Связывающие sdf-1 нуклеиновые кислоты и их применение

Связывающие sdf-1 нуклеиновые кислоты и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, связывающихся с CXC-хемокиновым происходящим из стромальных клеток фактором-1 (SDF-1), способам лечения заболеваний и их применению в производстве лекарственного средства.

Хемокины. Хемокины представляют собой семейство структурно родственных, связывающих гепарин основных низкомолекулярных белков с молекулярной массой 8-14 кДа. С функциональной точки зрения их можно классифицировать на провоспалительные, гомеостатические, либо двойного действия (Moser, Wolf et al. 2004). Воспалительные хемокины индуцируются патогенными факторами, цитокинами или факторами роста и рекрутируют эффекторные лейкоциты к очагам инфекции, воспаления, тканевым повреждениям и опухолям. Такие хемокины регулируют рекрутинг, активацию и пролиферацию белых кровяных клеток, также называемых лейкоцитами (Schall and Bacon 1994; Springer 1995; Baggiolini 1998). Хемокины селективно индуцируют хемотаксис нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, моноцитов, макрофагов, тучных клеток, T- и B-клеток. В дополнение к своему хемотаксическому эффекту они могут селективно вызывать другие эффекты у реактивных клеток, такие как изменения клеточной формы, временное увеличение концентрации свободных внутриклеточных ионов кальция, дегрануляция, активация интегринов, образование биологически активных липидов, таких как, помимо прочего, лейкотриены, простагландины, тромбоксаны, либо окислительный всплеск, то есть высвобождение реактивных форм кислорода для разрушения патогенных организмов или опухолевых клеток. Таким образом, провоцируя высвобождение дополнительных провоспалительных медиаторов, хемотаксис и проникновение лейкоцитов к очагам инфекции или воспаления, хемокины запускают усиление воспалительного ответа. Гомеостатические хемокины, с другой стороны, экспрессируются преимущественно в костном мозге и лимфоидных тканях, и вовлечены в гемопоэз, иммунологический надзор и адаптивные иммунные ответы (Godessart 2005).

Класс хемокинов. По взаимному расположению первых двух из четырех консервативных остатков цистеина хемокины подразделяют на четыре класса: CC или β-хемокины, у которых цистеины расположены один за другим; CXC или α-хемокины, где они разделены одним дополнительным аминокислотным остатком; XC или γ-хемокины, у которых есть лишь одна дисульфидная связь, причем лимфотактин, также именуемый XCL1, до настоящего времени является единственным представителем этого класса; и CX3C-хемокины, для которых характерны три аминокислотных остатка между цистеинами, при этом мембраносвязанный фракталкин является единственным представителем данного класса (Bazan, Bacon et al. 1997). Обычно хемокины имеют два названия: одно, которое присвоено на основании их функции, и другое, которое является систематическим названием согласно особенностям последовательности.

Хемокины класса CXC. Хемокины класса CXC действуют преимущественно на нейтрофилы, конкретнее, те хемокины класса CXC, которые несут аминокислотную последовательность ELR на своем аминоконце. Примерами хемокинов класса CXC, действующих на нейтрофилы, являются IL-8/CXCL8, GROα/CXCL1, GROβ/CXCL2, и GROγ/CXCL3, NAP-2/CXCL7, ENA-78/CXCL5, SDF-1/CXCL12 и GCP-2/CXCL6. Хемокины класса CXC действуют на более широкий ряд лейкоцитов, таких как моноциты, макрофаги, эозинофилы, базофилы, также как и T- и B-лимфоциты (Oppenheim, Zachariae et al. 1991; Miller and Krangel 1992; Baggiolini, Dewald et al. 1994; Jose, Griffiths-Johnson et al. 1994; Ponath, Qin et al. 1996). Их примерами являются I-309/CCL1; MCP-1/CCL2, MCP-2/CCL8, MCP-3/CCL7, MCP-4/CCL13, MIP-1α/CCL3 и MIP-1β/CCL4, RANTES/CCL5, а также эотаксин/CCL11.

Рецепторы хемокинов класса CXC. Хемокины действуют непосредственно через рецепторы, принадлежащие суперсемейству G-белок сопряженных рецепторов, семь раз пронизывающих мембрану, также обозначаемых GPCR (Murphy, Baggiolini et al. 2000). Вообще говоря, взаимодействия хемокина и хемокинового рецептора обычно бывают случайными в том смысле, что один хемокин может связывать несколько хемокиновых рецепторов, и, наоборот, один хемокиновый рецептор может взаимодействовать с несколькими различными хемокинами. Некоторые известные рецепторы хемокинов класса CXC включают CXCR1, который связывает GROα, GCP-2 и IL-8; CXCR2, который связывает хемокины, включающие GROα, GROβ, GROγ, ENA-78 и IL-8; CXCR3, который связывает хемокины, включающие PF4, MIG, IP-10 и I-TAC; CXCR4, который, как считается до сих пор, лишь генерирует сигнал в ответ на SDF-1, а также CXCR5, который, как показано, генерирует сигнал в ответ на BCA-1 (Godessart 2005). Кроме CXCR4, был идентифицирован новый рецептор SDF-1, названный RDC1/CXCR7 (Balabanian, Lagane et al. 2005, Burns, Summers et al. 2006).

