативный гидролизат лактальбумина, сыворотку крупного рогатого скота, амфотерицин, бензилпенициллина натриевую соль, канамицина сульфат и дистиллированную воду, при следующем содержании компонентов, г/л:

натрий хлористый	8,0
калий хлористый	0,4
магний сернокислый	0,2
натрий фосфорнокислый
двузамещенный	0,15
калий фосфорнокислый
однозамещенный	0,06
кальций хлористый	0,14
натрий двууглекислый	0,35
L-аргинин	0,042
L-глутамин	0,584
L-тирозин	0,02
L-триптофан	0,015
L-цистин	0,032
пантотенат кальция	0,0034
пиридоксаль НСl	0,0034
тиамин	0,0034
мезо-инозит	0,0068
никотинамид	0,0034
рибофлавин	0,00034
фолиевая кислота	0,0034
глюкоза	3,6
ферментативный гидролизат
мышечных белков	1,25
ферментативный
гидролизат лактальбумина	1,25
сыворотка крупного рогатого скота	70,0 мл
амфотерицин	2⋅103 ед.
бензилпеницилина
натриевая соль	1⋅105 ед.
канамицина сульфат	1⋅105 ед.
дистиллированная вода	остальное