SDF-1. Происходящий из стромальных клеток фактор-1 (сокр.: SDF-1; синонимы - CXCL12; PBSF [фактор, стимулирующий рост пре-В-клеток]; TPAR-1 [TPA-репрессированный ген 1]; SCYB12; TLSF [стимулирующий фактор клеток лимфомы тимуса]; hIRH [человеческий интеркрин, пониженный при гепатомах]) представляет собой ангиогенный хемокин класса CXC, который не содержит ELR-мотив, типичный для хемокинов, подобных IL-8 (Salcedo, Wasserman et al. 1999; Salcedo and Oppenheim 2003), но связывает и активирует G-белок сопряженный рецептор CXCR4. Данный хемокин независимо был открыт тремя группами, либо путем клонирования кДНК, несущих N-концевые сигнальные последовательности (Tashiro, Tada et al. 1993), благодаря своей способности стимулировать ранние предшественники B-клеток при экспрессии стромальными клетками линии PA6 (Nagasawa, Kikutani et al. 1994), либо путем выделения из библиотеки кДНК, созданной из фибробластов эмбриона мыши, обработанных тетрадодеканоилфорболацетатом (сокр.: TPA) – C-активатором протеинкиназы (Jiang, Zhou et al. 1994). В результате альтернативного сплайсинга существуют две формы SDF-1, - SDF-1α (68 аминокислотных остатков) и SDF-1β, который по сравнению с SDF-1α несет пять дополнительных остатков на C-конце (Shirozu, Nakano et al. 1995). Биологическое значение сплайсинга этих двух вариантов изучено не полностью.

Последовательности SDF-1. Весьма значительной является консервативность последовательностей SDF-1 из различных видов: SDF-1α человека (SEQ ID NO:1) и SDF-1α мыши (SEQ ID NO:2) фактически идентичны. Существует единственная консервативная замена V (валина) на I (изолейцин) в положении 18 (Shirozu, Nakano et al. 1995).

ЯМР-структура SDF-1. Существует модель ЯМР-структуры (выборка из базы данных PDB, 1SDF) для SDF-1 [8-68]. Было обнаружено, что SDF-1 представляет собой мономер с неупорядоченной N-концевой областью. Различия с другими хемокинами найдены главным образом в способе упаковки гидрофобного ядра (кора) и поверхностном распределении зарядов (Crump, Gong et al. 1997).

Физиологические активности SDF-1. Физиологические активности SDF-1: Поскольку CXCR4, рецептор SDF-1, широко экспрессируется на лейкоцитах, зрелых дендритных клетках, клетках эндотелия, клетках мозга и мегакариоцитах, активности SDF-1 являются плейотропными. Данный хемокин, к настоящему моменту идентифицированный лучше любого другого, проявляет самый широкий диапазон биологических функций, особенно вне иммунной системы. Самые существенные функциональные эффекты SDF-1 представляют собой:

«Хоминг» и прикрепление эпителиальных клеток к неоваскулярным участкам в сосудистой части оболочки сетчатки. Было показано, что SDF-1 вовлечен в «хоминг» эпителиальных клеток к сосудистой оболочке в процессе неоваскуляризации в ткани глаза. Точная роль этих клеток все еще исследуется, но опубликованная гипотеза такова, что эпителиальные клетки вовлечены в формирование аберрантных кровеносных сосудов (Sengupta, Caballero et al. 2005).

Стволовые клетки. SDF-1 необходим, чтобы поддерживать стволовые клетки и клетки-предшественники, например, гемопоэтические клетки-предшественники (обычно CD34+) в костном мозге взрослых людей. Для мобилизации клеток CD34+ при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток можно применять AMD3100, селективный антагонист CXCR4. Клетки CD34+ мигрируют in vitro и in vivo вдоль градиента SDF-1, продуцируемого стромальными клетками (Aiuti, Webb et al. 1997).

Развитие и хемотаксис B-клеток. SDF-1 поддерживает пролиферацию пре-В-клеток и увеличивает рост предшественников В-клеток костного мозга (Nagasawa, Kikutani et al. 1994); это индуцирует специфическую миграцию пре- и про-B-клеток, хотя и не действует как существенный хемоаттрактант для зрелых B-клеток (D'Apuzzo, Rolink et al. 1997; Bleul, Schultze et al. 1998). По-видимому, SDF-1 важен для позиционирования B-клеток во вторичной лимфоидной ткани.

Хемотаксис T-клеток. SDF-1 представляет собой один из наиболее эффективных хемоаттрактантов для T-клеток; CXCR4 представлен у многих субпопуляций T-клеток (Bleul, Farzan et al. 1996).

Эмбриональное развитие. SDF-1 и его рецептор, CXCR4, являются существенными для эмбрионального развития. Нокаутные по SDF-1 и CXCR4 мыши не выживают в перинатальный период; они имеют дефекты межжелудочковой перегородки сердца или неправильное развитие мозжечка в дополнение к сниженному количеству B-клеток и миелоидных предшественников (Nagasawa, Hirota et al. 1996; Ma, Jones et al. 1998; Zou, Kottmann et al. 1998). SDF-1 также необходим для нормальной онтогении гемопоэза в процессе эмбрионального развития (Juarez and Bendall 2004).

ВИЧ инфекция. SDF-1 способен ингибировать Т-лимфотропное попадание ВИЧ-1 в линии клеток, несущие CXCR4, а экспрессия SDF-1 может оказывать сильное влияние на патогенез СПИД, поскольку полиморфизм гена SDF-1 человека влияет на появление СПИД (Bleul, Farzan et al. 1996).

Другие заболевания. Считается, что измененные уровни экспрессии SDF-1 или его рецептора, CXCR4, либо измененные ответы на эти молекулы связаны со многими заболеваниями людей, такими как ретинопатия (Brooks, Caballero et al. 2004; Butler, Guthrie et al. 2005; Meleth, Agron et al. 2005); рак молочной железы (Muller, Homey et al. 2001; Cabioglu, Sahin et al. 2005), яичников (Scotton, Wilson et al. 2002), поджелудочной железы (Koshiba, Hosotani et al. 2000), щитовидной железы (Hwang, Chung et al. 2003) и носоглотки (Wang, Wu et al. 2005); глиома (Zhou, Larsen et al. 2002); нейробластома (Geminder, Sagi-Assif et al. 2001); В-клеточный хронический лимфолейкоз (Burger, Tsukada et al. 2000); гипогаммаглобулинемия (Gulino, Moratto et al. 2004; Balabanian, Lagane et al. 2005; Kawai, Choi et al. 2005); синдромы иммунологической недостаточности (Arya, Ginsberg et al. 1999; Marechal, Arenzana-Seisdedos et al. 1999; Soriano, Martinez et al. 2002); патологическая неоваскуляризация (Salvucci, Yao et al. 2002; Yamaguchi, Kusano et al. 2003; Grunewald, Avraham et al. 2006); воспаление (Murdoch 2000; Fedyk, Jones et al. 2001; Wang, Guan et al. 2001); рассеянный склероз (Krumbholz, Theil et al. 2006); ревматоидный артрит/остеоартрит (Buckley, Amft et al. 2000; Kanbe, Takagishi et al. 2002; Grassi, Cristino et al. 2004).

Антагонизм SDF-1 и его рецептора. В моделях на экспериментальных животных антагонисты SDF-1 или его рецептора доказали свою эффективность для блокировки роста и/или метастатического распространения человеческих раковых клеток различного происхождения, такого как поджелудочная железа (Guleng, Tateishi et al. 2005; Saur, Seidler et al. 2005), толстая кишка (Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et al. 2003; Guleng, Tateishi et al. 2005), молочная железа (Muller, Homey et al. 2001; Lapteva, Yang et al. 2005), легкие (Phillips, Burdick et al. 2003), глиобластома и медуллобластома (Rubin, Kung et al. 2003), предстательная железа (Sun, Schneider et al. 2005), остеосаркома (Perissinotto, Cavalloni et al. 2005), меланома (Takenaga, Tamamura et al. 2004), желудок (Yasumoto, Koizumi et al. 2006) и множественная миелома (Menu, Asosingh et al. 2006). Помимо этого, анти-SDF-1 терапия на животных моделях оказалась полезной в профилактике неоваскуляризации сетчатки глаза (Butler, Guthrie et al. 2005, Mames, Mattheus et al. 2006), нефрита (Balabanian, Couderc et al. 2003) и артрита (Matthys, Hatse et al. 2001; Tamamura, Fujisawa et al. 2004; De Klerck, Geboes et al. 2005). Кроме того, с целью мобилизации клеток CD34+ для трансплантации гемопоэтических стволовых клеток применяли AMD3100, селективный антагонист CXCR4. Клетки CD34+ мигрировали in vitro и in vivo вдоль градиента SDF-1, создаваемого стромальными клетками (Aiuti, Webb et al. 1997).

SDF-1 и глазные заболевания. SDF-1 является участником в патологии заболеваний задней части глаза, таких как диабетическая ретинопатия (сокр. DR) (Fong, Aiello et al. 2004) и возрастная макулярная дегенерация (сокр. AMD) (Ambati, Anand et al. 2003). Оба эти заболевания повреждают глаз и приводят к постепенной потере зрения, завершаясь слепотой. Повреждение происходит из-за несоответствующего роста кровеносных сосудов в задней части глаза - процесс, известный как хороидальная неоваскуляризация (сокр. CNV). Во время CNV новые кровеносные сосуды, происходящие из сосудистой оболочки, мигрируют через разрыв в оболочке Бруха в пигментный эпителий под сетчаткой (сокр. sub-RPE) или в пространство под сетчаткой. Аномальные сосуды могут кровоточить, что называют также интраретинальным кровоизлиянием, или приводить к подтеканию жидкости под сетчатку. Это может привести к шрамам и приподнять макулу, что искажает зрение.

Диабетическая ретинопатия. DR - главное следствие диабета, часто встречающееся у пациентов с диабетом как типа 1, так и типа 2. В США насчитывается приблизительно 16 миллионов диабетиков, и почти 8 миллионов из них имеют некоторую форму DR. Если пролиферативную диабетическую ретинопатию (сокр. PDR) оставить без лечения, приблизительно 60% пациентов становятся слепыми на один или оба глаза в течение 5 лет. С тревожным повышением распространенности диабета в Северной Америке, Европе и многих развивающихся странах быстро растет и популяция пациентов. Например, у пациентов с диабетом случаи слепоты встречаются в 25 раз чаще, чем среди всего населения. Кроме того, DR - наиболее частая причина слепоты у граждан средних лет, составляя, по меньшей мере, 12 процентов всех новых случаев в Соединенных Штатах ежегодно. Действуют программы массовых обследований для того, чтобы проверить зрение пациентов с диабетом, и своевременно предоставить необходимое доступное лечение.

Непосредственные причины DR плохо изучены, но предполагается, что заболевание возникает вследствие комбинации исходных причин: ослабленная саморегуляция притока крови к сетчатке глаза; накопление сорбита в клетках сетчатки и накопление конечных продуктов повышенного гликозилирования во внеклеточной жидкости. Все эти факторы прямо или косвенно связаны с гипергликемией - избытком сахара в кровотоке.

Симптомы DR и AMD похожи. Пациенты теряют клетки сетчатки, и происходят микроаневризмы, то есть кровоизлияния, в базальной мембране сетчатки. Кроме того, эндотелиальный фактор роста сосудов (сокр. VEGF), инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1) и другие факторы крови, возможно включающие SDF-1, привлекают новые васкулярные клетки и способствуют образованию повреждающих кровеносных сосудов.

Возрастная макулярная дегенерация. AMD разрушает центральное зрение человека. Ранние стадии заболевания могут быть даже незаметны, потому что симптомы среди пациентов различны. Иногда у пациента затронут только один глаз. Или зрение может быть ослаблено в обоих глазах, но незначительно. Данное заболевание вызывает искаженное или дефектное цветовосприятие. Часто отмечается наличие темного пятна в центре поля зрения.

Этиология (это означает «течение») заболевания плохо изучена. Часто полагают, что AMD представляет собой старение самого внешнего слоя сетчатки. Физические изменения происходят в центре сетчатки, также известном как макула, представляющем собой часть сетчатки, от которой зависит самое острое зрение.

Влажная форма AMD начинается как продолжение сухой формы заболевания. Приблизительно 90% пациентов страдают сухой формой AMD, которая приводит к истончению макулярных тканей и патологическим отклонениям в их пигментации. Для остальных характерна влажная форма, которая включает хороидальную неоваскуляризацию и часто - образование макулярного отека и кровоизлияние в сетчатке глаза или под сетчаткой глаза. Все это может привести к быстрому ухудшению остроты зрения.

Обычно самая распространенная причина слепоты у людей в возрасте старше 55 лет, влажная форма AMD, поражает приблизительно от 4% до 5% населения Соединенных Штатов в возрасте 65-74 лет, и почти 10% из тех, кто старше 75 лет. В одних только Соединенных Штатах уже насчитывается 5 миллионов человек старше 80 лет, пораженных этим заболеванием, и ожидается, что еще 5 миллионов человек заболеют до 2020 г.

Опухоли. Опухоли (включая солидные и гематологические новообразования и злокачественные опухоли) – это не только массы раковых клеток: инфильтрация опухолей иммунными клетками является особенностью рака. У многих человеческих раковых образований есть сложная сеть хемокинов, которая влияет на глубину и фенотип этого инфильтрата, так же как на рост опухоли, выживаемость, миграцию и ангиогенез. Большинство солидных опухолей содержит много доброкачественных стромальных клеток. Действительно, стромальные клетки иногда превосходят численностью раковые клетки. Преобладающие стромальные клетки, находящиеся в раковых образованиях, являются макрофагами, лимфоцитами, эндотелиальными клетками и фибробластами.

SDF-1 в опухолях. Клетки различных типов рака имеют различные профили экспрессии рецептора хемокина, но рецептор SDF-1, CXCR4, обычно встречается в опухолевых клетках мыши и человека: опухолевые клетки, по меньшей мере, из 23 различных типов человеческих раковых образований эпителиального, мезенхимного и гемопоэтического происхождения, экспрессируют CXCR4 (Balkwill 2004), при этом SDF-1 является единственным известным лигандом для CXCR4. Кроме костного мозга и вторичной лимфоидной ткани, где он экспрессируется конститутивно, SDF-1 обнаружен в участках локализации первичной опухоли в лимфоме (Corcione, Ottonello et al. 2000) и в опухолях головного мозга как нейронного, так и астроцитного происхождения. Кроме того, он присутствует в высоких уровнях при раке яичников (Scotton, Wilson et al. 2002) и раке поджелудочной железы (Koshiba, Hosotani et al. 2000), так же как и в местах метастазов в молочной железе (Muller, Homey et al. 2001), а также при раке щитовидной железы (Hwang, Chung et al. 2003), нейробластоме и гематологической злокачественной опухоли (Geminder, Sagi-Assif et al. 2001). Напротив, экспрессия CXCR4 является низкой или отсутствует в нормальной молочной железе (Muller, Homey et al. 2001), яичниках (Scotton, Wilson et al. 2002) и эпителии простаты (Sun, Schneider et al. 2005).

Кроме CXCR4, был идентифицирован новый рецептор SDF-1: RDC1/CXCR7 (Balabanian, Lagane et al. 2005, Burns, Summers et al. 2006). In vitro и in vivo исследования клеточных линий рака простаты показывают, что нарушения экспрессии CXCR7/RDC1 связаны с повышенными адгезивными и инвазивными активностями, вдобавок к выигрышу в выживаемости. Кроме того, было замечено, что уровни CXCR7/RDC1 регулируются посредством CXCR4 (Wang et al., 2008). In vitro и in vivo исследования показали, что оба рецептора SDF-1, а именно - CXCR4 и CXCR7, способствуют росту опухоли, метастатическому потенциалу и устойчивости к (вызванному химиотерапией) апоптозу в случаях многих опухолей, например, при раке молочной железы, глиобластомах, раке яичников, нейробластоме, раке легкого, раке ободочной и прямой кишки и раке простаты (Burns et al., 2006; Li et al., 2008; Scotton et al., 2002; Yang et al., 2008; Zagzag et al., 2008).

Таким образом, вероятно, экспрессия CXCR4 и CXCR7 является основной характеристикой некоторых опухолей.

Ингибирование хемокин-рецепторной передачи сигнала как терапевтическая возможность лечения рака. Ингибирование хемокин-рецепторной передачи сигнала в опухолевых клетках имеет потенциальные возможности вызывать задержку роста или апоптоз, и предотвращать инвазию и метастазирование in vivo, как показано следующими данными: нокдаун CXCR4 посредством миРНК уничтожал рост опухоли молочной железы (Lapteva, Yang et al. 2005); T-гибридомные клетки, трансфицированные конструкцией, предотвращающей экспрессию CXCR4 на поверхности, не могли далее метастазировать к отдаленным органам, будучи внутривенно введены мышам (Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et al. 2001); в похожих экспериментах с клетками рака ободочной и прямой кишки, метастазы в легких и печени значительно уменьшались (Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et al. 2003); анти-CXCR4 антитела ингибировали распространение ксенотрансплантатов рака молочной железы в лимфоузлы (Muller, Homey et al. 2001); обработка лимфобластных клеток анти-CXCR4 или анти-SDF-1 антителами задерживала рост опухоли у (NOD)/SCID мышей (Bertolini, Dell'Agnola et al. 2002); анти-SDF-1 антитела ингибировали развитие в органе метастазов клеток немелкоклеточного рака легких (сокр. NSCLC) (Phillips, Burdick et al. 2003); системное введение антагониста CXCR4, AMD3100 (при помощи AnorMED Inc.), ингибировало рост ксенотрансплантатов внутричерепной глиобластомы и медуллобластомы, а также повышенный апоптоз опухолевых клеток в течение 24 часов (Rubin, Kung et al. 2003); анти-SDF-1 антитела ингибировали рост MCF-7 клеток рака молочной железы с примесями связанных с карциномой фибробластов (Orimo, Gupta et al. 2005); нейтрализация CXCR4 антителами блокировала метастазирование рака предстательной железы и рост костных опухолей (Sun, Schneider et al. 2005); развитие метастазов в легких после инъекции клеток остеосаркомы было предупреждено введением T134 – пептидного антагониста CXCR4 (Perissinotto, Cavalloni et al. 2005).

Различные авторы приходят к выводу, что адресное воздействие на систему SDF-1/CXCR4 предоставляет раковым больным новые терапевтические возможности:

Человеческие опухоли яичников в значительной степени экспрессируют SDF-1 плюс, - на более низком уровне, - VEGF. Появление обоих белков вызвано гипоксией в опухоли. Патологические концентрации любого из этих белков в отдельности не были достаточны, чтобы вызвать ангиогенез in vivo, но SDF-1 и VEGF вместе, в патологических концентрациях, эффективно и синергистически вызывали неоваскуляризацию. Таким образом, нарушение синергии в этой системе, а не один лишь VEGF, является новой эффективной антиангиогенной стратегией лечения рака (Kryczek, Lange et al. 2005);

Клеточные линии рака молочной железы, наделенные аутокринным SDF-1/CXCR4-путем передачи сигнала, показывают агрессивное поведение. Это включает увеличение инвазивности и миграции, наряду с более быстрым ростом. Таким образом, система SDF-1/CXCR4 предоставляет важную информацию для прогнозирования агрессивности и устанавливает важные цели для терапии человеческого рака молочной железы (Kang, Watkins et al. 2005);

Миграция и метастазирование клеток мелкоклеточного рака легких (сокр. SCLC), – которые экспрессируют высокие уровни CXCR4, – регулируются с помощью SDF-1. Активация CXCR4 способствует адгезии к дополнительным клеткам (таким как стромальные клетки) и внеклеточным матричным молекулам в пределах микроокружения опухоли. Эти адгезионные взаимодействия приводят к повышенной резистентности клеток SCLC к химиотерапии. По этой причине ингибиторы системы SDF-1/CXCR4 также увеличивают чувствительность к химиотерапии клеток SCLC и приводят к новым направлениям в терапии пациентов с SCLC (Hartmann, Burger et al. 2004) и другими опухолями.

Хемокин-рецепторная передача сигнала и направленная миграция стволовых клеток. Система SDF-1/CXCR4 возникает как центральный регулятор направленной миграции различных типов стволовых клеток в организме. Поскольку большая часть, если не все, злокачественные новообразования берут начало в клеточных компартментах стволовых клеток/клеток-предшественников, раковые стволовые клетки также экспрессируют CXCR4 на своей поверхности и, в результате, заставляют систему SDF-1/CXCR4 участвовать в наведении их направленной миграции/метастазирования на органы, экспрессирующие SDF-1, например, такие как лимфоузлы, легкие, печень и кости. Вследствие этого у стратегий, нацеленных на модуляцию системы SDF-1/CXCR4, есть важные клинические применения как в восстановительной медицине, чтобы доставлять нормальные стволовые клетки к тканям, так и в клинической онкологии, чтобы ингибировать метастазирование раковых стволовых клеток (Kucia, Reca et al. 2005).

Мобилизация стволовых клеток. Лейкоциты, также известные как белые кровяные клетки, включают нейтрофилы, макрофаги, эозинофилы, базофилы/тучные клетки, B-клетки и T-клетки. Белые кровяные клетки непрерывно замещаются через систему гемопоэза, под действием колониестимулирующих факторов (CSF) и различных цитокинов на стволовые клетки и клетки-предшественники в гемопоэтических тканях. Наиболее широко известным из этих факторов является гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (сокр. G-CSF), который был одобрен для использования как средство нейтрализации отрицательного воздействия химиотерапии, стимулируя производство лейкоцитов и клеток-предшественников (мобилизацию стволовых клеток периферической крови). Существует целый ряд антигенов клеточной поверхности, которые используются как маркеры для характеристики популяций стволовых клеток и клеток-предшественников. Эти маркеры также подлежат уточнению всякий раз, когда обнаруживаются новые, более специфичные маркеры. Гемопоэтические стволовые клетки в настоящее время характеризуются как являющиеся CD34+, c-kit+, Sca-1+, CD45+, lin- и CD38- (CD38 является также маркером клеточной линии, поэтому он не имеет отношения к lin-). Костный мозг также является носителем для некоторых других типов стволовых клеток, которые не являются гемопоэтическими, но могут дать начало другим типам клеток и тканей. Мезенхимные стволовые клетки характеризуются как CD34+, Sca-1+, lin-, BMPR+ и/или STRO-1+, тканеспецифичные стволовые клетки костного мозга: в настоящее время определяются как являющиеся CXCR4+, CD34+, CD45–. Субпопуляции тканеспецифичных стволовых клеток костного мозга включают (Majka et al. 2005):

скелетные стволовые клетки: Myf5+, MyoD+

кардиальные стволовые клетки: NKx2.5+, GATA4+

печеночные стволовые клетки: CK19+, α-фетопротеин+

нейронные стволовые клетки: нестин+, GATA4+

Сообщалось, что некоторые другие факторы повышают содержание белых кровяных клеток и клеток-предшественников как у людей, так и у животных. Эти средства включают гранулоцит-макрофаговый колониестимулирующий фактор (сокр. GM-CSF), интерлейкин-1 (сокр. IL-1), интерлейкин-3 (сокр. IL-3), интерлейкин-8 (сокр. IL-8), PIXY-321 (сокр. GM-CSF/IL-3 химерный белок), воспалительный белок макрофага (сокр. MIP), GROβ (CXCL2) и GROβT (CXCL2Δ4), фактор стволовых клеток, тромбопоэтин и ростовой онкоген, в виде индивидуальных средств, либо в комбинации (Broxmeyer, Benninger et al. 1995; Glaspy, Даvis et al. 1996; Rosenfeld, Bolwell et al. 1996; Glaspy, Shpall et al. 1997; Vadhan-Raj, Murray et al. 1997; Broxmeyer, Orazi et al. 1998; Dаle, Liles et al. 1998; Pruijt, Willemze et al. 1999; King, Horowitz et al. 2001).

Хотя эндогенные факторы роста фармакологически эффективны, хорошо известные недостатки белков и пептидов, применяемых в качестве фармацевтических препаратов, подчеркивают необходимость добавления к набору таких факторов роста дополнительных средств, которые эффективны до той же степени, то есть которые повышают содержание, соответственно, клеток-предшественников лейкоцитов и стволовых клеток, предпочтительно - повышают их уровень в периферической крови субъекта. Соответственно, одна проблема, приоритетная для настоящей заявки, состоит в том, чтобы предоставить средства и способы, которые повышают содержание клеток-предшественников лейкоцитов и стволовых клеток, соответственно, более конкретно - повышают их уровень в периферической крови субъекта. Дальнейшая проблема, приоритетная для настоящей заявки, состоит в том, чтобы предоставить средства и способы лечения заболеваний, которые вызваны или связаны с низким уровнем клеток-предшественников лейкоцитов и стволовых клеток, соответственно.

Стволовые клетки либо мобилизировали, чтобы напрямую запустить репарацию поврежденных тканей у того же самого пациента, у которого они были мобилизированы, либо их мобилизировали и брали у донора, совместимого по человеческому лейкоцитарному антигену (HLA), и вводили пациенту либо внутривенно, либо непосредственно в пораженную ткань. Последнее может быть также проделано со стволовыми клетками, которые были мобилизированы у самого пациента. Перед введением стволовых клеток они могут быть размножены и/или дифференцированы in vitro.

Аллергические заболевания дыхательных путей и контактные аллергии. Было обнаружено, что SDF-1 действует как хемотаксическое средство на зрелые тучные клетки и их предшественников, – особенно когда гистамин высвобождается из зрелых тучных клеток, например, с помощью опосредованной IgE передачи сигнала посредством связывания с Fcε-рецептором на поверхности тучных клеток (Godot, Arock et al. 2007). При моделировании аллергии дыхательных путей на мышах опосредованная антителами нейтрализация CXCR4, экспрессируемого лейкоцитами, как указывалось выше, снижала гиперреактивность дыхательных путей. Антитела также наполовину снижали эозинофилию легких, особенно в бронхоальвеолярной промывной жидкости и интерстициальной ткани, указывая, что CXCR4-опосредованные сигналы способствуют воспалению легкого. Нейтрализация SDF-1α приводит к похожему ослаблению как аллергического воспаления легких, так и гиперреактивности дыхательных путей (Gonzalo, Lloyd et al. 2000). Есть также свидетельство, что SDF-1 способствует ангиогенезу. Это было явно показано Хошино и сотрудниками при астме, путем анализа бронхиальных биопсий на предмет ангиогенеза и экспрессии SDF-1. Иммуногистохимический анализ на срезах этих биопсий показал, что у субъектов больных астмой была более высокая степень васкуляризации и большее число SDF-1-положительных клеток по сравнению с контрольными субъектами (Hoshino, Aoike et al. 2003).

Кроме того, клинические и экспериментальные данные указывают, что инфильтрирующие кожу лейкоциты играют важную роль в инициировании и лечении атопического дерматита, и было показано, что SDF-1 представляет собой важный фактор рекрутинга T-лимфоцитов и дендритных клеток, особенно – клеток типа дендритных клеток Лангерганса (Gombert, Dieu-Nosjean et al. 2005).

Псориаз. Псориаз представляет собой воспалительное кожное заболевание с преимущественно аутоиммунным компонентом. Псориаз характеризуется сильной лейкоцитарной инфильтрацией пораженной кожи, при этом T-клетки играют заметную роль. Чжоу и сотрудники нашли среди прочего повышенную экспрессию мРНК SDF-1 в псориазных повреждениях кожи (Zhou, Krueger et al. 2003).

Воспаление суставов. В литературе есть свидетельство причастности системы SDF-1-CXCL4 к воспалению суставов. Маттис и сотр. показали, что AMD3100, сильный и специфичный антагонист CXCR4, ингибировал аутоиммунное воспаление суставов у мышей с врожденным отсутствием IFNγ-рецепторов (Matthys, Hatse et al. 2001). Экспрессию SDF-1 также наблюдали в синовиальных биопсиях и с помощью RT-PCR (полимеразной цепной реакции в реальном масштабе времени) у субъектов, страдающих спондилоартропатией, ревматоидным артритом, псориатическим артритом и дегенеративным заболеванием суставов (остеоартритом). Однако во всех случаях не наблюдали суперэкспрессии (Gu, Marker-Hermann et al. 2002). Сходные результаты были получены для CXCR4 с помощью RT-PCR.

Ревматоидный артрит. Совсем недавно было обнаружено, что уровни SDF-1 в синовиальной жидкости у пациентов с ревматоидным артритом были повышены по сравнению с пациентами с остеоартритом (Kim, Cho et al. 2007). Авторы также описали, что в клеточной культуре экспрессия SDF-1 у подобных фибробластам синовиоцитов была активирована совместным культивированием этих клеток с T-клетками. Этот эффект также наблюдался при добавлении IL-17, - T-клеточного цитокина, - к культуральной среде.

Иммуногистохимический анализ на срезах биопсий суставов показал, что SDF-1 экспрессируется в синовиальной оболочке суставов, затронутых псориатическим артритом. Быстрое и существенное клиническое улучшение наблюдалось после лечения инфликсимабом у всех 9 пациентов. Это сопровождалось снижением синовиальных уровней SDF-1 среди других факторов роста (биопсии были взяты после 8 недель терапии) (Gu, Marker-Hermann et al. 2002).

Хотя существуют описания того, что лейкоцитарная инфильтрация является характерной особенностью аллергических заболеваний, аллергических реакций и воспалительных процессов при аутоиммунных заболеваниях, пока не разработано никакого эффективного лечения таких заболеваний. На настоящий момент необходимы новейшие средства, влияющие на течение таких болезней и, предпочтительно, влияющие на лейкоцитарную инфильтрацию. Соответственно, дальнейшая проблема, приоритетная для настоящей заявки, состоит в том, чтобы предоставить средства и способы для ингибирования или сокращения лейкоцитарной инфильтрации в ткани. Дальнейшая проблема, приоритетная для настоящей заявки, состоит в том, чтобы предоставить средства и способы лечения заболеваний, которые вызваны или связаны с лейкоцитарной инфильтрацией в ткани или с повышенным уровнем инфильтрации таких лейкоцитов в ткани.

Передача сигнала в системе SDF-1 и его рецептора влияет на миграцию клеток внутри организма, предпочтительно, из одной ткани - в другую ткань, из ткани - в периферическую кровь и/или из периферической крови - в ткань, приводя к некоторым заболеваниям и нарушениям. Специфическое вмешательство, предпочтительно - ингибирование взаимодействия между SDF-1 и рецептором или рецепторами SDF-1, может вызвать улучшение течения некоторых заболеваний и нарушений. Ввиду вышеизложенного, еще одна дальнейшая, более общая проблема, приоритетная для настоящей заявки, состоит в том, чтобы предоставить средства и способы, влияющие на миграцию клеток внутри организма, предпочтительно из одной ткани в другую ткань, из ткани - в периферическую кровь и/или из периферической крови - в ткань, посредством чего такая миграция приводит к некоторым заболеваниям и нарушениям или связана с ними. На настоящий момент дальнейшая проблема, приоритетная для настоящей заявки, состоит в том, чтобы предоставить средства и способы, которые вызваны миграцией клеток внутри организма или связаны с ней, предпочтительно из одной ткани в другую ткань, из ткани - в периферическую кровь и/или из периферической крови - в ткань, приводя к некоторым заболеваниям и нарушениям.

Решение проблемы, приоритетной для настоящего изобретения, отражено в независимых пунктах формулы изобретения. Предпочтительные варианты осуществления могут быть взяты из зависимых пунктов формулы изобретения.

Конкретнее, проблема, приоритетная для настоящей заявки, решена в первом аспекте с помощью связывания молекулы нуклеиновой кислоты с SDF-1, где молекула нуклеиновой кислоты оказывает влияние на миграцию клеток.

В первом варианте осуществления первого аспекта клетки экспрессируют рецептор SDF, где рецептор SDF-1 является одним, предпочтительно выбранным из CXCR4 и CXCR7.

Во втором варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления первого варианта осуществления первого аспекта, миграция клеток включает мобилизацию клеток-предшественников, стволовых клеток, раковых клеток, долгоживущих плазмоцитов, B-клеток и/или T-клеток в периферическую кровь субъекта, где, предпочтительно, данные B-клетки и/или T-клетки являются В-клетками памяти и/или T-клетками памяти.

В третьем варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления второго варианта осуществления первого аспекта, клетки-предшественники и/или стволовые клетки включают CD34+ клетки-предшественники.

В четвертом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления второго и третьего вариантов осуществления первого аспекта, мобилизация клеток-предшественников и/или стволовых клеток происходит в гемопоэтической ткани.

В пятом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления четвертого варианта осуществления первого аспекта, данной гемопоэтической тканью является, по меньшей мере, одна либо миелоидная ткань, либо лимфоидная ткань, где, предпочтительно, данная миелоидная ткань расположена в костном мозге, и, предпочтительно, данная лимфоидная ткань расположена в слизистой оболочке пищеварительного тракта, дыхательном пути, лимфоузлах, селезенке, тимусе и/или лимфоидных фолликулах в воспаленной ткани.

В шестом варианте осуществления первого аспекта молекула нуклеиновой кислоты ингибирует миграцию лейкоцитов.

В седьмом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления шестого варианта осуществления первого аспекта, данные лейкоциты представляют собой T-лимфоциты, B-лимфоциты, моноциты, макрофаги, эозинофилы, нейтрофилы, базофилы, дендритные клетки и/или тучные клетки.

В восьмом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления шестого и седьмого вариантов осуществления первого аспекта, в процессе миграции лейкоцитов данные лейкоциты аккумулируются в ткани, где, предпочтительно, данная аккумуляция лейкоцитов приводит к воспалению указанной ткани.

В девятом варианте осуществления первого аспекта, который также является вариантом осуществления восьмого варианта осуществления первого аспекта, данная ткань включает кожу, слизистую оболочку, органы, выбираемые, не ограничиваясь только ими, из глаз, мозга, легких, почек, сердца, печени, желудочно-кишечного тракта, селезенки, костей и/или лимфатической системы, предпочтительно кожи и/или слизистой оболочки дыхательных путей.

В десятом